第三章饲料卫生检验常用分析方法 对饲料中的有毒有害物质进行定性定量分析是饲料卫生检验的内容之一。由 于检验的目的、被检测物质的性质以及它们在饲料中的含量不同,所选用的方法 也各不相同。在饲料卫生检验中,应用最多的是薄层层析法、分光光度法、气相 色谱法、液相色谱法以及荧光分析法等 第一节饲料卫生检验常用分析方法 气相色谱法 气相色谱法( Gas chromatography,GC)是以气体作为流动相对混合组分进 行分离分析的一种色谱方法。 此法特别适用于分子量小于300,加热有一定挥发性物质的分析。目前,多 种真菌毒素、有机磷农药、有机氯农药的气相色谱分析已有报道 二、高效液相色谱法 高效液相色谱法( High Performance Liquid Chromatography,HPLC)是利用高 压输送的液体作为流动相的一种色谱方法。 高效液相色谱仪由于采用高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器,因而具有 髙压、高髙速、髙效和髙灵敏度等优点。HPLC是将样品制成溶液进样,不经过气 化,所以不受样品挥发性的约束。故尤其适用于一些挥发性低、热稳定性差、分 子量较大的高分子化合物及离子型化合物的分离分析。在饲料卫生检验中,此法 已用于苯并(a)芘、黄曲霉毒素、有机磷农药以及有机氯农药等分析。 三、薄层色谱法 薄层层析法( Thin Layer Chromatography,∏C)是将固定相均匀地涂布于玻 板上制成薄层,以液体作为流动相,对混合组分进行分离、定性、定量的一种方 法。薄层层析法是一种经典色谱方法,由于它具有不需要仼何仪器设备,操作简 第1页共17页
第 1 页 共 17页 - - 第三章 饲料卫生检验常用分析方法 对饲料中的有毒有害物质进行定性定量分析是饲料卫生检验的内容之一。由 于检验的目的、被检测物质的性质以及它们在饲料中的含量不同，所选用的方法 也各不相同。在饲料卫生检验中，应用最多的是薄层层析法、分光光度法、气相 色谱法、液相色谱法以及荧光分析法等。 第一节 饲料卫生检验常用分析方法 一、气相色谱法 气相色谱法（Gas chromatography，GC）是以气体作为流动相对混合组分进 行分离分析的一种色谱方法。 此法特别适用于分子量小于 300，加热有一定挥发性物质的分析。目前，多 种真菌毒素、有机磷农药、有机氯农药的气相色谱分析已有报道。 二、高效液相色谱法 高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography, HPLC）是利用高 压输送的液体作为流动相的一种色谱方法。 高效液相色谱仪由于采用高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，因而具有 高压、高速、高效和高灵敏度等优点。HPLC 是将样品制成溶液进样，不经过气 化，所以不受样品挥发性的约束。故尤其适用于一些挥发性低、热稳定性差、分 子量较大的高分子化合物及离子型化合物的分离分析。在饲料卫生检验中，此法 已用于苯并（a）芘、黄曲霉毒素、有机磷农药以及有机氯农药等分析。 三、薄层色谱法 薄层层析法（Thin Layer Chromatography, TLC）是将固定相均匀地涂布于玻 板上制成薄层，以液体作为流动相，对混合组分进行分离、定性、定量的一种方 法。薄层层析法是一种经典色谱方法，由于它具有不需要任何仪器设备，操作简
便、快速、灵敏度髙、分离效果好等优点,因而在饲料毒物分析中应用十分广泛 四、原子吸收分光光度法 原子吸收分光光度法( Atomic Absorptive Spectrometer, AAS)利用待测元素 的基态原子蒸汽对特定波长的谱线光有吸收作用,根据特征性谱线光被吸收的程 度来测定试样中待测元素含量的方法。 AAS是测定进素元素含量的重要手段之一。本法具有选择性好(通常情况下 共存元素不产生干扰,试样不需纯化)、灵敏度高(可达ppm,甚至ppb)、重现性 好、分析速度快等优点。因而被作为饲料卫生检验的标准方法之 缺点:对不同的分析项目,其测定条件不同,特别是要求具有不同的光源灯。 另外,仪器昂贵,因此,其应用面和程度受到限制。 五、紫外可见分光光度法 Visible and Ultraviolet Absorption Spectrum) 根据朗—一比耳定律,当一束平行的单色光通过某一种均匀透明的稀溶液 时,溶液的吸光度(或称光密度)等于吸光系数乘以溶液的厚度乘以溶液的浓度, 即A=K×C×L,K表示某种物质溶液对某特定波长光的吸收能力,与溶液的浓度 及厚度无关。