第五章霉菌及其毒素分析 第一节产毒霉菌及霉菌毒素的筛选 、产毒莓菌的筛选 1、直接测定霉菌毒素 2、动物试验 用于筛选产毒霉菌的动物主要有小白鼠和兔子。 (1)小白鼠常用于通过口服或注射毒性试验来筛选产毒青霉菌和曲莓菌 等。方法是将分离纯化的霉菌接种于经过灭菌的饲料中,培养7~14天后,60℃ 干燥48h,以杀死或抑制霉菌生长,然后制成菌料,直接饲喂小白鼠,观察小白 鼠的生长情况或死后变化。或用有机溶剂提取制成粗毒素,注射或投服,观察小 白鼠的中毒情况或死后变化 (2)兔子常用于皮肤局部刺激试验筛选镰刀菌或其它一些产生细胞毒素 的幂菌。方法是将分离纯化的霉菌接种于经过灭菌的饲料或其它基质中,培养7 14天后,用有机溶剂提取制成粗毒素,将兔子背部毛剪净,涂搽粗毒素,观察 兔子皮肤的毒性反应,如红肿、热痛、坏死等。 二、莓菌毒素的筛选和测定 霉菌毒素的发现通常有两种途径 (1)在研究自然发生中毒过程中发现霉菌毒素,如黄曲霉毒素; (2)在直接硏究某种霉菌的产毒性能时发现毒素,如硏究赭曲霉时发现赭 曲霉毒素。 引起急性中毒的毒素易为人们发现和重视。但在多数情况下,引起慢性中 毒如引起生产性能下降,对疾病的抵抗力降低等的霉菌毒素往往容易被人们忽 视。所以,筛选及测定霉菌毒素对知道畜牧业生产、防病治病有重要的意义 霉菌毒素的筛选和测定方法主要有: ()物理化学法 物理化学方法是利用气相色谱、高效液相色谱、薄层层析进行定量测定
1 第五章 霉菌及其毒素分析 第一节 产毒霉菌及霉菌毒素的筛选 一、产毒霉菌的筛选 1、直接测定霉菌毒素。 2、动物试验 用于筛选产毒霉菌的动物主要有小白鼠和兔子。 ⑴ 小白鼠 常用于通过口服或注射毒性试验来筛选产毒青霉菌和曲霉菌 等。方法是将分离纯化的霉菌接种于经过灭菌的饲料中，培养 7～14 天后，60℃ 干燥 48h，以杀死或抑制霉菌生长，然后制成菌料，直接饲喂小白鼠，观察小白 鼠的生长情况或死后变化。或用有机溶剂提取制成粗毒素，注射或投服，观察小 白鼠的中毒情况或死后变化。 ⑵ 兔子 常用于皮肤局部刺激试验筛选镰刀菌或其它一些产生细胞毒素 的霉菌。方法是将分离纯化的霉菌接种于经过灭菌的饲料或其它基质中，培养 7～ 14 天后，用有机溶剂提取制成粗毒素，将兔子背部毛剪净，涂搽粗毒素，观察 兔子皮肤的毒性反应，如红肿、热痛、坏死等。 二、霉菌毒素的筛选和测定 霉菌毒素的发现通常有两种途径： ⑴ 在研究自然发生中毒过程中发现霉菌毒素，如黄曲霉毒素； ⑵ 在直接研究某种霉菌的产毒性能时发现毒素，如研究赭曲霉时发现赭 曲霉毒素。 引起急性中毒的毒素易为人们发现和重视。但在多数情况下，引起慢性中 毒如引起生产性能下降，对疾病的抵抗力降低等的霉菌毒素往往容易被人们忽 视。所以，筛选及测定霉菌毒素对知道畜牧业生产、防病治病有重要的意义。 霉菌毒素的筛选和测定方法主要有： ㈠ 物理化学法 物理化学方法是利用气相色谱、高效液相色谱、薄层层析进行定量测定
