第十二章植物细胞大规模培养 教 学 内 容 1、植物细胞培养基 2、植物细胞培养方法 3、植物细胞的大规模培养技术 4、影响植物细胞培养的因素 5、植物细胞培养反应器
第十二章植物细胞大规模培养 教 学 内 容 1、植物细胞培养基 2、植物细胞培养方法 3、植物细胞的大规模培养技术 4、影响植物细胞培养的因素 5、植物细胞培养反应器
前 言 植物中含有数量极为可观的次代谢物质。据保守的估计，目前已发现的植物天 然代谢物已超过2万种，而且还在以每年新发现1600种的速度递增。我们祖先在与 疾病的抗争中已各积累了丰富的利用植物中的生物活性物质治病强身的经验。李时 珍（1953）编纂的巨著《本草纲目》中所开列的1892种药物绝大多数是植物。目前 仍约25%的法定药品来自植物。然而植物生长缦慢，自然灾害频繁。即使是大规模 人工栽培仍然不能从根本上满足人类对经济植物日益增长的需求。因此早在1956年， Routier和Nickell就提出工业化培养植物细胞以提取其天然产物的大胆设想。 第十二章 植物细胞的大规模培养 中草药
前 言 植物中含有数量极为可观的次代谢物质。据保守的估计，目前已发现的植物天 然代谢物已超过2万种，而且还在以每年新发现1600种的速度递增。我们祖先在与 疾病的抗争中已各积累了丰富的利用植物中的生物活性物质治病强身的经验。李时 珍（1953）编纂的巨著《本草纲目》中所开列的1892种药物绝大多数是植物。目前 仍约25%的法定药品来自植物。然而植物生长缦慢，自然灾害频繁。即使是大规模 人工栽培仍然不能从根本上满足人类对经济植物日益增长的需求。因此早在1956年， Routier和Nickell就提出工业化培养植物细胞以提取其天然产物的大胆设想。 第十二章 植物细胞的大规模培养 中草药
Reinhard等（1968）首先将这种设想转变成现实，生产出了哈尔碱(harmine)。 紧接着Kaul等（1969）、Furrya等(1972)和Teuscher等（1973）分别培养植物细胞 获取了其中的薯蓣(yu山药）皂苷、人参皂角苷和维斯纳精（visnagin）。现在一些 发达国家已集中相当数量的人力、财力潜心开拓这个经济潜力十分巨大的生产领域。 目前世界最大批量工业化培养细胞（烟草细胞）已达2万升（20吨）。我国在“八 五” 、 “九五”和“863计划”中连续拨款资助工业化培养红豆杉细胞生产抗肿瘤 药物紫杉醇的研究，目前已达到60mg/L的世界先进水平。 植物细胞培养是指在离体条件下将愈伤组织或其他易分散的组织置于液体培 养基中，将组织振荡分散成游离的悬浮细胞，通过继代培养使细胞增殖来获得大量 细胞群体的方法。 鉴于有些产物的唯一来源只能是植物，而许多有价值的植物只能生长在某一特 定的地理区域，且受到很多自然条件的限制和影响，尤其是有些植物从种植到收获 要花几年时间，很难满足需要。采用大规模植物细胞培养技术就可以直接生产这些 产物。如可作为药物和染料的紫草宁就是典型的通过大规模植物细胞培养生产的产 品，通过大规模培养紫草细胞短时间内就可大量生产紫草宁。表12-1是植物细胞培 养和从完整的植物生产紫草宁的比较