紫外一可见光光度仪即根据这一原理,用棱镜或光栅将光源的光线 分成单色光,用一定厚度的液槽(或称比色杯,常是0.5cm、lcm、2cm、5cm), 通过比较待测液与标准溶液的吸光度,求出待测溶液的浓度 紫外光源用于测定具有共轭双键结构的无色物质;可见光源用于测定一般 的有色物质。 本法灵敏度高,操作简便,快速,廉价,因而在饲料卫生检验上应用很广。 近年来又出现了双波长分光光度法( Dualwavelength Spectrophotometry)。 这是一种新技术,不用参比液,而是选用两种不同的波长,A1与A2的光束通过 一个样品,测定在这两种波长下的吸收度差值其中λ1下的吸收度为参比吸收度, λ2下的吸收度为测量吸收度。此法最突出的优越性是不仅对吸收光谱互相重叠的 第2页共17页
第 2 页 共 17页 - - 便、快速、灵敏度高、分离效果好等优点，因而在饲料毒物分析中应用十分广泛。 四、原子吸收分光光度法 原子吸收分光光度法（Atomic Absorptive Spectrometer,AAS）利用待测元素 的基态原子蒸汽对特定波长的谱线光有吸收作用，根据特征性谱线光被吸收的程 度来测定试样中待测元素含量的方法。 AAS 是测定进素元素含量的重要手段之一。本法具有选择性好（通常情况下 共存元素不产生干扰，试样不需纯化）、灵敏度高（可达 ppm,甚至 ppb）、重现性 好、分析速度快等优点。因而被作为饲料卫生检验的标准方法之一。 缺点：对不同的分析项目，其测定条件不同，特别是要求具有不同的光源灯。 另外，仪器昂贵，因此，其应用面和程度受到限制。 五、紫外—可见分光光度法 （Visible and Ultraviolet Absorption Spectrum） 根据朗——比耳定律，当一束平行的单色光通过某一种均匀透明的稀溶液 时，溶液的吸光度（或称光密度）等于吸光系数乘以溶液的厚度乘以溶液的浓度， 即 A=K×C×L，K 表示某种物质溶液对某特定波长光的吸收能力,与溶液的浓度 及厚度无关。紫外—可见光光度仪即根据这一原理，用棱镜或光栅将光源的光线 分成单色光，用一定厚度的液槽（或称比色杯，常是 0.5cm、1cm、2cm、5cm）， 通过比较待测液与标准溶液的吸光度，求出待测溶液的浓度。 紫外光源用于测定具有共轭双键结构的无色物质；可见光源用于测定一般 的有色物质。 本法灵敏度高，操作简便，快速，廉价，因而在饲料卫生检验上应用很广。 近年来又出现了双波长分光光度法（Dualwavelength Spectrophotometry）。 这是一种新技术，不用参比液，而是选用两种不同的波长，λ1 与λ2 的光束通过 一个样品,测定在这两种波长下的吸收度差值,其中λ1 下的吸收度为参比吸收度, λ2 下的吸收度为测量吸收度。此法最突出的优越性是不仅对吸收光谱互相重叠的
混合样品可以不经分离直接测定,而且可以测定混浊样品。 六、荧光分析法 荧光分析法( Fluorescence analysis)是利用某些物质的分子能吸收能量而 发射出荧光,根据荧光的光谱和强度,对物质进行定性或定量的方法。 荧光分析法具有灵敏度高、选择性强、试样用量少、方法简便和能提供较多 的理论参数等优点,它的测定下限通常比分光光度法低2-4个数量,其检出限可 达ppb乃至ppt级。在饲料卫生检验中,常用于黄曲霉素、苯并(a)芘、铅等物 质的测定。但从总的来说,由于能产生荧光的物质不是很多,故应用范围不如分 光光度法 七、离子选择电极法 根据电化学原理,在一个由参比电极和某种特定电极(离子选择性电极如 氟电极等)组成原电池中,原电池的电位与溶液中该离子的活度之对数成正比 2.303RT E=E0± 式中:E为原电池的电极电位 Eo为常数项取决于参比电极和溶液的离子活度; R为气体常数即8315焦耳/度 T为绝对温度即273+t℃ 为法拉第常数,96500库仑 n为待测离子的价数; 2.303RT nF 为该直线在一定温度下的理论斜率 α为待测溶液中某离子的活度,在稀溶液中,离子浓度就是该离子的活度。 离子选择电极法就是根据以上原理,通过测定原电池电位的变化,来对被测 定溶液中某离子的浓度进行定量的一种分析方法。本法操作极为简便,灵敏度较 高,且样品不需作复杂的处理。但本法尚有一些缺点,主要是精度差,重现性不 第3页共17页
