弟七章线数不与叶绿环 MITOCHONGDRION AND CHLOROPAST
第一节线粒体 1890年R.Altaman首次发现线粒体，命名为bioblast,以为它可能是共生于细胞内独立 生活的细菌。 1898年Benda首次将这种颗命名为mitochondrion。 1900年L.Michaelis用Janus Green B对线粒体进行染色，发现线粒体具有氧化作用。 Green(1948)证实线粒体含所有三羧酸循环的酶，Kennedy和Lehninger(1949)发 现脂防酸氧化为CO2的过程是在线粒体内完成的，Hatefi等(1976)纯化了呼吸链四个独立 的复合体。Mitchell(1961-1980)提出了氧化磷酸化的化学偶联学说。 一、结构 (一)形态与分布 线粒体一般呈粒状或杆状，但因生物种类和生理状态而异，可呈环形，哑铃形、线状、 分杈状或其它形状。主要化学成分是蛋白质和脂类，其中蛋白质占线粒体干重的65-70%，脂 类占25-30%。 一般直径0.5~1μm,长1.5~3.0μm,在胰脏外分泌细胞中可长达10~20μm,称巨线粒 体。 数目一般数百到数千个，植物因有叶绿体的缘故，线粒体数目相对较少；肝细胞约1300 个线粒体，占细胞体积的20%；单细胞鞭毛藻仅1个，酵母细胞具有一个大型分支的线粒 体，巨大变形中达50万个；许多哺乳动物成熟的红细胞中无线粒体。 通常结合在维管上，分布在细胞功能旺盛的区域。如在肝细胞中呈均匀分布，在肾细胞 中靠近微血管，呈平行或栅状排列，肠表皮细胞中呈两极性分布，集中在顶端和基部，在精子 中分布在鞭毛中区。线粒体在细胞质中可以向功能旺盛的区域迁移，微管是其导轨，由马达蛋 白提供动力。 (二)超微结构 线粒体由内外两层膜封闭，包括外膜、内膜、膜间隙和基质四个功能区隔（图7-1、7 2)。在肝细胞线粒体中各功能区隔蛋白质的含量依次为：基质67%，内膜21%，外8%膜， 膜间隙4%
第一节 线粒体 1890 年 R. Altaman 首次发现线粒体，命名为 bioblast，以为它可能是共生于细胞内独立 生活的细菌。 1898 年 Benda 首次将这种颗命名为 mitochondrion。 1900 年 L. Michaelis 用 Janus Green B 对线粒体进行染色，发现线粒体具有氧化作用。 Green（1948）证实线粒体含所有三羧酸循环的酶，Kennedy 和 Lehninger（1949）发 现脂肪酸氧化为 CO2的过程是在线粒体内完成的，Hatefi 等（1976）纯化了呼吸链四个独立 的复合体。Mitchell（1961－1980）提出了氧化磷酸化的化学偶联学说。 一、结构 （一）形态与分布 线粒体一般呈粒状或杆状，但因生物种类和生理状态而异，可呈环形，哑铃形、线状、 分杈状或其它形状。主要化学成分是蛋白质和脂类，其中蛋白质占线粒体干重的 65-70%，脂 类占 25-30%。 一般直径 0.5~1μm，长 1.5~3.0μm，在胰脏外分泌细胞中可长达 10~20μm，称巨线粒 体。 数目一般数百到数千个，植物因有叶绿体的缘故，线粒体数目相对较少；肝细胞约 1300 个线粒体，占细胞体积的 20%；单细胞鞭毛藻仅 1 个，酵母细胞具有一个大型分支的线粒 体，巨大变形中达 50 万个；许多哺乳动物成熟的红细胞中无线粒体。 通常结合在维管上，分布在细胞功能旺盛的区域。如在肝细胞中呈均匀分布，在肾细胞 中靠近微血管，呈平行或栅状排列，肠表皮细胞中呈两极性分布，集中在顶端和基部，在精子 中分布在鞭毛中区。线粒体在细胞质中可以向功能旺盛的区域迁移，微管是其导轨，由马达蛋 白提供动力。 （二）超微结构 线粒体由内外两层膜封闭，包括外膜、内膜、膜间隙和基质四个功能区隔（图 7-1、7- 2）。在肝细胞线粒体中各功能区隔蛋白质的含量依次为：基质 67%，内膜 21%，外 8%膜， 膜间隙 4%
