蚌埠医科大学（蚌埠医学院）：《生物化学》课程教学资源（实验指导）第一部分生物化学技术概论.doc_大学文库

第一部分生物化学技术概论本部分内容为生物化学实验中所涉及的主要技术原理、实验记录和实验报告的书写，介绍如何正确记录实验过程及书写实验报告的一般规则，是训练学生进行正规实验操作的重要内容。普通实验技术包括玻璃仪器的洗涤、洗液的配制、吸量管的使用、样品的混匀以及过滤、离心等一般实验室技术。实验样品的制备着重讨论在生物化学实验中，血液、尿液、样品及组织材料的采集和处理，匀浆制备和组织浸出液制备。离心分离技术、电泳原理、分光分析、层析分析和放射性同位素技术，重点讨论这些重要技术的原理，内容则尽可能简洁扼要，作为具体实验内容的参考。 §1实验记录和实验报告的书写实验是在理论指导下的科学实践，目的在于经过实践，掌握科学观察的基本方法和技能，培养学生的科学思维、分析判断和解决实际问题的能力，也是培养探求真知、尊重科学事实和真理的学风，以及培养科学态度的重要环节。为此，要求学生在实验之前必须预习、理解基本原理和实验基本操作步骤、注意事项，列出所需试剂和仪器，实验中组织安排好时间，严肃认真地进行操作，细致观察变化，如实作好记录、书写实验报告等。一、实验记录 1.实验记录要整洁、字迹清楚。 2。实验中观察到的现象、结果和数据，要及时地直接记在记录本上，原始记录必须准确简练、详尽、清楚。 3.记录时，应做到如实正确记录实验结果，不可夹杂主观因素。在实验条件下观察到的现象，也应如实仔细地记录下来。在定量实验中观察到的数据，如称量物的重量、滴定管的读数、分光光度计的光密度值等，都应设计一定的表格准确记录，并应根据仪器的精确度准确记录有效数字。要求对实验的每个结果都应准确无遗漏地做好记录。 4.实验中使用仪器的类型、试剂的规格、化学反应式、分子量、浓度等，都应记录清楚。 5.实验过程中，应一丝不荷，努力培养亚谨的科学作风。 6。完整的实验记录应包括日期、实验题目、目的、操作、结果等。二、实验报告 1.实验结束后，应及时整理和总结实验结果及记录，写出实验报告

第一部分生物化学技术概论本部分内容为生物化学实验中所涉及的主要技术原理、实验记录和实验报告的书写，介绍如何正确记录实验过程及书写实验报告的一般规则，是训练学生进行正规实验操作的重要内容。普通实验技术包括玻璃仪器的洗涤、洗液的配制、吸量管的使用、样品的混匀以及过滤、离心等一般实验室技术。实验样品的制备着重讨论在生物化学实验中，血液、尿液、样品及组织材料的采集和处理，匀浆制备和组织浸出液制备。离心分离技术、电泳原理、分光分析、层析分析和放射性同位素技术，重点讨论这些重要技术的原理，内容则尽可能简洁扼要，作为具体实验内容的参考。 §1 实验记录和实验报告的书写实验是在理论指导下的科学实践，目的在于经过实践，掌握科学观察的基本方法和技能，培养学生的科学思维、分析判断和解决实际问题的能力，也是培养探求真知、尊重科学事实和真理的学风，以及培养科学态度的重要环节。为此，要求学生在实验之前必须预习、理解基本原理和实验基本操作步骤、注意事项，列出所需试剂和仪器，实验中组织安排好时间，严肃认真地进行操作，细致观察变化，如实作好记录、书写实验报告等。一、实验记录 1. 实验记录要整洁、字迹清楚。 2. 实验中观察到的现象、结果和数据，要及时地直接记在记录本上，原始记录必须准确简练、详尽、清楚。 3. 记录时，应做到如实正确记录实验结果，不可夹杂主观因素。在实验条件下观察到的现象，也应如实仔细地记录下来。在定量实验中观察到的数据，如称量物的重量、滴定管的读数、分光光度计的光密度值等，都应设计一定的表格准确记录，并应根据仪器的精确度准确记录有效数字。要求对实验的每个结果都应准确无遗漏地做好记录。 4. 实验中使用仪器的类型、试剂的规格、化学反应式、分子量、浓度等，都应记录清楚。 5. 实验过程中，应一丝不苟，努力培养严谨的科学作风。 6. 完整的实验记录应包括日期、实验题目、目的、操作、结果等。二、实验报告 1. 实验结束后，应及时整理和总结实验结果及记录，写出实验报告