第 3 页 共 17页 - - 混合样品可以不经分离直接测定，而且可以测定混浊样品。 六、荧光分析法 荧光分析法（Fluorescence analysis）是利用某些物质的分子能吸收能量而 发射出荧光，根据荧光的光谱和强度，对物质进行定性或定量的方法。 荧光分析法具有灵敏度高、选择性强、试样用量少、方法简便和能提供较多 的理论参数等优点，它的测定下限通常比分光光度法低 2~4 个数量，其检出限可 达 ppb 乃至 ppt 级。在饲料卫生检验中，常用于黄曲霉素、苯并（a）芘、铅等物 质的测定。但从总的来说，由于能产生荧光的物质不是很多，故应用范围不如分 光光度法。 七、离子选择电极法 根据电化学原理，在一个由参比电极和某种特定电极（离子选择性电极如 氟电极等）组成原电池中，原电池的电位与溶液中该离子的活度之对数成正比： 即 E=E0± 2.303RT nF lgα 式中：E 为原电池的电极电位； E0 为常数项,取决于参比电极和溶液的离子活度； R 为气体常数,即 8.315 焦耳/度； T 为绝对温度,即 273+t℃； F 为法拉第常数,96500 库仑； n 为待测离子的价数； 2.303RT nF 为该直线在一定温度下的理论斜率 α为待测溶液中某离子的活度,在稀溶液中,离子浓度就是该离子的活度。 离子选择电极法就是根据以上原理，通过测定原电池电位的变化，来对被测 定溶液中某离子的浓度进行定量的一种分析方法。本法操作极为简便，灵敏度较 高，且样品不需作复杂的处理。但本法尚有一些缺点，主要是精度差，重现性不
好,需进一步完善。目前离子选择电极的品种很多,有K、Na、Ca、F、NO,、 So2等。在食品卫生检验中作为标准的分析方法是氟离子选择电极法 八、放射免疫测定法 放射免疫测定法( Radio Immuno Assay RIA)是一种将放射性同位素测量和 免疫反应原理相结合的同位素体外检测法。 RIA的基本原理是利用标记抗原(Ag*)与未知抗原(Ag)和特异性抗体(Ab) 间发生竞争作用来测定抗原(毒物或药物)的浓度。 因免疫反应的本质是抗原抗体反应,形成抗原抗体复合物。放射性同位素与 抗原相结合形成标记抗原,与其相应的特异性抗体产生抗原抗体反应。 Ag(未标记抗原) AgAb(未标记抗原抗体复合物) +ab Ag*(标记抗原) Ag*Ab(标记抗原抗体复合物) “未结合状态” “结合状态” (Free) (Bound 在上述免疫反疫中Ab对Ag*与Ag之间没有选择性,具的相同的亲和力, 结合的机会相等。这就是说未标记抗原遇到特异抗体要发生抗原抗体反应,生成 抗原抗体复物。标记抗原遇到特异性抗体也会发生抗原抗体反应,形成标记抗原 抗体复合物。所以说标记抗原(Ag*)及未标记抗原(Ag)与特异性抗体间发生 竞争作用( Competitive reaction)。因此,如果我们将要测定的抗原先进行标记 然后将一定量的标记抗原(Ag*),一定量的抗体(Ab)与未标记的抗原(Ag 待测毒物)相混合,则无论是Ag*或Ag都要与Ab发生竞争作用而形成竞争结合。 如未标记抗原浓度增大,则Ag*Ab复合物浓度就减少。因Ag*对Ab的结合被 Ag的竞争所抑制;反之如未标记的抗原浓度减少,则Ag*Ab复合物的浓度就增 大。因而在一定量标记抗原,一定稀释度的抗体与待测的未知量抗原作用一定时 间后,用放射性同位素的方法来测量标记抗菌素原抗体复合物的放射性,即可测 第4页共17页
第 4 页 共 17页 - - 好，需进一步完善。目前离子选择电极的品种很多，有 K、Na、Ca、F、NO- 3 、 SO2- 4 等。在食品卫生检验中作为标准的分析方法是氟离子选择电极法。 八、放射免疫测定法 放射免疫测定法（Radio Immuno Assay RIA）是一种将放射性同位素测量和 免疫反应原理相结合的同位素体外检测法。 RIA 的基本原理是利用标记抗原（Ag*）与未知抗原（Ag）和特异性抗体（Ab） 间发生竞争作用来测定抗原（毒物或药物）的浓度。 因免疫反应的本质是抗原抗体反应，形成抗原抗体复合物。放射性同位素与 抗原相结合形成标记抗原，与其相应的特异性抗体产生抗原抗体反应。 Ag（未标记抗原） AgAb（未标记抗原抗体复合物） +Ab + Ag*（标记抗原） Ag*Ab（标记抗原抗体复合物） “未结合状态” “结合状态” （Free） （Bound） 在上述免疫反疫中 Ab 对 Ag*与 Ag 之间没有选择性，具的相同的亲和力， 结合的机会相等。