这里主要就霉菌毒素的薄层层析分析作一介绍 1、采样 由于霉菌毒素一般污染饲料的胚部,因而常规的随机抽样和分层定点采样 方法有时不能代表成批饲料的真实情况。 Cucullu等曾对2Kg花生样品进行逐粒 观察,挑出其中20粒霉变花生,发现这些花生的黄曲霉毒素含量在0.3ppm至 1100之间。即使样品中霉变花生比例变化很小,其结果也将发生很大的变化。所 以,进行霉菌毒素分析时,其采集平均试样的采样点要比常规采样多。散装样品, 需采100个点以上,袋装样品要采25%以上袋。平均试样经过粉碎后再缩分成试 样,供测定用。 推荐的饿米军毒素的采样过程: 100个点以上 粉碎 匀浆 大批样品 3×3.5Kg(平均试样)——3×350g—3×2×100g。 25%袋以上 缩分 缩分 2、提取 霉菌毒素通常均为有机物,须用响应极性的有机溶剂提取。 常用有机溶剂: 粗提溶剂一一甲醇、氯仿、丙酮、乙酸乙酯、乙腈,这些溶剂单独使用或 两种、两种以上配合使用 纯化用溶剂(萃取)一一石油醚,正己烷 常用的提取方法:振荡提取30~45min; 高速匀浆提取3min。 3、纯化 霉菌毒素提取液的怀春化除了前述的萃取法、柱层析法和薄层色谱法外, 还有液固提取法( Liquid- solid extractrion)和化学吸附法( Chemical absorption) 液固提取法是利用多数霉菌毒素不溶于石油醚和正己烷的性质,用正己烷 或石油醚除去试样中的脂肪、色素等弱极性杂质的一种纯化方法。此法常在试样 提取前或与提取同时进行。 2
2 这里主要就霉菌毒素的薄层层析分析作一介绍。 1、采样 由于霉菌毒素一般污染饲料的胚部，因而常规的随机抽样和分层定点采样 方法有时不能代表成批饲料的真实情况。Cucullu 等曾对 2Kg 花生样品进行逐粒 观察，挑出其中 20 粒霉变花生，发现这些花生的黄曲霉毒素含量在 0.3ppm 至 1100 之间。即使样品中霉变花生比例变化很小，其结果也将发生很大的变化。所 以，进行霉菌毒素分析时，其采集平均试样的采样点要比常规采样多。散装样品， 需采 100 个点以上，袋装样品要采 25%以上袋。平均试样经过粉碎后再缩分成试 样，供测定用。 推荐的饿米军毒素的采样过程： 100 个点以上 粉碎 匀浆 大批样品————3×3.5Kg（平均试样）——3×350g——3×2×100g。 25%袋以上 缩分 缩分 2、提取 霉菌毒素通常均为有机物，须用响应极性的有机溶剂提取。 常用有机溶剂： 粗提溶剂——甲醇、氯仿、丙酮、乙酸乙酯、乙腈，这些溶剂单独使用或 两种、两种以上配合使用。 纯化用溶剂（萃取）——石油醚，正己烷。 常用的提取方法：振荡提取 30～45min； 高速匀浆提取 3min。 3、纯化 霉菌毒素提取液的怀春化除了前述的萃取法、柱层析法和薄层色谱法外， 还有液固提取法（Liquid-solid extractrion）和化学吸附法(Chemical absorption)。 液固提取法是利用多数霉菌毒素不溶于石油醚和正己烷的性质，用正己烷 或石油醚除去试样中的脂肪、色素等弱极性杂质的一种纯化方法。此法常在试样 提取前或与提取同时进行
化学吸附法是吸附柱色谱的衍化,系用一些吸附剂如硅藻土、硅胶、活性 炭、碳酸铜等将杂质吸附除去的一种方法,此法常与试样提取冋时进行。 4、测定 下表所列的是几种霉菌毒素TLC进行测定的方法。 表5-1几种霉菌毒素TLC分析方法 毒素名称吸附剂 展开剂 Rf|显色方法 氯仿一甲醇(97:3) 黄曲霉毒素B1硅胶氯仿一丙酮一正己烷(7:2:1)035Uvy5m 氯仿一丙酮(9:1) 0.27 硅胶+草 氯仿一甲醇(98:2) 桔青霉素 0.51 UV365nm 酸 氯仿一丙酮(9:1) 赭曲霉毒素A硅胶 苯一乙酸(4:1) 0.40UV365nm 苯一甲醇(97:3) 展青霉素 硅胶 苯一丙酮(9:1) 0.16 UV254nm 氯仿一甲醇(97:3) 0.67 杂色曲霉毒素硅胶 UV254nm 氯仿一丙酮(9:1) 仿一甲醇(97:3) 0.45 T2毒素 硅胶 硫酸铈 氯仿一丙酮(9:1) 0.22 氯仿一甲醇(97:3) 玉米赤霉烯酮 硅胶 氯仿一丙酮(9:1) 0.38 UV254nm 氯仿一甲醇(97:3) 0.40 震颤素 硅胶|氯仿一丙酮一正己烷(7:2:1)051硫酸铈加热 3