2.实验报告应包括实验名称、实验日期、目的要求、原理、试剂配制、仪器设备、操作方法、实验结果、讨论等项内容。 3.书写实验报告时，目的和要求、原理以及操作方法部分应作简单扼要的叙述，但对实验条件和操作的关键环节必须写清楚。对于实验结果部分，应根据实验的要求，把所得的实验结果和数据进行整理、归纳、分析和对比，并尽量总结成各种图表，如标准曲线图以及实验组与对照组实验结果的比较表。还应针对实验结果进行必要的说明和分析。讨论部分不是对结果的重述，而是对实验方法、实验结果和异常现象进行探讨和评论，以及对于实验设计的认识、体会和建议。 4.一般实验，要有结论，结论要简单扼要，说明本次实验所获得的结果。 §2普通实验技术一、玻璃仪器的洗涤与清洁玻璃仪器是生物化学实验中不可缺少的器具，玻璃仪器的清洁与否，直接影响实验效果的准确性。因此，玻璃仪器的清洁工作是很重要的。 (一)新购玻璃仪器的清洗新购来的玻璃仪器，其表面附有游离碱质，可先用肥皂水洗刷，再用流水冲洗，浸泡于 1~2%H0中过夜，再用流水冲洗，最后用蒸馏水冲洗2~3次，在干燥箱中烤干或晾干备用。 (二)使用过的玻璃仪器清洗 1.一般玻璃仪器：如试管、烧杯、维形瓶等，先用自来水洗刷至无污物，再选用大小合适的毛刷蘸取洗衣粉或肥皂水，将器皿内、外壁细心刷洗，再用自来水冲洗干净，洗至容器内壁光洁不挂水珠为止，最后用蒸馏水冲洗2一3次，倒置在清洁处晾干，急用时可用干燥箱烤干。 2.容量仪器：吸量管、滴定管、容量瓶等，使用后应立即浸泡于清水中，勿使玷污物质干湖，并及时用流水冲洗干净，稍干后再用铬酸洗液浸泡数小时，然后用自来水反复冲洗干净，最后用蒸馏水冲洗2一3次，晾干备用。 3.比色杯：用毕立即用自来水反复冲洗干净。如洗不净时，可用盐酸或适当溶剂冲洗，再用自来水冲洗干净。切忌用试管刷、粗糙的布或纸擦洗，以免损坏比色杯透光度，亦应避免用较强的碱液或强氧化剂清洗，洗净后，倒置晾干备用二、清洗液的原理和配制

2. 实验报告应包括实验名称、实验日期、目的要求、原理、试剂配制、仪器设备、操作方法、实验结果、讨论等项内容。 3. 书写实验报告时，目的和要求、原理以及操作方法部分应作简单扼要的叙述，但对实验条件和操作的关键环节必须写清楚。对于实验结果部分，应根据实验的要求，把所得的实验结果和数据进行整理、归纳、分析和对比，并尽量总结成各种图表，如标准曲线图以及实验组与对照组实验结果的比较表。还应针对实验结果进行必要的说明和分析。讨论部分不是对结果的重述，而是对实验方法、实验结果和异常现象进行探讨和评论，以及对于实验设计的认识、体会和建议。 4.一般实验，要有结论，结论要简单扼要，说明本次实验所获得的结果。 §2 普通实验技术一、玻璃仪器的洗涤与清洁玻璃仪器是生物化学实验中不可缺少的器具，玻璃仪器的清洁与否，直接影响实验效果的准确性。因此，玻璃仪器的清洁工作是很重要的。（一）新购玻璃仪器的清洗新购来的玻璃仪器，其表面附有游离碱质，可先用肥皂水洗刷，再用流水冲洗,浸泡于 1~2％ HCl 中过夜，再用流水冲洗，最后用蒸馏水冲洗 2~3 次，在干燥箱中烤干或晾干备用。（二）使用过的玻璃仪器清洗 1. 一般玻璃仪器：如试管、烧杯、锥形瓶等，先用自来水洗刷至无污物，再选用大小合适的毛刷蘸取洗衣粉或肥皂水，将器皿内、外壁细心刷洗，再用自来水冲洗干净，洗至容器内壁光洁不挂水珠为止，最后用蒸馏水冲洗 2～3 次，倒置在清洁处晾干，急用时可用干燥箱烤干。 2. 容量仪器：吸量管、滴定管、容量瓶等，使用后应立即浸泡于清水中，勿使玷污物质干涸，并及时用流水冲洗干净，稍干后再用铬酸洗液浸泡数小时，然后用自来水反复冲洗干净，最后用蒸馏水冲洗 2～3 次，晾干备用。 3. 比色杯：用毕立即用自来水反复冲洗干净。如洗不净时，可用盐酸或适当溶剂冲洗，再用自来水冲洗干净。切忌用试管刷、粗糙的布或纸擦洗，以免损坏比色杯透光度，亦应避免用较强的碱液或强氧化剂清洗，洗净后，倒置晾干备用。二、清洗液的原理和配制