图7-1线粒体的TEM照片 Inermembrane space DNA F,particle Outer membrane Inner membrane Ribosome Cristae 图7-2线粒体结构模型 1、外膜(out membrane) 含40%的脂类和60%的蛋白质，具有孔蛋白(poin)构成的亲水通道，允许分子量为 5KD以下的分子通过，1KD以下的分子可自由通过。标志酶为单胺氧化酶。 2、内膜(inner membrane)
图 7-1 线粒体的 TEM 照片 图 7-2 线粒体结构模型 1、外膜 (out membrane) 含 40%的脂类和 60%的蛋白质，具有孔蛋白（porin）构成的亲水通道，允许分子量为 5KD 以下的分子通过，1KD 以下的分子可自由通过。标志酶为单胺氧化酶。 2、内膜 （inner membrane）
含100种以上的多肽，蛋白质和脂类的比例高于3：1。心磷脂含量高（达20%）、缺乏 胆固醇，类似于细菌。通透性很低，仅允许不带电荷的小分子物质通过，大分子和离子通过内 膜时需要特殊的转运系统。如：丙酮酸和焦磷酸是利用H梯度协同运输。 线粒体氧化磷酸化的电子传递链位于内膜，因此从能量转换角度来说，内膜起主要的作 用。内膜的标志酶为细胞色素C氧化酶。 内膜向线粒体基质褶入形成嵴(cristae),嵴能显著扩大内膜表面积（达5~10倍），嵴 有两种类型：①板层状（图7-1）、②管状（图7-3），但多呈板层状。 图7-3管状嵴线粒体 嵴上覆有基粒(elementary particle),基粒由头部(Fi偶联因子)和基部(Fo偶联因 子)构成，F0嵌入线粒体内膜。 3、膜间隙(intermembrane space) 是内外膜之间的腔隙，延伸至嵴的轴心部，腔隙宽约6-8m。由于外膜具有大量亲水孔 道与细胞质相通，因此膜间隙的pH值与细胞质的相似。标志酶为腺苷酸激酶。 4、基质(matri>ⅸ) 为内膜和嵴包围的空间。除糖酵解在细胞质中进行外，其他的生物氧化过程都在线粒体 中进行。催化三羧酸循环，脂防酸和丙酮酸氧化的酶类均位于基质中，其标志酶为苹果酸脱氢 酶。 基质具有一套完整的转录和翻译体系。包括线粒体DNA(mtDNA),70S型核糖体， tRNAs、rRNA、DNA聚合酶、氨基酸活化酶等。 基质中还含有纤维丝和电子密度很大的致密颗粒状物质，内含Ca2+、Mg2+、Z2*等离 子
含 100 种以上的多肽，蛋白质和脂类的比例高于 3:1。心磷脂含量高（达 20%）、缺乏 胆固醇，类似于细菌。通透性很低，仅允许不带电荷的小分子物质通过，大分子和离子通过内 膜时需要特殊的转运系统。如：丙酮酸和焦磷酸是利用 H+梯度协同运输。 线粒体氧化磷酸化的电子传递链位于内膜，因此从能量转换角度来说，内膜起主要的作 用。内膜的标志酶为细胞色素 C 氧化酶。 内膜向线粒体基质褶入形成嵴（cristae），嵴能显著扩大内膜表面积（达 5~10 倍），嵴 有两种类型：①板层状（图 7-1）、②管状（图 7-3），但多呈板层状。 图 7-3 管状嵴线粒体 嵴上覆有基粒（elementary particle），基粒由头部（F1偶联因子）和基部（F0偶联因 子）构成，F0嵌入线粒体内膜。 3、膜间隙(intermembrane space) 是内外膜之间的腔隙，延伸至嵴的轴心部，腔隙宽约 6-8nm。由于外膜具有大量亲水孔 道与细胞质相通，因此膜间隙的 pH 值与细胞质的相似。标志酶为腺苷酸激酶。 4、基质（matrix） 为内膜和嵴包围的空间。除糖酵解在细胞质中进行外，其他的生物氧化过程都在线粒体 中进行。催化三羧酸循环，脂肪酸和丙酮酸氧化的酶类均位于基质中，其标志酶为苹果酸脱氢 酶。 基质具有一套完整的转录和翻译体系。包括线粒体 DNA（mtDNA），70S 型核糖体， tRNAs 、rRNA、DNA 聚合酶、氨基酸活化酶等。 基质中还含有纤维丝和电子密度很大的致密颗粒状物质，内含 Ca2+、Mg2+、Zn2+等离 子