3 化学吸附法是吸附柱色谱的衍化，系用一些吸附剂如硅藻土、硅胶、活性 炭、碳酸铜等将杂质吸附除去的一种方法，此法常与试样提取同时进行。 4、测定 下表所列的是几种霉菌毒素 TLC 进行测定的方法。 表 5-1 几种霉菌毒素 TLC 分析方法 毒素名称 吸附剂 展开剂 Rf 显色方法 黄曲霉毒素 B1 硅胶 氯仿—甲醇（97﹕3） 氯仿—丙酮—正己烷（7﹕2﹕1） 氯仿—丙酮（9﹕1） 0.44 0.35 0.27 UV365nm 桔青霉素 硅胶+草 酸 氯仿—甲醇（98﹕2） 氯仿—丙酮（9﹕1） 0.52 0.51 UV365nm 赭曲霉毒素 A 硅胶 苯—乙酸（4﹕1） 0.40 UV365nm 展青霉素 硅胶 苯—甲醇（97﹕3） 苯—丙酮（9﹕1） 0.22 0.16 UV254nm 杂色曲霉毒素 硅胶 氯仿—甲醇（97﹕3） 氯仿—丙酮（9﹕1） 0.67 0.27 UV254nm T-2 毒素 硅胶 氯仿—甲醇（97﹕3） 氯仿—丙酮（9﹕1） 0.45 0.22 硫酸铈 玉米赤霉烯酮 硅胶 氯仿—甲醇（97﹕3） 氯仿—丙酮（9﹕1） 0.40 0.38 UV254nm 震颤素 硅胶 氯仿—甲醇（97﹕3） 氯仿—丙酮—正己烷（7﹕2﹕1） 0.40 0.51 UV254nm 硫酸铈加热
白生物学试验 生物学试验方法主要包括细胞学试验、微生物学试验、免疫学试验和动物试 验等。 1、细胞学实验 细胞学试验是利用某些霉菌毒素具有细胞毒性,对组织培养细胞具有毒性作 用,引起细胞变形、细胞数减少,形成巨细胞或引起细胞死亡等 用来做细胞学试验的组织细胞有:1日龄小鸡气管细胞:小牛肾细胞和鸡胚 细胞等 2、微生物学试验 许多霉菌毒素起初都是作为抗菌素被发现的。微生物学实验就是利用某些霉 菌毒素的抑菌性能来测定其毒性。 常用的微生物有:巨大芽孢杆菌( Bacillus megaterium)、枯草杆菌(B. Su- bilis)、乳酸菌( Lactic acid bactria)。 由于不同霉菌毒素对不同动物、不同组织细胞的毒性不同,因此在结果分析 时应注意:微生物学试验不可能测定所有对脊椎动物有毒的毒素,特别是侵害脊 椎动物神经系统的毒素。同时,抑菌试验结果理想的毒素也不一定对脊椎动物有 毒性 3、免疫学试验 免疫学试验是测定霉菌毒素的高特异性和髙灵敏度的定性定量方法。目日前已 用于测定赭曲霉毒素A、T-2毒素、黄曲霉毒素B1和M、玉米赤霉烯酮等。 免疫学试验包括放射免疫试验和酶联免疫吸附试验。 (1)放射免疫试验( Radioimmunoassay,RIA) 放射免疫试验是将同位素技术的高灵敏与抗原抗体反映的高特异性结合起 来。其基本原理是放射性标记抗原与非标记抗原竞争性地和抗体结合,当样品中 的非标记抗原的量增加时,标记抗原与抗体形成的复合物的两减少,即样品中待 测抗原的量与标记抗原抗体复合物的量成反比。所以可根据标记抗原抗体复合物 的多少(放射性强度)来定量未知抗原