Reinhard等（1968）首先将这种设想转变成现实，生产出了哈尔碱(harmine)。 紧接着Kaul等（1969）、Furrya等(1972)和Teuscher等（1973）分别培养植物细胞 获取了其中的薯蓣(yu山药）皂苷、人参皂角苷和维斯纳精（visnagin）。现在一些 发达国家已集中相当数量的人力、财力潜心开拓这个经济潜力十分巨大的生产领域。 目前世界最大批量工业化培养细胞（烟草细胞）已达2万升（20吨）。我国在“八 五” 、 “九五”和“863计划”中连续拨款资助工业化培养红豆杉细胞生产抗肿瘤 药物紫杉醇的研究，目前已达到60mg/L的世界先进水平。 植物细胞培养是指在离体条件下将愈伤组织或其他易分散的组织置于液体培 养基中，将组织振荡分散成游离的悬浮细胞，通过继代培养使细胞增殖来获得大量 细胞群体的方法。 鉴于有些产物的唯一来源只能是植物，而许多有价值的植物只能生长在某一特 定的地理区域，且受到很多自然条件的限制和影响，尤其是有些植物从种植到收获 要花几年时间，很难满足需要。采用大规模植物细胞培养技术就可以直接生产这些 产物。如可作为药物和染料的紫草宁就是典型的通过大规模植物细胞培养生产的产 品，通过大规模培养紫草细胞短时间内就可大量生产紫草宁。表12-1是植物细胞培 养和从完整的植物生产紫草宁的比较
表12-1植物细胞培养和从完整的植物生产紫草宁的比较 生产方式 收获时间 紫草宁浓度（%干重） 完整植物 2-3a 1-2 植物细胞培养 21d 14 目前，植物细胞培养技术已在农业、医药、食品、化妆品、香料等领域广泛用 于大规模生产有价值的产品。小规模的细胞培养通常在培养瓶中完成，而大规模的 培养可在发酵罐中进行。 问题 请列举出3至5种由大规模培养植物细胞获得的有经剂价值的产物。 紫草宁 抗肿瘤药物紫杉醇 薯蓣皂苷、人参皂角苷和维斯纳 精（visnagin）
表12-1植物细胞培养和从完整的植物生产紫草宁的比较 生产方式 收获时间 紫草宁浓度（%干重） 完整植物 2-3a 1-2 植物细胞培养 21d 14 目前，植物细胞培养技术已在农业、医药、食品、化妆品、香料等领域广泛用 于大规模生产有价值的产品。小规模的细胞培养通常在培养瓶中完成，而大规模的 培养可在发酵罐中进行。 问题 请列举出3至5种由大规模培养植物细胞获得的有经剂价值的产物。 紫草宁 抗肿瘤药物紫杉醇 薯蓣皂苷、人参皂角苷和维斯纳 精（visnagin）
与动物细胞培养相比，植物细胞培养的最大优点是植物细胞可以在简单的合 成培养基上正常生长。用于植物细胞培养的基础培养基成分基本上与整个植物的 要求一样，但是用于培养细胞、组织和器官的培养基需要满足各自的特殊要求。 根据特定的植物种类和培养系统，培养基的基本营养成分可作适当的调整。 一、植物细胞培养基 植物细胞培养基通常包括无机盐、碳源、维生素、生长调节素和有机添加剂 等。 无机盐类 包括： 无机盐浓度一般为多少？ 微量元素主要包括碘、硼、锰、锌、钼、铜、钴、铁等。 碳源和能源 P225 维生素 植物细胞的生长都需要硫胺素。可在植物细胞培养基中加入烟 酸、吡哆醇、泛酸、生物素和叶酸等。原生质体培养通常需要大多数必需维生素。 1、植物细胞培养基的组成
与动物细胞培养相比，植物细胞培养的最大优点是植物细胞可以在简单的合 成培养基上正常生长。用于植物细胞培养的基础培养基成分基本上与整个植物的 要求一样，但是用于培养细胞、组织和器官的培养基需要满足各自的特殊要求。 根据特定的植物种类和培养系统，培养基的基本营养成分可作适当的调整。 一、植物细胞培养基 植物细胞培养基通常包括无机盐、碳源、维生素、生长调节素和有机添加剂 等。 无机盐类 包括： 无机盐浓度一般为多少？ 微量元素主要包括碘、硼、锰、锌、钼、铜、钴、铁等。 碳源和能源 P225 维生素 植物细胞的生长都需要硫胺素。可在植物细胞培养基中加入烟 酸、吡哆醇、泛酸、生物素和叶酸等。原生质体培养通常需要大多数必需维生素。 1、植物细胞培养基的组成