二、氧化磷酸化的分子基础 (一)电子载体 呼吸链电子载体主要有：黄素蛋白、细胞色素、铜原子、铁硫蛋白、辅酶Q等。 1.NAD 即烟酰胺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,图7-4)，是体内很多脱氢 酶的辅酶，连接三羧酸循环和呼吸链，其功能是将代谢过程中脱下来的氢交给黄素蛋白。 CONHz 0-CHz H OH NHz NH2 2H+2e OH OH 0R 图7-4NAD的结构和功能(NAD:R=H,NADP:R=-POsH2) 2.黄素蛋白：含FMN(图7-5)或FAD(图76)的蛋白质，每个FMN或FAD可接受2 个电子2个质子。呼吸链上具有FMN为辅基的NADH脱氢酶，以FAD为辅基的琥珀酸 脱氢酶。 CH(CHOH-CH2-0- CH-(CHOH)3一CH2-O -0H OH OH 2H+2e HaC HaC 图7-5FMN((flavin mononucleotide)的分子结构
二、氧化磷酸化的分子基础 （一）电子载体 呼吸链电子载体主要有：黄素蛋白、细胞色素、铜原子、铁硫蛋白、辅酶 Q 等。 1. NAD 即烟酰胺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，图 7-4），是体内很多脱氢 酶的辅酶，连接三羧酸循环和呼吸链，其功能是将代谢过程中脱下来的氢交给黄素蛋白。 图 7-4 NAD 的结构和功能（NAD＋：R＝H，NADP＋：R＝－PO3H2） 2. 黄素蛋白：含 FMN（图 7-5）或 FAD（图 7-6）的蛋白质，每个 FMN 或 FAD 可接受 2 个电子 2 个质子。呼吸链上具有 FMN 为辅基的 NADH 脱氢酶，以 FAD 为辅基的琥珀酸 脱氢酶。 图 7-5 FMN (flavin mononucleotide) 的分子结构
CH2(CHOH)3-CH2-0- H:C OH 0-月 图7-6FAD(flavin adenine dinucleotide)的分子结构 3.细胞色素：分子中含有血红素铁（图7-7），以共价形式与蛋白结合，通Fe3+、Fe2+形式 变化传递电子，呼吸链中有5类，即：细胞色素a、3、b、c、c1,其中a、a3含有铜原 子。 S-Cys HaC. CHCHa Cys-S HgCHC CH2CH2C00 HaC CH2CH2COo 图7-7血红素c的结构 4.三个铜原子：位于线粒体内膜的一个蛋白质上，形成类似于铁硫蛋白的结构，通过 Cu2+、Cu1+的变化传递电子。 5.铁硫蛋白：在其分子结构中每个铁原子和4个硫原子结合，通过Fe2+、Fe3+互变进行电 子传递，有2Fe-2S和4Fe-4S两种类型（图7-8）
图 7-6 FAD ( flavin adenine dinucleotide)的分子结构 3. 细胞色素：分子中含有血红素铁（图 7-7），以共价形式与蛋白结合，通 Fe3+、Fe2+形式 变化传递电子，呼吸链中有 5 类，即：细胞色素 a、a3、b、c、c1，其中 a、a3含有铜原 子。 图 7-7 血红素 c 的结构 4. 三个铜原子：位于线粒体内膜的一个蛋白质上，形成类似于铁硫蛋白的结构，通过 Cu2+、Cu1+的变化传递电子。 5. 铁硫蛋白：在其分子结构中每个铁原子和 4 个硫原子结合，通过 Fe2+、Fe3+互变进行电 子传递，有 2Fe-2S 和 4Fe-4S 两种类型（图 7-8）