4 ㈡ 生物学试验 生物学试验方法主要包括细胞学试验、微生物学试验、免疫学试验和动物试 验等。 1、细胞学实验 细胞学试验是利用某些霉菌毒素具有细胞毒性，对组织培养细胞具有毒性作 用，引起细胞变形、细胞数减少，形成巨细胞或引起细胞死亡等。 用来做细胞学试验的组织细胞有：1 日龄小鸡气管细胞；小牛肾细胞和鸡胚 细胞等。 2、微生物学试验 许多霉菌毒素起初都是作为抗菌素被发现的。微生物学实验就是利用某些霉 菌毒素的抑菌性能来测定其毒性。 常用的微生物有：巨大芽孢杆菌（Bacillus negaterium）、枯草杆菌(B. Su-btilis)、乳酸菌(Lactic acid bactria)。 由于不同霉菌毒素对不同动物、不同组织细胞的毒性不同，因此在结果分析 时应注意：微生物学试验不可能测定所有对脊椎动物有毒的毒素，特别是侵害脊 椎动物神经系统的毒素。同时，抑菌试验结果理想的毒素也不一定对脊椎动物有 毒性。 3、免疫学试验 免疫学试验是测定霉菌毒素的高特异性和高灵敏度的定性定量方法。目前已 用于测定赭曲霉毒素 A、T-2 毒素、黄曲霉毒素 B1 和 M1、玉米赤霉烯酮等。 免疫学试验包括放射免疫试验和酶联免疫吸附试验。 ⑴ 放射免疫试验（Radioimmunoassay, RIA） 放射免疫试验是将同位素技术的高灵敏与抗原抗体反映的高特异性结合起 来。其基本原理是放射性标记抗原与非标记抗原竞争性地和抗体结合，当样品中 的非标记抗原的量增加时，标记抗原与抗体形成的复合物的两减少，即样品中待 测抗原的量与标记抗原抗体复合物的量成反比。所以可根据标记抗原抗体复合物 的多少（放射性强度）来定量未知抗原
(2)酶联免疫吸附试验( Enzyme-linked Immunosorbent Assay, ELISA) 酶联免疫吸附试验的基本原理是酶标记抗原或抗体与相应的抗体或抗原后, 结合在免疫复合物上的酶遇到相应的底物,催化底物水解、氧化或还原,产生有 色物质,颜色的深浅与相应抗原或抗体的量成正比,借助颜色的深浅来定量抗原 或抗体 注意:霉菌毒素是一类半抗原,它们不能单独刺激机体产生抗体,必须将它 们和载体(如丙种球蛋白、卵清蛋白等)结合后,才具免疫原性。 4、动物试验 动物试验在霉菌毒素筛选中用得较多的有雏鸭试验和小白鼠子宫增重试验。 雏鸭试验用于黄曲霉毒素筛选。雏鸭对黄曲霉毒素特别敏感,当用含黄曲霉 毒素的饲料饲喂雏鸭或用其粗提取液注射时,可引起雏鸭死亡,并出现特征性的 病理组织学变化—一胆小管增生 小白鼠子宫増重试验用于玉米赤霉烯酮的筛选。玉米赤霉烯酮具有雌激素样 作用,当用含玉米赤霉烯酮的饲料饲喂小白鼠或用粗提取液注射时,可引起小白 鼠的子宫增大。 第二节饲料中常见产毒霉菌属的鉴定 霉菌的鉴定,是在于确定一种未知菌的分类地位和属名、种名。其鉴定的主 要依据是形态特征和培养性状 培养条件 由于霉菌在不同的培养条件下形态有所不同,所以在鉴定霉菌时,需要用固 定的培养条件。这些条件包括:特定的培养基、一定的培养温度和培养时间。 通常鉴定青霉和曲霉的标准培养基为察氏培养基,以麦牙汁琼脂培养基作为 辅助培养基。培养温度为23~25℃;培养时间:3~5天时进行显微观察,7~14 天时进行莓菌的形态特征观察