这就是说未标记抗原遇到特异抗体要发生抗原抗体反应，生成 抗原抗体复物。标记抗原遇到特异性抗体也会发生抗原抗体反应，形成标记抗原 抗体复合物。所以说标记抗原（Ag*）及未标记抗原（Ag）与特异性抗体间发生 竞争作用（Compefitive reaction）。因此，如果我们将要测定的抗原先进行标记， 然后将一定量的标记抗原（Ag*），一定量的抗体（Ab）与未标记的抗原（Ag， 待测毒物）相混合，则无论是 Ag*或 Ag 都要与 Ab 发生竞争作用而形成竞争结合。 如未标记抗原浓度增大，则 Ag*Ab 复合物浓度就减少。因 Ag*对 Ab 的结合被 Ag 的竞争所抑制；反之如未标记的抗原浓度减少，则 Ag*Ab 复合物的浓度就增 大。因而在一定量标记抗原，一定稀释度的抗体与待测的未知量抗原作用一定时 间后，用放射性同位素的方法来测量标记抗菌素原抗体复合物的放射性，即可测
出毒物的含量。测定时,先以各种已知浓度的抗原和一定量的标记抗原与抗体作 用,测定各种标准浓度抗原的标记抗原抗体复合物的放射性结合率(B%),即可 绘成标准曲线。即标准竞争抑制曲线。然后取一定量样品按同法进行测定,再根 据被测抗原的放射性结合率(B%),就可从标准竞争抑制曲线中查出相应的该抗 原的含量,即预测定的毒物之含量。 RIA由于具有灵敏度高(可检测109-1012g)、特异性强、用样量少(0.1-lm) 等特点,所以应用越来越广,发展也更加迅速。其突出特点是样品可不必纯化处 理,所以应用其进行的药物与毒物的种类越来越多。目前已将RIA商品化,标准 化,成套出售RIA试剂盒以及自动化测录的同位素计数仪的配备,使RA的应用 更加方便 第二节薄层色谱法 薄层色谱法是色谱法的一个重要分支。由于该法具有设备简单、操作方便 对混合组分的分离效果好等优点,故广泛应用于饲料中农药、真菌毒素等的分离 和分析。 薄层色谱根据分离的机理不同,可分为吸附薄层色谱、分配薄层色谱、离子 交换薄层色谱和凝胶过滤薄层色谱等四种。考虑在饲料卫生检验中的实际应用情 况,这里只介绍吸附薄层色谱。 吸附薄层色谱的原理 吸附薄层色谱主要是利用吸附剂对混合物中各成分吸附能力的不同,及展开 剂对它们的解吸附能力不同,使各成分达到分离的目的。 凡具有吸附能力,能将溶液中的一些成分吸附到它表面的固体物称为吸附 剂,吸附剂的吸附活性主要由物质的表面作用力、氢键、络合、静电引力、范德 华力等产生。吸附剂对各种有机化合物能表现出不同的吸附活性。用一定的溶剂 系统展开时,由于溶剂与样品组分争夺吸附剂表面,产生竞争吸附作用,因此, 产生了吸附与解吸附的过程。可见,薄层分离过程实际上是一个吸附、解吸附、 第5页共17页
第 5 页 共 17页 - - 出毒物的含量。测定时，先以各种已知浓度的抗原和一定量的标记抗原与抗体作 用，测定各种标准浓度抗原的标记抗原抗体复合物的放射性结合率（B%），即可 绘成标准曲线。即标准竞争抑制曲线。然后取一定量样品按同法进行测定，再根 据被测抗原的放射性结合率（B%），就可从标准竞争抑制曲线中查出相应的该抗 原的含量，即预测定的毒物之含量。 RIA 由于具有灵敏度高（可检测 10-9~10-12g）、特异性强、用样量少（0.1~1ml） 等特点，所以应用越来越广，发展也更加迅速。其突出特点是样品可不必纯化处 理，所以应用其进行的药物与毒物的种类越来越多。目前已将 RIA 商品化，标准 化，成套出售 RIA 试剂盒以及自动化测录的同位素计数仪的配备，使 RIA 的应用 更加方便。 第二节 薄层色谱法 薄层色谱法是色谱法的一个重要分支。由于该法具有设备简单、操作方便、 对混合组分的分离效果好等优点，故广泛应用于饲料中农药、真菌毒素等的分离 和分析。 薄层色谱根据分离的机理不同，可分为吸附薄层色谱、分配薄层色谱、离子 交换薄层色谱和凝胶过滤薄层色谱等四种。考虑在饲料卫生检验中的实际应用情 况，这里只介绍吸附薄层色谱。 一、吸附薄层色谱的原理 吸附薄层色谱主要是利用吸附剂对混合物中各成分吸附能力的不同，及展开 剂对它们的解吸附能力不同，使各成分达到分离的目的。 凡具有吸附能力，能将溶液中的一些成分吸附到它表面的固体物称为吸附 剂，吸附剂的吸附活性主要由物质的表面作用力、氢键、络合、静电引力、范德 华力等产生。吸附剂对各种有机化合物能表现出不同的吸附活性。用一定的溶剂 系统展开时，由于溶剂与样品组分争夺吸附剂表面，产生竞争吸附作用，因此， 产生了吸附与解吸附的过程。可见，薄层分离过程实际上是一个吸附、解吸附