植物生长激素 大多数植物细胞培养基中都含有天然的或合成的植物生长激 素。生长激素包括了植物生长素、细胞激动素、赤霉素和脱落酸等四大类。 有机氮源 通常采用的有机氮源有蛋白质水解物、谷氨酰胺或氨基酸混 合物等。P225 有机酸 加入丙酮酸，或者柠檬酸、苹果酸和琥珀酸等三羟酸循环的中 间产物，能够保证植物细胞在以铵盐作为单一氮源的培养基上生长，并且使细胞 对钾盐的耐受能力至少提高到10mmol/l。除此之外，这些有机酸还能提高低密度 接种的细胞和原生质体的生长。 复合物质 在植物细胞的培养过程中，酶母抽提液、麦芽抽提液、椰子汁 和水果汁等复合物质通常可以作为细胞的生长剂。 目前应用最广的基础培养基主要有MS、B5、E1以及N6培养基。表12-2列出了 这几种常用的植物细胞培养基。 1、植物细胞培养基组成包括 等。 问题 2、植物生长素、细胞激动素、赤霉素对植物细胞培养上有何作用？
植物生长激素 大多数植物细胞培养基中都含有天然的或合成的植物生长激 素。生长激素包括了植物生长素、细胞激动素、赤霉素和脱落酸等四大类。 有机氮源 通常采用的有机氮源有蛋白质水解物、谷氨酰胺或氨基酸混 合物等。P225 有机酸 加入丙酮酸，或者柠檬酸、苹果酸和琥珀酸等三羟酸循环的中 间产物，能够保证植物细胞在以铵盐作为单一氮源的培养基上生长，并且使细胞 对钾盐的耐受能力至少提高到10mmol/l。除此之外，这些有机酸还能提高低密度 接种的细胞和原生质体的生长。 复合物质 在植物细胞的培养过程中，酶母抽提液、麦芽抽提液、椰子汁 和水果汁等复合物质通常可以作为细胞的生长剂。 目前应用最广的基础培养基主要有MS、B5、E1以及N6培养基。表12-2列出了 这几种常用的植物细胞培养基。 1、植物细胞培养基组成包括 等。 问题 2、植物生长素、细胞激动素、赤霉素对植物细胞培养上有何作用？
2、植物细胞培养基的制备 制备培养基时，培养基中使用无机盐、碳源、维生素、有机酸和植物生物激 素都应该采用最高纯度级的试剂和药品。有些生长激素在使用前需要进行重结晶 提纯。由于一些生长激素难溶于水，配制时可先溶于2-5ml的酒精中，其酒精-水 溶液要用吸附法进行脱色处理，然后慢慢加入蒸馏水，稍微加热后，再稀释至所 需体积。 配制培养基的用水应严格地采用蒸馏水或高纯度的去离子水，其中以玻璃器 皿制备的蒸馏水最好。培养基的PH值应用0.5m0l.l -1的HCL或0.2 m0l.l -1的NaOH进 行调节。当需要使用固体培养基时，须加入琼脂。 配制好的培养基按要求装入三角瓶或试管中，121下灭菌20min，待冷却后就 可以使用。对于一些热敏性化合物，如L-谷氨酰胺、植物生长激素等，灭菌时不 可采用加热法，而应该采用过滤法灭菌，然后无菌操作加入到已灭菌的培养基中。 植物细胞培养基的制备 是非常严格的 植物细胞培养基制备时对水有哪些 严格要求？ 问题
2、植物细胞培养基的制备 制备培养基时，培养基中使用无机盐、碳源、维生素、有机酸和植物生物激 素都应该采用最高纯度级的试剂和药品。有些生长激素在使用前需要进行重结晶 提纯。由于一些生长激素难溶于水，配制时可先溶于2-5ml的酒精中，其酒精-水 溶液要用吸附法进行脱色处理，然后慢慢加入蒸馏水，稍微加热后，再稀释至所 需体积。 配制培养基的用水应严格地采用蒸馏水或高纯度的去离子水，其中以玻璃器 皿制备的蒸馏水最好。培养基的PH值应用0.5m0l.l -1的HCL或0.2 m0l.l -1的NaOH进 行调节。当需要使用固体培养基时，须加入琼脂。 配制好的培养基按要求装入三角瓶或试管中，121下灭菌20min，待冷却后就 可以使用。对于一些热敏性化合物，如L-谷氨酰胺、植物生长激素等，灭菌时不 可采用加热法，而应该采用过滤法灭菌，然后无菌操作加入到已灭菌的培养基中。 植物细胞培养基的制备 是非常严格的 植物细胞培养基制备时对水有哪些 严格要求？ 问题