5 ⑵ 酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked Immunosorbent Assay，ELISA） 酶联免疫吸附试验的基本原理是酶标记抗原或抗体与相应的抗体或抗原后， 结合在免疫复合物上的酶遇到相应的底物，催化底物水解、氧化或还原，产生有 色物质，颜色的深浅与相应抗原或抗体的量成正比，借助颜色的深浅来定量抗原 或抗体。 注意：霉菌毒素是一类半抗原，它们不能单独刺激机体产生抗体，必须将它 们和载体（如丙种球蛋白、卵清蛋白等）结合后，才具免疫原性。 ４、动物试验 动物试验在霉菌毒素筛选中用得较多的有雏鸭试验和小白鼠子宫增重试验。 雏鸭试验用于黄曲霉毒素筛选。雏鸭对黄曲霉毒素特别敏感，当用含黄曲霉 毒素的饲料饲喂雏鸭或用其粗提取液注射时，可引起雏鸭死亡，并出现特征性的 病理组织学变化——胆小管增生。 小白鼠子宫增重试验用于玉米赤霉烯酮的筛选。玉米赤霉烯酮具有雌激素样 作用，当用含玉米赤霉烯酮的饲料饲喂小白鼠或用粗提取液注射时，可引起小白 鼠的子宫增大。 第二节 饲料中常见产毒霉菌属的鉴定 霉菌的鉴定，是在于确定一种未知菌的分类地位和属名、种名。其鉴定的主 要依据是形态特征和培养性状。 一、培养条件 由于霉菌在不同的培养条件下形态有所不同，所以在鉴定霉菌时，需要用固 定的培养条件。这些条件包括：特定的培养基、一定的培养温度和培养时间。 通常鉴定青霉和曲霉的标准培养基为察氏培养基，以麦牙汁琼脂培养基作为 辅助培养基。培养温度为 23～25℃；培养时间：3～5 天时进行显微观察，7～14 天时进行霉菌的形态特征观察
(1)察氏培养基( Capak agar,CA) 蔗糖 ugar 30 NaNO3 30g K2HPO4 1 MgSo4 7H20 0. 5g KCl 0. 5g FeSO. 7H20 0. 01g 琼脂20g蒸馏水1000ml 化学试剂为分析纯 边搅拌边煮沸至全部溶解成透明状,调节pH为44~4.6。15磅灭菌20 (2)麦牙汁琼脂培养基(低渗培养基, Beer wort) 麦牙浸膏20g葡萄糖20g蛋白胨1g 琼脂20g蒸馏水1000ml 将各种成分溶解水中,边加热边搅拌至培养基透明,10磅灭菌20min。 鉴定镰刀菌、根幂、毛霉和未知菌类的标准培养基为马铃薯葡萄糖培养基 和马铃薯蔗糖培养基,培养温度为23~25℃,培养3~4天镜检,7~8天肉眼观 察 马铃薯葡萄糖培养基(PDA) 干净新鲜去皮的马铃薯200~300g葡萄糖20g 琼脂20g蒸馏水1000ml 将马铃薯切成小块,加水1000ml煮沸15min,用双层纱布过滤后加葡萄糖 和琼脂各20g,边加热边搅拌至琼脂溶化,加水补足至液体1000m,并调节pH 至5.5。 马铃薯蔗糖培养基的成分和配制方法与PDA相似,只需将葡萄糖改为蔗糖 其它霉菌多用察氏培养基和PDA培养基。 有些霉菌要求特殊培养时,也可采用特殊的选择性培养基。 二、培养方法 6
6 ⑴ 察氏培养基（Capak agar，CA） 蔗糖 Sugar 30g NaNO3 30g K2HPO4 1g MgSO4.7H2O 0.5g KCl 0.5g FeSO4.7H2O 0.01g 琼脂 20g 蒸馏水 1000ml 化学试剂为分析纯 边搅拌边煮沸至全部溶解成透明状，调节 pH 为 4.4～4.6。１５磅灭菌２０ min。 ⑵ 麦牙汁琼脂培养基（低渗培养基，Beer wort） 麦牙浸膏 20g 葡萄糖 20g 蛋白胨 1g 琼脂 20g 蒸馏水 1000ml 将各种成分溶解水中，边加热边搅拌至培养基透明，10 磅灭菌 20min。 鉴定镰刀菌、根霉、毛霉和未知菌类的标准培养基为马铃薯葡萄糖培养基 和马铃薯蔗糖培养基，培养温度为 23～25℃，培养 3～4 天镜检，7～8 天肉眼观 察。 