再吸附、再解吸附……的连续不断的循环过程。各种化合物,由于结构和性质上 差异,表现出在吸附上所受吸附力就不同,一定展开剂对它们的解吸附难易程度 也就不同,因此,各种化合物组分展开时彼此程度不同地被分离,性质差异越大, 分离效果越好。 二、薄层色谱条件的选择 要想得到理想的薄层色谱结果,首先要处理好吸附剂、展开剂和被分离成分 三者之间的关系。 ()吸附剂 1、吸附剂的条件 薄层吸附色谱要求吸附剂有较大的表面积及适当的吸附能力,与被分离物 质、溶剂、展开剂不发生化学反应,在所用的溶剂及展开剂中不溶解,颗粒均匀 1、吸附剂的种类 薄层色谱所用吸附剂种类很多,在饲料卫生检验中最常用的吸附剂有硅胶和 氧化铝。 (1)硅胶硅胶是一种微酸性的无机吸附剂,由硅胶酸脱水而成。具有多孔 性硅氧环的交链结构,由于其骨架表面有很多硅醇基(-Si-OH),能和许多化 合物形成氢键而具有吸附能力,同时也可通过氢键吸附多量的水分。硅胶吸附的 水越多,则吸附的活性也越低。若吸附水量超过17%,则硅胶的吸附能力很弱, 般就不作为吸附剂应用,而只能作为分配色谱的支持剂(载体)。当将硅胶加热 至100-110℃时,可除去硅胶所吸附的水,重新显出吸附活性。但加热温度不能太 髙,若超过500℃,硅胶结构中彼此邻近的硅醇基将会互相脱水成硅氧环结构, 将使硅胶形成不可逆的失水,而失去吸附活性,一般到170℃时,即有少量硅醇 基相互脱水。 硅氧环 -Sio-Si-OI 第6页共17页
第 6 页 共 17页 - - 再吸附、再解吸附……的连续不断的循环过程。各种化合物，由于结构和性质上 差异，表现出在吸附上所受吸附力就不同，一定展开剂对它们的解吸附难易程度 也就不同，因此，各种化合物组分展开时彼此程度不同地被分离，性质差异越大， 分离效果越好。 二、薄层色谱条件的选择 要想得到理想的薄层色谱结果，首先要处理好吸附剂、展开剂和被分离成分 三者之间的关系。 ㈠ 吸附剂 1、吸附剂的条件 薄层吸附色谱要求吸附剂有较大的表面积及适当的吸附能力，与被分离物 质、溶剂、展开剂不发生化学反应，在所用的溶剂及展开剂中不溶解，颗粒均匀。 1、吸附剂的种类 薄层色谱所用吸附剂种类很多，在饲料卫生检验中最常用的吸附剂有硅胶和 氧化铝。 ⑴ 硅胶 硅胶是一种微酸性的无机吸附剂，由硅胶酸脱水而成。具有多孔 性硅氧环的交链结构，由于其骨架表面有很多硅醇基（—Si—OH），能和许多化 合物形成氢键而具有吸附能力，同时也可通过氢键吸附多量的水分。硅胶吸附的 水越多，则吸附的活性也越低。若吸附水量超过 17%，则硅胶的吸附能力很弱， 一般就不作为吸附剂应用，而只能作为分配色谱的支持剂（载体）。当将硅胶加热 至 100~110℃时,可除去硅胶所吸附的水,重新显出吸附活性。但加热温度不能太 高，若超过 500℃，硅胶结构中彼此邻近的硅醇基将会互相脱水成硅氧环结构， 将使硅胶形成不可逆的失水，而失去吸附活性，一般到 170℃时，即有少量硅醇 基相互脱水。 │硅氧环│ —Si—O—Si—OH
硅胶上的硅醇基能一定程度的解离,显弱酸性(φpH3~5)。所以硅胶适用于中 性或酸性物质的分离。相对地说,更适于分离疏水性物质,所以常用于有机磷、 黄曲霉素等物质的分离分析,是目前应用很广的薄层吸附剂 目前常用的商品硅胶有以下几种: ①硅胶H不加粘合剂的硅胶。 ②硅胶G加粘合剂的硅胶,一般加1013%的石膏粉。 ③硅胶H254含荧光物质但不含粘合剂的硅胶。它可以在短波紫外线光 照下显出荧光 (2)氧化铝是微碱性的吸附剂,其吸附能力较硅胶强,适用于中性或碱性 的亲脂性化合物的分离。它不像硅胶那样含有较多的氯化物,因而常用于有机氯 及氨基甲酸酯类农药的分析。 市场上氧化铝常见的有氧化铝H、氧化铝G、氧化铝HF和氧化铝等。粒 度一般为40um。 硅胶和氧化铝的吸附能力与自身的含水量有关,含水越多,吸附活性越小, 吸附能力越小。按含水多少通常将它们的活性分为五级,I级吸附力最强,V级吸 附力最弱。薄层色谱通常要求活性为I-Ⅲ级,故必须通过活化或减活进行调整。 活化是将吸附剂在一定温度下加热,除去吸附剂中所含的水分使其吸附活性提高髙, 吸附能力加强的过程。相反在吸附剂中加入一定量的水分,使其吸附活性降低的 过程称为减活。 (二)展开剂 薄层的展开剂主要是低沸点的有机溶剂。展开剂的选择正确与否对于成功 地进行薄层分离是非常重要的。 在吸附薄层色谱条件选择时,必须从吸附剂、展开剂、被分离物质三者综 合考虑。这三者的相互关系可由图1-1简明表示 薄层色谱条件选择的基本原则:当用亲水性吸附剂进行色谱时,如果被分 离物质极性较大,应采用吸附性较弱(活度低)的吸附和极性较大的展开剂;如 第7页共17页