(a) b】 Protein Protein 图7-8铁硫蛋白的结构（（引自Lodish等1999）) 6.辅酶Q:是脂溶性小分子量的醌类化合物，通过氧化和还原传递电子（图7-9）。有3种 氧化还原形式即氧化型醌Q,还原型氢醌(QH2)和介于两者之者的自由基半醌 (QH)。 CH3 CH3 CH-CH=C一CH2)-H 0- H3C-0 CH3 CH3 2H+2e H3C-0- CH-CH=C一CH)1一H 0+ OH 2H+e CH3 CH3 HaC O (CH2一CH=C-CH2o一H OH 图7-9辅酶Q (二)呼吸链的复合物 利用脱氧胆酸(deoxycholate,一种离子型去污剂)处理线粒体内膜、分离出呼吸链的4 种复合物，即复合物1、Ⅱ、川和V,辅酶Q和细胞色素C不属于任何一种复合物。辅酶Q 溶于内膜、细胞色素C位于线粒体内膜的C侧，属于膜的外周蛋白。 1、复合物1 即NADH脱氢酶，哺乳动物的复合物I由42条肽链组成，呈L型，含有一个FMN和至 少6个铁硫蛋白，分子量接近1MD,以二聚体形式存在，其作用是催化NADH的2个电子传
图 7-8 铁硫蛋白的结构（（引自 Lodish 等 1999）） 6. 辅酶 Q：是脂溶性小分子量的醌类化合物，通过氧化和还原传递电子（图 7-9）。有 3 种 氧化还原形式即氧化型醌 Q，还原型氢醌（QH2）和介于两者之者的自由基半醌 （QH）。 图 7-9 辅酶 Q （二）呼吸链的复合物 利用脱氧胆酸（deoxycholate，一种离子型去污剂）处理线粒体内膜、分离出呼吸链的 4 种复合物，即复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ，辅酶 Q 和细胞色素 C 不属于任何一种复合物。辅酶 Q 溶于内膜、细胞色素 C 位于线粒体内膜的 C 侧，属于膜的外周蛋白。 1、复合物Ⅰ 即 NADH 脱氢酶，哺乳动物的复合物Ⅰ由 42 条肽链组成，呈 L 型，含有一个 FMN 和至 少 6 个铁硫蛋白，分子量接近 1MD，以二聚体形式存在，其作用是催化 NADH 的 2 个电子传
递至辅酶Q,同时将4个质子由线粒体基质(M侧)转移至膜间隙(C侧)。电子传递的方向 为：NADH→FMN→Fe-S→Q,总的反应结果为： NADH 5H'M+Q-NAD++QH2+4H+c 2、复合物川 即琥珀酸脱氢酶，至少由4条肽链组成，含有一个FAD,2个铁硫蛋白，其作用是催化 电子从琥珀酸转至辅酶Q,但不转移质子。电子传递的方向为：琥珀酸→FAD→Fe-S→Q。反 应结果为： 琥珀酸+Q→延胡索酸+QH2 3、复合物Ⅲ 即细胞色素c还原酶，由至少11条不同肽链组成，以二聚体形式存在，每个单体包含两 个细胞色素b(b562、b566)、一个细胞色素c1和一个铁硫蛋白。其作用是催化电子从辅酶Q 传给细胞色素C,每转移一对电子，同时将4个质子由线粒体基质泵至膜间隙。总的反应结果 为： 2还原态Cytc1+QH2+2HtM→2氧化态Cytc1+Q+4H*c 复合物川的电子传递比较复杂，和“Q循环”有关（图7-10）。辅酶Q能在膜中自由护 散，在内膜C侧，还原型辅酶Q(氢醌)将一个电子交给Fe-S→细胞色素c1→细胞色素C, 被氧化为半醌，并将一个质子释放到膜间隙，半醌将电子交给细胞色素b566→b562,释放另 外一个质子到膜间隙。细胞色素b566得到的电子为循环电子，传递路线为：半醌 →b566→b562→辅酶Q。在内膜M侧，辅酶Q可被复合体I(复合体Ⅱ)或细胞色素b562 还原为氢醌。一对电子由辅酶Q到复合物川的电子传递过程中，共有四个质子被转移到膜间 隙，其中两个质子是辅酶Q转移的