马铃薯葡萄糖培养基（PDA） 干净新鲜去皮的马铃薯 200～300g 葡萄糖 20g 琼脂 20g 蒸馏水 1000ml 将马铃薯切成小块，加水 1000ml 煮沸 15min，用双层纱布过滤后加葡萄糖 和琼脂各 20g，边加热边搅拌至琼脂溶化，加水补足至液体 1000ml，并调节 pH 至 5.5。 马铃薯蔗糖培养基的成分和配制方法与 PDA 相似，只需将葡萄糖改为蔗糖 即可。 其它霉菌多用察氏培养基和 PDA 培养基。 有些霉菌要求特殊培养时，也可采用特殊的选择性培养基。 二、培养方法
霉菌鉴定时的培养方法主要有平板培养法和载片培养法两种。 1、平板培养法系将纯化的霉菌接种于标准培养基平板,然后用一定的条 件培养、制片观察。制片方法是滴一滴乳酸苯酚液于干洁载玻片中央,用接种针 从培养基上挑取少量典型材料(近菌落边缘包括菌丝和孢子的材料)置于液滴中, 并将材料小心撕开,全部润湿,然后盖上盖玻片并轻轻按压,即成。 乳酸苯酚液的组成和配制方法如下 苯酚10g乳酸10ml甘油20ml蒸馏水10ml 先将苯酚加入10m水中,加热至溶解后,再加入乳酸和甘油,混匀,即可。 对于产生极小而易碎孢子梗的真菌,制片观察很难看到完整而清楚的分生 孢子头,为此可采用载片培养法。 2、载片培养法 系于培养皿底铺一圆形滤纸,纸上放一“U”型玻棒,其上再放一载玻片, 培养皿内加入5m左右水,盖好后灭菌。以无菌操作法切取lcm2平板培养基, 并移至载玻片中央,培养基四周接种霉菌材料,盖上已灭菌的盖玻片,再盖好培 养皿,于一定条件下培养,在培养适当时间后取出,置低倍显微镜下观察。 此法不仅能解决制片困难,而且对菌丝分枝、着生状态和分生孢子头等观 察也可获得较为满意的效果。 三、莓菌鉴定的主要项目 霉菌鉴定的主要依据是形态特征和培养性状。因此,其鉴定的主要项目包 括培养性状和形态特征观察。 1、肉眼观察 接种的平板,在培养过程中,需要在一定时间进行肉眼观察(必要时,可 借助放大镜),并详细地记录菌落的外观。 (1)生长速度:记录菌落生长的快、中、慢、极慢,一般用培养两周时菌落 的直径(cm)表示。 (2)菌落的颜色:这是霉菌菌种鉴定的重要依据之一。包括霉菌菌落本身的 颜色和培养基的颜色。菌落本身的颜色是指菌丝、分生孢子梗、顶囊或分生孢子、 7
7 霉菌鉴定时的培养方法主要有平板培养法和载片培养法两种。 1、平板培养法 系将纯化的霉菌接种于标准培养基平板，然后用一定的条 件培养、制片观察。制片方法是滴一滴乳酸苯酚液于干洁载玻片中央，用接种针 从培养基上挑取少量典型材料（近菌落边缘包括菌丝和孢子的材料）置于液滴中， 并将材料小心撕开，全部润湿，然后盖上盖玻片并轻轻按压，即成。 乳酸苯酚液的组成和配制方法如下： 苯酚 10g 乳酸 10ml 甘油 20ml 蒸馏水 10ml 先将苯酚加入 10ml 水中，加热至溶解后，再加入乳酸和甘油，混匀，即可。 对于产生极小而易碎孢子梗的真菌，制片观察很难看到完整而清楚的分生 孢子头，为此可采用载片培养法。 2、载片培养法 系于培养皿底铺一圆形滤纸，纸上放一“U”型玻棒，其上再放一载玻片， 培养皿内加入 5ml 左右水，盖好后灭菌。以无菌操作法切取 1cm2 平板培养基， 并移至载玻片中央，培养基四周接种霉菌材料，盖上已灭菌的盖玻片，再盖好培 养皿，于一定条件下培养，在培养适当时间后取出，置低倍显微镜下观察。 