(一)肥皂水、洗衣粉溶液和去污粉，是最常用的洗涤剂，有乳化作用，可除去污垢，能使脂肪、蛋白质及其它粘着性物质溶解或松弛，一般玻璃仪器可直接用肥皂水浸泡或刷洗。 (二)铬酸洗液 1,原理：铬酸洗液由重铬酸钾（或重铬酸钠）和浓硫酸配制而成，其清洁效力主要应用其强氧化性和强酸性。铬酐越多，硫酸越浓，其清洁效力也就越强，当洗液变绿色后则不宜应用。一HCr0+KS0: 2Cr0,铬酐（红色）+H0 C,0(绿色)十3O) hS04→H0+S02十(O) 2.配制：称取重铬酸钾g放于250ml烧杯中，加热水5ml搅拌，使其尽量溶解，烧杯下垫一石棉网以防过热，然后慢慢加入工业用浓硫酸100ml,随加随搅拌，尽量避免红色铬酐沉淀析出。此时溶液由红黄色变成黑褐色。冷却后，储于指定容器内盖紧以防吸水。 3.使用：应用洗液前必须将玻璃仪器用自来水冲洗数次，并将仪器上的水分尽量除去，再放入洗液中浸泡，数小时后取出仪器，用自来水充分冲洗至无洗液为止（冲洗时注意勿将洗液溅出水槽)，再用少量蒸馏水冲洗数次，晾干备用。上述两种洗涤液是最常用的，实验中通到一些特殊污物，需用针对性强的洗涤液。 (三)磷酸三钠洗液为5%NaP0·12H0水溶液，此液为碱性，可洗涤油污物，但所洗的仪器不适于作磷的测定。 (四)乙二胺四乙酸二钠洗液(EDTA洗液)为5%~10%的EDTA洗液，加热煮沸可洗脱玻璃内壁的钙镁盐类白色沉淀和不易溶解的重金属盐类。 (五)尿素洗液为45%尿素水溶液，用来洗血污，为蛋白质的最好溶剂。 (六)草酸洗涤液可洗脱高锰酸钾的痕迹，用时加少量硫酸效果更好。 (七)盐酸一酒精洗液3%盐酸酒精液，可除去玻璃器皿上的染料附着物。三、吸量管的种类和使用吸量管是生化实验中常用的仪器，测定的准确度与吸量管的正确使用密切相关。 (一)分类生化实验常用的吸量管有三类（图1）：

（一）肥皂水、洗衣粉溶液和去污粉，是最常用的洗涤剂，有乳化作用，可除去污垢，能使脂肪、蛋白质及其它粘着性物质溶解或松弛，一般玻璃仪器可直接用肥皂水浸泡或刷洗。（二）铬酸洗液 1. 原理：铬酸洗液由重铬酸钾（或重铬酸钠）和浓硫酸配制而成，其清洁效力主要应用其强氧化性和强酸性。铬酐越多，硫酸越浓，其清洁效力也就越强，当洗液变绿色后则不宜应用。 2. 配制：称取重铬酸钾 5g 放于 250ml 烧杯中，加热水 5ml 搅拌，使其尽量溶解，烧杯下垫一石棉网以防过热，然后慢慢加入工业用浓硫酸 100ml，随加随搅拌，尽量避免红色铬酐沉淀析出。此时溶液由红黄色变成黑褐色。冷却后，储于指定容器内盖紧以防吸水。 3. 使用：应用洗液前必须将玻璃仪器用自来水冲洗数次，并将仪器上的水分尽量除去，再放入洗液中浸泡，数小时后取出仪器，用自来水充分冲洗至无洗液为止（冲洗时注意勿将洗液溅出水槽），再用少量蒸馏水冲洗数次，晾干备用。上述两种洗涤液是最常用的，实验中遇到一些特殊污物，需用针对性强的洗涤液。（三）磷酸三钠洗液为 5 ％Na3PO4·12H2O 水溶液，此液为碱性，可洗涤油污物，但所洗的仪器不适于作磷的测定。（四）乙二胺四乙酸二钠洗液（EDTA 洗液）为 5 %～10 ％的 EDTA 洗液，加热煮沸可洗脱玻璃内壁的钙镁盐类白色沉淀和不易溶解的重金属盐类。（五）尿素洗液为 45 ％尿素水溶液，用来洗血污，为蛋白质的最好溶剂。（六）草酸洗涤液可洗脱高锰酸钾的痕迹，用时加少量硫酸效果更好。（七）盐酸—酒精洗液 3 ％盐酸酒精液，可除去玻璃器皿上的染料附着物。三、吸量管的种类和使用吸量管是生化实验中常用的仪器，测定的准确度与吸量管的正确使用密切相关。（一）分类生化实验常用的吸量管有三类（图 1）： K2Cr2O7＋H2SO4 H2Cr2O7＋K2SO4 2CrO3 铬酐（红色）＋H2O Cr2O3(绿色)＋3(O) H2SO4 H2O＋SO2＋(O)