由于培养基中的组份种类繁多，且一些组份量很小，配制起来很繁锁，因此 往往把培养基配制成使用浓度的10或100倍的母液，使用时再按需要稀释至使用浓 度。培养基母液或经稀释后的培养基应置于冰箱内，在10度以下保存待用。一般 含有有机物或激素类物质的培养基母液或稀释液最好保存时间不超过十天。 在培养基配制过程中需要注意的是，为了防止在高浓度下，培养基份间相互作 用产生沉淀，诸如CaCL2、KI、EDTA的钠或亚铁盐需要单独配制保存，使用时再 稀释混合。 二、植物细胞培养方法 原生质体培养： 植物的体细胞（二倍体细胞）经过纤维素酶处理后可去掉细胞壁，获得的去壁 细胞称为原生质体。该原生质体在良好的无菌培养基中可以生长、分裂，最后可以 长成植株。实际过程中，可以用不同植物的原生质体进行融合与体细胞杂交，由此 可获得体细胞杂交的植株。 植物因受创伤而在伤口附近产生的薄壁组织 植物细胞培养方法主要有———————————————————————- -等。 单倍体细胞培养： 主要用花药在人工培养基上进行培养，可以从小孢子（雄性生殖细胞）直接发 育成胚状体，然后长成单倍体植株；或者是通过愈伤组织诱导分化出芽和根，最终 长成植株
由于培养基中的组份种类繁多，且一些组份量很小，配制起来很繁锁，因此 往往把培养基配制成使用浓度的10或100倍的母液，使用时再按需要稀释至使用浓 度。培养基母液或经稀释后的培养基应置于冰箱内，在10度以下保存待用。一般 含有有机物或激素类物质的培养基母液或稀释液最好保存时间不超过十天。 在培养基配制过程中需要注意的是，为了防止在高浓度下，培养基份间相互作 用产生沉淀，诸如CaCL2、KI、EDTA的钠或亚铁盐需要单独配制保存，使用时再 稀释混合。 二、植物细胞培养方法 原生质体培养： 植物的体细胞（二倍体细胞）经过纤维素酶处理后可去掉细胞壁，获得的去壁 细胞称为原生质体。该原生质体在良好的无菌培养基中可以生长、分裂，最后可以 长成植株。实际过程中，可以用不同植物的原生质体进行融合与体细胞杂交，由此 可获得体细胞杂交的植株。 植物因受创伤而在伤口附近产生的薄壁组织 植物细胞培养方法主要有———————————————————————- -等。 单倍体细胞培养： 主要用花药在人工培养基上进行培养，可以从小孢子（雄性生殖细胞）直接发 育成胚状体，然后长成单倍体植株；或者是通过愈伤组织诱导分化出芽和根，最终 长成植株
固体培养： 固体培养是在微生物培养的基础上发展起来的植物细胞培养方法。固体培养基的 凝固剂除特殊研究外，几乎都使用琼脂，浓度一般为6%-10%。接种材料放在培养基上， 原生质体固体培养则需混入培养基内进行嵌合培养，或者使原生质体在固体-液体之间 进行双相培养。 液体培养： 液体培养也是在微生物培养的基础上发展起来的植物细胞培养方法。液体培养可 分为静止培养和振荡培养等两类。静止培养不需要任何设备，适合于某些原生质体的 培养。振荡培养需要摇床或转床等设备使培养物和培养基保持充分混和以利于气体交 换。 悬浮培养：（主要） 植物细胞的悬浮培养是一种使组织培养物分离成单细胞并不断扩增的方法。