递至辅酶 Q，同时将 4 个质子由线粒体基质（M 侧）转移至膜间隙（C 侧）。电子传递的方向 为：NADH→FMN→Fe-S→Q，总的反应结果为： NADH + 5H+M + Q→NAD+ + QH2 + 4H+C 2、复合物Ⅱ 即琥珀酸脱氢酶，至少由 4 条肽链组成，含有一个 FAD，2 个铁硫蛋白，其作用是催化 电子从琥珀酸转至辅酶 Q，但不转移质子。电子传递的方向为：琥珀酸→FAD→Fe-S→Q。反 应结果为： 琥珀酸+Q→延胡索酸+QH2 3、复合物Ⅲ 即细胞色素 c 还原酶，由至少 11 条不同肽链组成，以二聚体形式存在，每个单体包含两 个细胞色素 b（b562、b566）、一个细胞色素 c1和一个铁硫蛋白。其作用是催化电子从辅酶 Q 传给细胞色素 c，每转移一对电子，同时将 4 个质子由线粒体基质泵至膜间隙。总的反应结果 为： 2 还原态 cyt c1 + QH2 + 2 H+M→2 氧化态 cyt c1 + Q+ 4H+C 复合物Ⅲ的电子传递比较复杂，和“Q 循环”有关（图 7-10）。辅酶 Q 能在膜中自由扩 散，在内膜 C 侧，还原型辅酶 Q（氢醌） 将一个电子交给 Fe-S→细胞色素 c1→细胞色素 c， 被氧化为半醌，并将一个质子释放到膜间隙，半醌将电子交给细胞色素 b566→b562，释放另 外一个质子到膜间隙。细胞色素 b566 得到的电子为循环电子，传递路线为：半醌 →b566→b562→辅酶 Q。在内膜 M 侧，辅酶 Q 可被复合体Ⅰ（复合体Ⅱ）或细胞色素 b562 还原为氢醌。一对电子由辅酶 Q 到复合物Ⅲ的电子传递过程中，共有四个质子被转移到膜间 隙，其中两个质子是辅酶 Q 转移的
CoQH,-cytochrome c reductase complex NADH-CoQ H reductase 2a yt c Intermembrane complex space Fe-S 36 CoQH CoQH Matrix Coa binding site CoQ 2H 2H 图7-10Q循环示意图引自Lodish等1999 4、复合物V 即细胞色素C氧化酶，以二聚体形式存在，其作用是将从细胞色素C接受的电子传给 氧，每转移一对电子，在基质侧消耗2个质子，同时转移2个质子至膜间隙。每个单体由至少 13条不同的肽链组成，分为三个亚单位：亚单位I(subunit I):包含两个血红素(a1、as) 和一个铜离子(CuB),血红素a3和CuB形成双核的Fe-Cu中心。亚单位Ⅱ(subunitⅡ)，包 含两个铜离子(Cu)构成的双核中心，其结构与2Fe-2S相似。亚单位Ⅲ(subunitⅢI)的功能 尚不了解。电子传递的路线为：cytc→CuA-heme a-→a3-CuBO2,总的反应结果为： 4还原态Cytc+8HM+O2→4氧化态Cytc+4Hc+2H20 (三)两条主要的呼吸链 复合物I、Ⅲ、V组成主要的呼吸链，催化NADH的脱氢氧化，复合物Ⅱ、ⅢI、V组成 另一条呼吸链，催化琥珀酸的脱氢氧化（图7-11）。对应于每个复合物I,大约需要3个复 合物Ⅲ，7个复合物Ⅳ，任何两个复合物之间没有稳定的连接结构，而是由辅酶Q和细胞色素 c这样的可扩散性分子连接。 呼吸链各组分有序，使电子按氧化还原电位从低向高传递，能量逐级释放，呼吸链中的 复合物I、Ⅲ、IⅣ都是质子泵，可将质子有机质转移到膜间隙，形成质子动力势(proton- motive force),驱动ATP的合成，实验证明人为提高线粒体膜间隙的质子浓度，能使线粒体 合成ATP