第 7 页 共 17页 - - 硅胶上的硅醇基能一定程度的解离，显弱酸性(pH3~5)。所以硅胶适用于中 性或酸性物质的分离。相对地说，更适于分离疏水性物质，所以常用于有机磷、 黄曲霉素等物质的分离分析，是目前应用很广的薄层吸附剂。 目前常用的商品硅胶有以下几种： ① 硅胶 H 不加粘合剂的硅胶。 ② 硅胶 G 加粘合剂的硅胶，一般加 10~13%的石膏粉。 ③ 硅胶 HF254 含荧光物质但不含粘合剂的硅胶。它可以在短波紫外线光 照下显出荧光。 ⑵ 氧化铝 是微碱性的吸附剂，其吸附能力较硅胶强，适用于中性或碱性 的亲脂性化合物的分离。它不像硅胶那样含有较多的氯化物，因而常用于有机氯 及氨基甲酸酯类农药的分析。 市场上氧化铝常见的有氧化铝 H、氧化铝 G、氧化铝 HF 和氧化铝 等。粒 度一般为 40um。 硅胶和氧化铝的吸附能力与自身的含水量有关，含水越多，吸附活性越小， 吸附能力越小。按含水多少通常将它们的活性分为五级，I 级吸附力最强，V 级吸 附力最弱。薄层色谱通常要求活性为 II~III 级，故必须通过活化或减活进行调整。 活化是将吸附剂在一定温度下加热，除去吸附剂中所含的水分使其吸附活性提高， 吸附能力加强的过程。相反在吸附剂中加入一定量的水分，使其吸附活性降低的 过程称为减活。 （二）展开剂 薄层的展开剂主要是低沸点的有机溶剂。展开剂的选择正确与否对于成功 地进行薄层分离是非常重要的。 在吸附薄层色谱条件选择时，必须从吸附剂、展开剂 、被分离物质三者综 合考虑。这三者的相互关系可由图 1—1 简明表示。 薄层色谱条件选择的基本原则：当用亲水性吸附剂进行色谱时，如果被分 离物质极性较大，应采用吸附性较弱（活度低）的吸附和极性较大的展开剂；如
果被分离物质亲脂性较强,应选用吸附性较强(高活度)的吸附剂和极性较小的 展开剂。 在实际工作中,由于吸附剂、被分离物质及展开剂三者之间,前两者的性 质在一定条件下是固定的,因此,选择合适的展开剂是提高薄层分离效率的关键 为了达到良好的分离效果,消除斑点的拖尾现象,并使斑点轮廓清晰,展开剂通 常采用两种或两种以上有机溶剂组成的混合溶剂系统。这种混合溶剂系统由“基 础溶剂”(即底剂)和“洗脱溶剂”(即推进剂)组成。底剂通常用极性小的溶剂, 如丙酮、乙醇、甲醇、乙酸乙酯等。由于展开系统极性过强或过弱,均会影响色 谱分离效果,展开剂极性过强,绝大多数组分被推至前沿重叠;而过弱则绝大多 数组分留在原点附近而不能分离。因此。使用时,需通过调节底剂和推进剂的比 例来改变展开剂的极性,使被分离物质得到更好的分离效果。通常希望展开后, 被测组分的比移值(即试样斑点中心至原点距离与溶剂前沿至原点的距离的比值, Rate of flow,简写Rf)在02~0.8分离。 三、薄层色谱操作步骤 薄层色谱操作一般包括制板、点样、展开、显色、定性、定量等几个步骤。 ()薄层板的制备 常用玻璃板作为载板,预先必须清洗干净,并且晾干。制备时根据玻板的大 小和所需薄层的厚度,按每100cm称取1.0~1.5g置研钵中,加2~3倍量水,适当 硏磨,调成匀浆,迅速倒于干洁的玻板上,用玻棒将吸附剂铺平,振动玻板,使 吸附剂均匀分布,然后先自然晾干再根据需要进行活化。 薄层制备时的注意事项: 1、吸附剂的加液量必须适宜,加液量过多,吸附剂不易形成凝胶,固化时 间延长,且容易留下波纹状痕印或斑迹。加液量过少,凝胶化过速容易堆积过厚, 不仅涂布不匀,而且易造成薄层龟裂或皱褶。 2、研磨时,不宜过于剧烈,以免产生气泡,造成薄层上有麻点 3、调制匀浆时间应适宜,一般研磨时间以1~2min为宜。时间过长会使凝胶 水分溢出,结构破坏,并在研钵上自行固化,以致无法涂布 第8页共17页