此法不仅能解决制片困难，而且对菌丝分枝、着生状态和分生孢子头等观 察也可获得较为满意的效果。 三、霉菌鉴定的主要项目 霉菌鉴定的主要依据是形态特征和培养性状。因此，其鉴定的主要项目包 括培养性状和形态特征观察。 1、肉眼观察 接种的平板，在培养过程中，需要在一定时间进行肉眼观察（必要时，可 借助放大镜），并详细地记录菌落的外观。 ⑴ 生长速度：记录菌落生长的快、中、慢、极慢，一般用培养两周时菌落 的直径（cm）表示。 ⑵ 菌落的颜色：这是霉菌菌种鉴定的重要依据之一。包括霉菌菌落本身的 颜色和培养基的颜色。菌落本身的颜色是指菌丝、分生孢子梗、顶囊或分生孢子
分生孢子头的颜色;培养基颜色是指霉菌产生的色素使培养基出现的变化,与培 养基的成分也有一定的关系。 (3)菌落的表面:气生菌丝生长疏松或致密;平坦、隆起、凹陷或有皱,有 无同心环或放射沟纹;边缘是否整齐,是全缘的、锯齿状的,还是树枝状和纤毛 状等。 (4)菌落的质地:指菌落的外观似毡状、绒状、棉絮状、羊毛状、束状、粉 粒状、明胶状或皮革状等 (5)渗出液:有些菌种常常在菌落表面出现带颜色的液滴。观察时应注意其 色调和分泌的数量。 (6)气味:许多菌株在培养过程中有明显的气味,如霉味、土气味和芳香 味等,有时可作诶鉴定的参考 2、显微镜检査 霉菌的显微镜检查时主要须注意以下几项内容: (1)菌丝:菌丝的宽度、有无横隔、色泽、特殊的菌丝器官如假根、足细胞 菌丝是构成霉菌营养体的基本单位是菌丝。 菌丝是一种管状的细丝,把它放在显微镜下观察,很像一根透明胶管,它 的直径一般为几十微米,比细菌和放线菌的细胞约粗几倍到几十倍。菌丝可伸长 并产生分枝,许多分枝的菌丝相互交织在一起,就叫菌丝体。 根据菌丝中是否存在隔膜,可把霉菌菌丝分成无隔膜菌丝和有隔膜菌丝两 种类型。无隔膜菌丝:菌丝中无隔膜,整团菌丝体就是一个单细胞,其中含有多 个细胞核。这是低等真菌(即鞭毛菌亚门和接合菌亚门中的霉菌)所具有的菌丝 类型。有隔膜菌丝:菌丝中有隔膜,被隔膜隔开的一段菌丝就是一个细胞,菌丝 体由很多个细胞组成,每个细胞内有个或多个细胞核。在隔膜上有至多个小孔, 使细胞之间的细胞质和营养物质可以相互沟通。这是高等真菌(即子囊菌亚门和 半知菌亚门中的霉菌)所具有的菌丝类型
8 分生孢子头的颜色；培养基颜色是指霉菌产生的色素使培养基出现的变化，与培 养基的成分也有一定的关系。 ⑶ 菌落的表面：气生菌丝生长疏松或致密；平坦、隆起、凹陷或有皱，有 无同心环或放射沟纹；边缘是否整齐，是全缘的、锯齿状的，还是树枝状和纤毛 状等。 ⑷ 菌落的质地：指菌落的外观似毡状、绒状、棉絮状、羊毛状、束状、粉 粒状、明胶状或皮革状等。 ⑸ 渗出液：有些菌种常常在菌落表面出现带颜色的液滴。观察时应注意其 色调和分泌的数量。 ⑹ 气味：许多菌株在培养过程中有明显的 气味，如霉味、土气味和芳香 味等，有时可作诶鉴定的参考。 2、显微镜检查 霉菌的显微镜检查时主要须注意以下几项内容： ⑴ 菌丝：菌丝的宽度、有无横隔、色泽、特殊的菌丝器官如假根、足细胞 等。 菌丝是构成霉菌营养体的基本单位是菌丝。 菌丝是一种管状的细丝，把它放在显微镜下观察，很像一根透明胶管，它 的直径一般为几十微米，比细菌和放线菌的细胞约粗几倍到几十倍。菌丝可伸长 并产生分枝，许多分枝的菌丝相互交织在一起，就叫菌丝体。 根据菌丝中是否存在隔膜，可把霉菌菌丝分成无隔膜菌丝和有隔膜菌丝两 种类型。无隔膜菌丝：菌丝中无隔膜，整团菌丝体就是一个单细胞，其中含有多 个细胞核。这是低等真菌（即鞭毛菌亚门和接合菌亚门中的霉菌）所具有的菌丝 类型。有隔膜菌丝：菌丝中有隔膜，被隔膜隔开的一段菌丝就是一个细胞，菌丝 体由很多个细胞组成，每个细胞内有个或多个细胞核。在隔膜上有至多个小孔， 使细胞之间的细胞质和营养物质可以相互沟通。这是高等真菌（即子囊菌亚门和 半知菌亚门中的霉菌）所具有的菌丝类型