图 7-10 Q 循环示意图 引自 Lodish 等 1999 4、复合物Ⅳ 即细胞色素 c 氧化酶，以二聚体形式存在，其作用是将从细胞色素 c 接受的电子传给 氧，每转移一对电子，在基质侧消耗 2 个质子，同时转移 2 个质子至膜间隙。每个单体由至少 13 条不同的肽链组成，分为三个亚单位：亚单位 I（subunit I）：包含两个血红素（a1、a3） 和一个铜离子(CuB)，血红素 a3和 CuB形成双核的 Fe-Cu 中心。亚单位Ⅱ（subunit Ⅱ），包 含两个铜离子(CuA)构成的双核中心，其结构与 2Fe-2S 相似。亚单位Ⅲ（subunit Ⅲ）的功能 尚不了解。电子传递的路线为：cyt c→CuA→heme a→a3- CuB→O2，总的反应结果为： 4 还原态 cyt c + 8 H+M + O2→4 氧化态 cyt c + 4H+C + 2H2O （三）两条主要的呼吸链 复合物Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ组成主要的呼吸链，催化 NADH 的脱氢氧化，复合物Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组成 另一条呼吸链，催化琥珀酸的脱氢氧化（图 7-11）。对应于每个复合物Ⅰ，大约需要 3 个复 合物Ⅲ，7 个复合物Ⅳ，任何两个复合物之间没有稳定的连接结构，而是由辅酶 Q 和细胞色素 c 这样的可扩散性分子连接。 呼吸链各组分有序，使电子按氧化还原电位从低向高传递，能量逐级释放，呼吸链中的 复合物Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ都是质子泵，可将质子有机质转移到膜间隙，形成质子动力势（protonmotive force），驱动 ATP 的合成，实验证明人为提高线粒体膜间隙的质子浓度，能使线粒体 合成 ATP
24 ComplexI Complexl 4H 2H 2H Intermembrane space C MN membrane Cyt Matrix -2H 4H NAD 2 NADH Complexlll 2O+2H'H,O ComplexN ComplexI 2H FAD Fumerate Complex国 Succinate hO3+20 2H 图7-11两条主要的呼吸链（引自Lodish等1999） 呼吸链组分及ATP酶在线粒体内膜上呈不对称分布，如细胞色素C位于线粒体内膜的C 侧（向细胞质的一侧），而ATP酶位于内膜的M侧（向线粒体基质的一侧）。 对于呼吸链组分在内膜上的分布主要依靠用亚线粒体颗粒和冰冻能刻电镜技术来研究。 将线粒体用超声波破碎，线粒体内膜碎片可形成颗粒朝外的小膜泡，称亚线粒体小泡或 亚线粒体颗粒，这种小泡具有正常的电子传递和磷酸化的功能。用细胞色素℃的抗体能够抑制 完整线粒体的氧化磷酸化，但不能抑制亚线粒体颗粒的氧化磷酸化，说明细胞色素℃位于线粒 体内膜的C侧。 三、氧化磷酸化的作用机理 (一)质子动力势 Mitchell P.1961提出“化学渗透假说(Chemiosmotic Hypothesis)”,70年代关于化学渗透 假说取得大量实验结果的支持，成为一种较为流行的假说，Mitchell本人也因此获得1978年 诺贝尔化学奖
图 7-11 两条主要的呼吸链（引自 Lodish 等 1999） 呼吸链组分及 ATP 酶在线粒体内膜上呈不对称分布，如细胞色素 C 位于线粒体内膜的 C 侧（向细胞质的一侧），而 ATP 酶位于内膜的 M 侧（向线粒体基质的一侧）。 对于呼吸链组分在内膜上的分布主要依靠用亚线粒体颗粒和冰冻能刻电镜技术来研究。 将线粒体用超声波破碎，线粒体内膜碎片可形成颗粒朝外的小膜泡，称亚线粒体小泡或 亚线粒体颗粒，这种小泡具有正常的电子传递和磷酸化的功能。用细胞色素 c 的抗体能够抑制 完整线粒体的氧化磷酸化，但不能抑制亚线粒体颗粒的氧化磷酸化，说明细胞色素 c 位于线粒 体内膜的 C 侧。 三、氧化磷酸化的作用机理 （一）质子动力势 Mitchell P.1961 提出“化学渗透假说(Chemiosmotic Hypothesis)”，70 年代关于化学渗透 假说取得大量实验结果的支持，成为一种较为流行的假说，Mitchell 本人也因此获得 1978 年 诺贝尔化学奖