在进行 细胞培养时，需要提供容易破裂的愈伤组织进行液体振荡培养，愈伤组织经过悬浮培 养可以产生比较纯一的单细胞。用于悬浮培养的愈伤组织应该是易碎的，这样在液体 培养条件下能获得分散的单细胞，而紧密不易碎的愈伤组织就不能达到上述目的。 固定化培养 主要 固定化培养是在微生物和酶的固定化培养基础上发展起来的植物细胞培养方法。该 法与固定化酶或微生物细胞类似，应用最广泛的、能够保持细胞活性的固定化方法是 将细胞包埋于海藻酸盐或卡拉胶中
固体培养： 固体培养是在微生物培养的基础上发展起来的植物细胞培养方法。固体培养基的 凝固剂除特殊研究外，几乎都使用琼脂，浓度一般为6%-10%。接种材料放在培养基上， 原生质体固体培养则需混入培养基内进行嵌合培养，或者使原生质体在固体-液体之间 进行双相培养。 液体培养： 液体培养也是在微生物培养的基础上发展起来的植物细胞培养方法。液体培养可 分为静止培养和振荡培养等两类。静止培养不需要任何设备，适合于某些原生质体的 培养。振荡培养需要摇床或转床等设备使培养物和培养基保持充分混和以利于气体交 换。 悬浮培养：（主要） 植物细胞的悬浮培养是一种使组织培养物分离成单细胞并不断扩增的方法。在进行 细胞培养时，需要提供容易破裂的愈伤组织进行液体振荡培养，愈伤组织经过悬浮培 养可以产生比较纯一的单细胞。用于悬浮培养的愈伤组织应该是易碎的，这样在液体 培养条件下能获得分散的单细胞，而紧密不易碎的愈伤组织就不能达到上述目的。 固定化培养 主要 固定化培养是在微生物和酶的固定化培养基础上发展起来的植物细胞培养方法。该 法与固定化酶或微生物细胞类似，应用最广泛的、能够保持细胞活性的固定化方法是 将细胞包埋于海藻酸盐或卡拉胶中
三、植物细胞的大规模培养技术 目前用于植物细胞大规模培养的技术主要有植物细胞的大规模悬浮培养和植 物细胞或原生质体的固定化培养。 1、植物细胞的大规模悬浮培养 前者适于大量快速地增殖细胞，但往往不利于次生物质的积累；后者则相反， 细胞生长缓慢而次生物质含量相对较高。 1953年Muir成功地对烟草和直立万寿菊的愈伤组织 进行了悬浮培养。继之Tulecke和Nickell（1959）推出 了一个20L的植物细胞封闭式悬浮培养系统。经蒸汽灭 菌后接入目的培养物，以无菌压缩空气进行搅拌。当 营养耗尽，细胞数目不再增加且次生物质达一定含量 时，收获细胞，提取产物。他们用此系统成功地培养 了银杏、冬青、黑麦草和蔷薇等细胞。结构简单，易 于操作是本系统的突出优点。但它的生产效率不够高， 次生物质累积的量也较少。 阅读课本P228-230 10分钟
三、植物细胞的大规模培养技术 目前用于植物细胞大规模培养的技术主要有植物细胞的大规模悬浮培养和植 物细胞或原生质体的固定化培养。 1、植物细胞的大规模悬浮培养 前者适于大量快速地增殖细胞，但往往不利于次生物质的积累；后者则相反， 细胞生长缓慢而次生物质含量相对较高。 1953年Muir成功地对烟草和直立万寿菊的愈伤组织 进行了悬浮培养。继之Tulecke和Nickell（1959）推出 了一个20L的植物细胞封闭式悬浮培养系统。经蒸汽灭 菌后接入目的培养物，以无菌压缩空气进行搅拌。当 营养耗尽，细胞数目不再增加且次生物质达一定含量 时，收获细胞，提取产物。他们用此系统成功地培养 了银杏、冬青、黑麦草和蔷薇等细胞。结构简单，易 于操作是本系统的突出优点。但它的生产效率不够高， 次生物质累积的量也较少。 阅读课本P228-230 10分钟