图2-16霉菌菌丝 4,无丝B,有核苗 霉菌菌丝的变态:为适应不同的环境条件和更有效地摄取营养满足生长发育 的需要,许多霉菌的菌丝可以分化成一些特殊的形态和组织,这种特化的形态称 为菌丝变态。 假根:根霉属霉菌的菌丝与营养基质接触处分化出的根状结构,有固着和吸 收养料的功能 子囊 一轴 篇枝 菌网和菌环:某些捕食性霉菌的菌丝变态成环状或网状,用于捕捉其它小生 物如线虫、草履虫等。 左图:霉菌的菌环和菌网a菌环;b.简单菌网:c.复杂菌网 菌核:大量菌丝集聚成的紧密组织,是一种休眠体,可抵抗不良的环境条
9 霉菌菌丝的变态：为适应不同的环境条件和更有效地摄取营养满足生长发育 的需要，许多霉菌的菌丝可以分化成一些特殊的形态和组织，这种特化的形态称 为菌丝变态。 假根：根霉属霉菌的菌丝与营养基质接触处分化出的根状结构，有固着和吸 收养料的功能。 菌网和菌环：某些捕食性霉菌的菌丝变态成环状或网状，用于捕捉其它小生 物如线虫、草履虫等。 左图：霉菌的菌环和菌网 a.菌环；b.简单菌网；c.复杂菌网 菌核：大量菌丝集聚成的紧密组织，是一种休眠体，可抵抗不良的环境条
件。其外层组织坚硬,颜色较深:内层疏松,大多呈白色。如药用的茯苓、麦角 都是菌核 左图:麦角菌的菌核 子实体:是由大量气生菌丝体特化而成,子实体是指在里面或上面可产生 孢子的、有一定形状的任何构造。例如有三类能产有性孢子的结构复杂的子实体, 分别称为闭囊壳、子囊壳和子囊盘。 (2)繁殖体:各种孢子的大小、形态、色泽及产孢子结构如分生孢子、后壁 孢子、包囊孢子、子囊孢子、分生孢子头、子囊、子座等。 霉菌有着极强的繁殖能力,而且繁殖方式也是多种多样的。虽然霉菌菌丝 体上任一片段在适宜条件下都能发展成新个体,但在自然界中,霉菌主要依靠产 生形形色色的无性或有性孢子进行繁殖。孢子像植物的种子,不过数量特别多, 特别小。 霉菌的无性孢子直接由生殖菌丝分化而形成,常见的有节孢子、厚垣孢子、 孢囊孢子和分生孢子。 节孢子:菌丝生长到一定阶段时出现横隔膜,然后从隔膜处断裂而形成的 细胞称为节孢子。如产生的节孢子。 白地霉的节孢子
10 件。其外层组织坚硬，颜色较深；内层疏松，大多呈白色。如药用的茯苓、麦角 都是菌核。. 左图：麦角菌的菌核 子实体：是由大量气生菌丝体特化而成，子实体是指在里面或上面可产生 孢子的、有一定形状的任何构造。例如有三类能产有性孢子的结构复杂的子实体， 分别称为闭囊壳、子囊壳和子囊盘。 ⑵ 繁殖体：各种孢子的大小、形态、色泽及产孢子结构如分生孢子、后壁 孢子、包囊孢子、子囊孢子、分生孢子头、子囊、子座等。 霉菌有着极强的繁殖能力，而且繁殖方式也是多种多样的。虽然霉菌菌丝 体上任一片段在适宜条件下都能发展成新个体，但在自然界中，霉菌主要依靠产 生形形色色的无性或有性孢子进行繁殖。孢子像植物的种子，不过数量特别多， 特别小。 霉菌的无性孢子直接由生殖菌丝分化而形成，常见的有节孢子、厚垣孢子、 孢囊孢子和分生孢子。 节孢子：菌丝生长到一定阶段时出现横隔膜，然后从隔膜处断裂而形成的 细胞称为节孢子。如产生的节孢子。 白地霉的节孢子