电泳技术
电泳技术
■1电泳:带电粒子在电场中向着与其本身电荷 相反的电极移动的过程。 ■2电泳技术优点:快速、准确、重现性好 3电泳方法分类 按电场分:常压(500V,适用小分子) 支持体分:自由电泳、区带电泳 仪器装置分:水平式、垂直式、悬架式 ■4电泳条件:水溶液(缓冲液)、支持物(区 带电泳)、电场(电泳仪、电泳槽)
◼ 1 电泳：带电粒子在电场中向着与其本身电荷 相反的电极移动的过程。 ◼ 2 电泳技术优点：快速、准确、重现性好 ◼ 3 电泳方法分类 按电场分：常压（500V，适用小分子） 支持体分：自由电泳、区带电泳 仪器装置分：水平式、垂直式、悬架式 ◼ 4 电泳条件：水溶液（缓冲液）、支持物（区 带电泳）、电场（电泳仪、电泳槽）
一电泳的基本原理 电泳分离 移动方向:带电性质决定 泳动度:带电颗粒在单位电场强度下的移动速 度 u-V/E=(d/t/V/=(di/t 影响μ的因素: 1颗粒本身:带电、大小、形状 2外界因素:电场强度E、pH、离子强度I、电 渗、缓冲液粘度及温度等
一 电泳的基本原理 ◼ 电泳分离： ◼ 移动方向：带电性质决定 ◼ 泳动度：带电颗粒在单位电场强度下的移动速 度。 μ ＝v/E=(d/t)/(V/l)=(dl)/Vt ◼ 影响μ的因素： ◼ 1颗粒本身：带电、大小、形状 ◼ 2 外界因素：电场强度E、pH、离子强度I、电 渗、缓冲液粘度及温度等
二纸电泳 以滤纸为支持体的电泳技术 操作要点: 1选择缓冲液 对显色剂和紫外光吸收等观察区带的方法无影 响 A分离蛋白质,pl≈5,选pH8.6的缓冲液 (巴比妥缓冲液pH8.6、硼酸pH8.6、磷酸 pH74) ■B分离氨基酸:邻苯二甲酸氢钠、磷酸醋 酸 pH5.9 ■C分离核苷酸巴比妥一醋酸pH2.5,柠檬酸 pH2~3 ■D分离糖类: HAC-NaAC,pH3-5
二 纸电泳 ◼ 以滤纸为支持体的电泳技术 ◼ 操作要点： ◼ 1 选择缓冲液 ◼ 对显色剂和紫外光吸收等观察区带的方法无影 响 ◼ A 分离蛋白质，pI≈ 5，选pH8.6的缓冲液 （巴比妥缓冲液pH8.6、硼酸pH8.6、磷酸 pH7.4) ◼ B 分离氨基酸：邻苯二甲酸氢钠、磷酸—醋 酸，pH5.9 ◼ C 分离核苷酸巴比妥－醋酸pH2.5，柠檬酸 pH2~3 ◼ D 分离糖类：HAC-NaAC, pH3~5
2滤纸的选择与处理 层析用滤纸,纸宽2~3cm/样品组分,长短影响电场 强度 ■3点样 点圆点(量少)、点条状(一般),点中间(未知样 )、点一边(已知样品) 干法、湿法 4电泳 电桥水平、加盖、电压稳定、注意时间 ■5显色及分析 蛋白:溴酚兰、氨黑10B、偶氮胭脂红B Aa:茚三酮、靛红 核酸:紫外光下观察 般洗脱定量
◼ 2 滤纸的选择与处理 ◼ 层析用滤纸，纸宽2～3cm/样品组分，长短影响电场 强度。 ◼ 3 点样 点圆点（量少）、点条状（一般），点中间（未知样 品）、点一边（已知样品） 干法、湿法 ◼ 4 电泳 电桥水平、加盖、电压稳定、注意时间 ◼ 5 显色及分析 蛋白：溴酚兰、氨黑10B、偶氮胭脂红B Aa：茚三酮、靛红 核酸：紫外光下观察 ◼ 一般洗脱定量
薄膜电泳 支持体:薄膜 优点:分辨力较高、简便、快速、区带清晰 易于定量、便于保存 广泛应用于蛋白质和同工酶等的分离分析 操作 1薄膜的处理与放置 2点样 平衡 3电泳:E10~25V/cm,0.5~2h 4显色
三 薄膜电泳 ◼ 支持体：薄膜 ◼ 优点：分辨力较高、简便、快速、区带清晰、 易于定量、便于保存 ◼ 广泛应用于蛋白质和同工酶等的分离分析 ◼ 操作 ◼ 1 薄膜的处理与放置 ◼ 2 点样 平衡 ◼ 3 电泳：E 10~25V/cm，0.5～2h ◼ 4 显色
四薄层电泳 将支持物与缓冲液调制成适当厚度的薄层进行 电泳。 常用支持物:淀粉、琼脂、纤维素粉、硅胶等 操作: 1缓冲液选择 离子强度较高的缓冲液 ■2支持物处理 精制品 ■3薄层板制作 4加样:挖沟、混合样品、填埋 ■5电泳 ■6分析:印染法
四 薄层电泳 ◼ 将支持物与缓冲液调制成适当厚度的薄层进行 电泳。 ◼ 常用支持物：淀粉、琼脂、纤维素粉、硅胶等 ◼ 操作： ◼ 1 缓冲液选择 ◼ 离子强度较高的缓冲液 ◼ 2 支持物处理 ◼ 精制品 ◼ 3 薄层板制作 ◼ 4加样：挖沟、混合样品、填埋 ◼ 5 电泳 ◼ 6分析：印染法
五凝胶电泳 支持物:多孔凝胶 聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶等 ■具有电泳和分子筛的双重作用,分辨力高 ■最常用聚丙烯酰胺凝胶,原因: 机械强度好,透明有弹性,稳定,无吸附作用 和电渗作用,可制成不同孔径的凝胶。 分类:垂直管型盘状电泳、垂直板型电泳; 连续、不连续、梯度、SDS凝胶电泳
五 凝胶电泳 ◼ 支持物：多孔凝胶 ◼ 聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶等 ◼ 具有电泳和分子筛的双重作用，分辨力高 ◼ 最常用聚丙烯酰胺凝胶，原因： ◼ 机械强度好，透明有弹性，稳定，无吸附作用 和电渗作用，可制成不同孔径的凝胶。 ◼ 分类：垂直管型盘状电泳、垂直板型电泳； ◼ 连续、不连续、梯度、SDS凝胶电泳