第 8 页 共 17页 - - 果被分离物质亲脂性较强，应选用吸附性较强（高活度）的吸附剂和极性较小的 展开剂。 在实际工作中，由于吸附剂 、被分离物质及展开剂三者之间，前两者的性 质在一定条件下是固定的，因此，选择合适的展开剂是提高薄层分离效率的关键。 为了达到良好的分离效果，消除斑点的拖尾现象，并使斑点轮廓清晰，展开剂通 常采用两种或两种以上有机溶剂组成的混合溶剂系统。这种混合溶剂系统由“基 础溶剂”（即底剂）和“洗脱溶剂”（即推进剂）组成。底剂通常用极性小的溶剂， 如丙酮、乙醇、甲醇、乙酸乙酯等。由于展开系统极性过强或过弱，均会影响色 谱分离效果，展开剂极性过强，绝大多数组分被推至前沿重叠；而过弱则绝大多 数组分留在原点附近而不能分离。因此。使用时，需通过调节底剂和推进剂的比 例来改变展开剂的极性，使被分离物质得到更好的分离效果。通常希望展开后， 被测组分的比移值（即试样斑点中心至原点距离与溶剂前沿至原点的距离的比值， Rate of flow，简写 Rf）在 0.2~0.8 分离。 三、薄层色谱操作步骤 薄层色谱操作一般包括制板、点样、展开、显色、定性、定量等几个步骤。 ㈠ 薄层板的制备 常用玻璃板作为载板，预先必须清洗干净，并且晾干。制备时根据玻板的大 小和所需薄层的厚度，按每 100cm 称取 1.0~1.5g 置研钵中，加 2~3 倍量水，适当 研磨，调成匀浆，迅速倒于干洁的玻板上，用玻棒将吸附剂铺平，振动玻板，使 吸附剂均匀分布，然后先自然晾干再根据需要进行活化。 薄层制备时的注意事项： 1、吸附剂的加液量必须适宜，加液量过多，吸附剂不易形成凝胶，固化时 间延长，且容易留下波纹状痕印或斑迹。加液量过少，凝胶化过速容易堆积过厚， 不仅涂布不匀，而且易造成薄层龟裂或皱褶。 2、研磨时，不宜过于剧烈，以免产生气泡，造成薄层上有麻点。 3、调制匀浆时间应适宜，一般研磨时间以 1~2min 为宜。时间过长会使凝胶 水分溢出，结构破坏，并在研钵上自行固化，以致无法涂布
4、具体调浆时所需的量要视薄板的面积和厚度来定,一般用作定量分析的 薄层,其厚度以025~0.30mm为宜。若过厚,其灵敏度太低。过薄,虽然灵敏度 髙,但经展开后,被测物质的比移值规律性差,且展开速度较慢。在实际工作中, 用于测定有机氯的板要薄一些(025mm),用于测定有机磷的板可稍厚些 (04-0.5mm)。至于每块板所需称取多少吸附剂,这要根据试验确定,例如涂一 块5×15cm的硅胶G板,需0.8g左右;如果是氧化铝板,须1.8g左右。当然, 由于涂布方法不同,所需的量也会有所差异。 5、涂好吸附剂的薄层板,应先晾干再活化。即先放在水平的桌面上让其自 然干燥。如果未干燥就加热活化,会因水分蒸发过快,而在薄层上出现气泡或龟 裂。晾干后再根据需要进行活化,对于硅胶板来说,于105~110℃活化半小时便 符合要求。活化好的薄层板应放在干燥器中,一般可保存二周,如果超过时间, 应重新进行活化。 点样 在薄层定量分析中,要求点样的原点大小一致,并且要求尽可能小,一般直 径不超过3mm。目前常用的点样方法有直接点样法和间接点样法两种 1、直接点样法 先在已准备好的薄层板上作记号,距底边2cm为基线,距基线10cm或15cm 处作为展开溶剂的前沿线。然后用微量点样器直接将样品液点在基线上,每点的 间距为1.5cm。边点样边用热风缓缓吹原点,使溶剂迅速挥发,以免原点面积过 大。点样既要细心,不要截破薄层板上的固定相,以免形成不规则的斑点而影响 比移值的正确测量;又不能过慢,一般不应超过10min。否则薄层板在空气中暴 露时间过长,会吸收水分而改变其活度,从而影响分离效果。 直接点样法操作简便,是最常用的点样方法。但很难使原点面积大小一致, 也很难控制直径在3mm之内,而且又容易损伤薄层的表面,特别是在薄层板上进 行测定面积时,这些缺点会影响结果 2、间接点样法(滤纸移样法) 先将样品液分次缓缓样于直径为2~3mm的色谱滤纸上。另用打孔器在薄层 第9页共17页
第 9 页 共 17页 - - 4、具体调浆时所需的量要视薄板的面积和厚度来定，一般用作定量分析的 薄层，其厚度以 0.25~0.30mm 为宜。若过厚，其灵敏度太低。过薄，虽然灵敏度 高，但经展开后，被测物质的比移值规律性差，且展开速度较慢。在实际工作中， 用于测定有机氯的板要薄一些（0.25mm），用于测定有机磷的板可稍厚些 （0.4~0.5mm）。至于每块板所需称取多少吸附剂，这要根据试验确定，例如涂一 块 5×15cm 的硅胶 G 板，需 0.8g 左右；如果是氧化铝板，须 1.8g 左右。当然， 由于涂布方法不同，所需的量也会有所差异。 5、涂好吸附剂的薄层板，应先晾干再活化。即先放在水平的桌面上让其自 然干燥。如果未干燥就加热活化，会因水分蒸发过快，而在薄层上出现气泡或龟 裂。晾干后再根据需要进行活化，对于硅胶板来说，于 105~110℃活化半小时便 符合要求。活化好的薄层板应放在干燥器中，一般可保存二周，如果超过时间， 应重新进行活化。 ㈡ 点样 在薄层定量分析中，要求点样的原点大小一致，并且要求尽可能小，一般直 径不超过 3mm。目前常用的点样方法有直接点样法和间接点样法两种。 1、直接点样法 先在已准备好的薄层板上作记号，距底边 2cm 为基线，距基线 10cm 或 15cm 处作为展开溶剂的前沿线。然后用微量点样器直接将样品液点在基线上，每点的 间距为 1.5cm。边点样边用热风缓缓吹原点，使溶剂迅速挥发，以免原点面积过 大。点样既要细心，不要截破薄层板上的固定相，以免形成不规则的斑点而影响 比移值的正确测量；又不能过慢，一般不应超过 10min。否则薄层板在空气中暴 露时间过长，会吸收水分而改变其活度，从而影响分离效果。 直接点样法操作简便，是最常用的点样方法。但很难使原点面积大小一致， 也很难控制直径在 3mm 之内，而且又容易损伤薄层的表面，特别是在薄层板上进 行测定面积时，这些缺点会影响结果。 2、间接点样法（滤纸移样法） 先将样品液分次缓缓样于直径为 2~3mm 的色谱滤纸上。另用打孔器在薄层
上打一相同直径的小孔,然后将点好样的滤纸片放入小孔内。此法优点是可点较 多的样液,而且斑点很集中。这样用斑点面积法进行定量比较准确,但操作较麻 烦 白展开 展开(亦称展层)就是将薄层板点有样液的一端浸入展开槽中的展开剂(其 深度必须低于点样原点。一般以lcm为宜),由于溶剂推动样点中物质自下而上 的移动,并使之达到彼此分离的操作过程。根据展开的次数和方向,可分为一次 展开、多次展开、双向展开。 1、一次展开 用一种或一种以上的溶剂组成的展开系统一次展开至前沿,然后挥干、显色 2、多次展开 使用一种展开剂展开至前沿后再用同样展开剂或另换别种展开剂进行第 次或更多次的展开,这样可以使比移值接近的不同组分得到较好的分离 3、双向展开 是同一块薄层板沿两个不同方向,用两类性质不同的溶剂进行展开的方法。适用 于多组分混合物的分离。同时,此法刀可用于纯化处理,即将薄层板用弱极性的 溶剂先横向展开一次,将色素、脂肪等干扰杂质推到薄层边缘,然后将薄层板转 90度,再用极性较强的溶剂纵展一次。这样可以排除杂质的干扰,获得清晰的样 品斑点。 展开过程中,有时会出现前沿线弯曲,经显色后,并列点加样品的斑点却不 在同一条线上,而出现斑点形状、大小不规则、比例值改变的现象,这种现象称 为边缘效应。 产生边缘效应的原因是由于展开槽中溶液不饱和状态和展开剂在薄层板不 同部位分配不同的缘故。即当混合溶剂在薄层上展开时,极性弱的低沸点溶剂在 薄层边缘挥发得快,在边缘部分比中心部分含有更多的极性较大溶剂,从而使边 缘斑点的比移值高于中部斑点的比移值。 消除边缘效应的方法,可在展开前取一大小适宜的洁净滤纸,折成圆筒形垫在展 第10页共17页
第 10 页 共 17页 - - 上打一相同直径的小孔，然后将点好样的滤纸片放入小孔内。此法优点是可点较 多的样液，而且斑点很集中。这样用斑点面积法进行定量比较准确，但操作较麻 烦。 ㈢ 展开 展开（亦称展层）就是将薄层板点有样液的一端浸入展开槽中的展开剂（其 深度必须低于点样原点。一般以 1cm 为宜），由于溶剂推动样点中物质自下而上 的移动，并使之达到彼此分离的操作过程。根据展开的次数和方向，可分为一次 展开、多次展开、双向展开。 1、一次展开 用一种或一种以上的溶剂组成的展开系统一次展开至前沿，然后挥干、显色。 2、多次展开 使用一种展开剂展开至前沿后再用同样展开剂或另换别种展开剂进行第二 次或更多次的展开，这样可以使比移值接近的不同组分得到较好的分离。 3、双向展开 是同一块薄层板沿两个不同方向，用两类性质不同的溶剂进行展开的方法。适用 于多组分混合物的分离。同时，此法刀可用于纯化处理，即将薄层板用弱极性的 溶剂先横向展开一次，将色素、脂肪等干扰杂质推到薄层边缘，然后将薄层板转 90 度，再用极性较强的溶剂纵展一次。这样可以排除杂质的干扰，获得清晰的样 品斑点。 展开过程中，有时会出现前沿线弯曲，经显色后，并列点加样品的斑点却不 在同一条线上，而出现斑点形状、大小不规则、比例值改变的现象，这种现象称 为边缘效应。 产生边缘效应的原因是由于展开槽中溶液不饱和状态和展开剂在薄层板不 同部位分配不同的缘故。即当混合溶剂在薄层上展开时，极性弱的低沸点溶剂在 薄层边缘挥发得快，在边缘部分比中心部分含有更多的极性较大溶剂，从而使边 缘斑点的比移值高于中部斑点的比移值。 消除边缘效应的方法，可在展开前取一大小适宜的洁净滤纸，折成圆筒形垫在展