从吸量管下口流出。 4.调准刻度：将吸量管提出液面，吸粘性较大的液体时，先用滤纸擦干管尖外壁：然后用食指控制液体使之缓慢下降，当至所需刻度时，立即按紧吸量管上口（此时液体凹面、视线和刻度应在同一水平面上)。 5放液：放松食指，让液体自然流入容器内，放液时，管尖最好接触容器内壁，但不要插入容器内原有的液体中，以免污染吸量管和试剂。 6洗涤：吸取血液、血清等粘稠液体及尿液标本的吸量管，使用后要及时用自来水冲洗干净：吸一般试剂的吸量管可不必马上冲洗，实验完毕后再冲洗。冲洗干净后，晾干，再浸泡于铬酸洗液中，数小时后取出，再用流水冲净，最后用蒸馏水冲洗，晾干备用。四、溶液的混匀样品与试剂的混匀是保证化学反应充分进行的一种有效措施。为使反应体系内各物质迅速地互相接触，必须借助于外加的机械作用。混匀时须防止容器内液体溅出或被污染。严禁用手指直接堵塞试管口或锥形瓶口振摇。混匀的方式大致有以下几种，可随使用的器皿和液体容量而选用。 (一)旋转混匀法用手持容器，使溶液作离心旋转，适用于未盛满液体的试管或小口器皿，如锥形瓶。旋转试管时最好用手腕旋转。 (二)指弹混匀法左手持试管上瑞，用右手指轻轻弹动试管下部，使管内溶液作旋涡运动。 (三)倒转混匀法适用于有塞量筒和容量瓶、试管内容物的混匀。一般试管内容物的混匀可用聚乙烯等薄膜封口，再用手按住管口倒转混匀。 (四)吸管混匀法用吸量管将溶液反复吸放数次，使溶液充分混匀。 (五)玻棒搅动法适用于烧杯内容物的混匀，如固体试剂的溶解和混匀 (六)甩动混匀法右手持试管上部，轻轻甩动振摇，即可混匀。 (七)电碰搅拌混匀法在电磁搅拌机上放置烧杯，在烧杯内放入封闭于玻璃或塑料管中的小铁棒，利用磁力使小铁棒旋转以达到混匀杯中液体的目的，适用于酸碱自动滴定， pH梯度滴定等。 (八)振荡器混匀法利用振荡器使容器中的内容物振荡，达到混匀的目的。五、过滤是分离沉淀和滤液的一种方法，可用于收集滤液，收集或洗涤沉淀。生化实验的过滤，操作与化学实验中的操作相同，应注意以下几点：

从吸量管下口流出。 4.调准刻度：将吸量管提出液面，吸粘性较大的液体时，先用滤纸擦干管尖外壁；然后用食指控制液体使之缓慢下降，当至所需刻度时，立即按紧吸量管上口（此时液体凹面、视线和刻度应在同一水平面上）。 5.放液：放松食指，让液体自然流入容器内，放液时，管尖最好接触容器内壁，但不要插入容器内原有的液体中，以免污染吸量管和试剂。 6.洗涤：吸取血液、血清等粘稠液体及尿液标本的吸量管，使用后要及时用自来水冲洗干净；吸一般试剂的吸量管可不必马上冲洗，实验完毕后再冲洗。冲洗干净后，晾干，再浸泡于铬酸洗液中，数小时后取出，再用流水冲净，最后用蒸馏水冲洗，晾干备用。四、溶液的混匀样品与试剂的混匀是保证化学反应充分进行的一种有效措施。为使反应体系内各物质迅速地互相接触，必须借助于外加的机械作用。混匀时须防止容器内液体溅出或被污染。严禁用手指直接堵塞试管口或锥形瓶口振摇。混匀的方式大致有以下几种，可随使用的器皿和液体容量而选用。（一）旋转混匀法用手持容器，使溶液作离心旋转，适用于未盛满液体的试管或小口器皿，如锥形瓶。旋转试管时最好用手腕旋转。（二）指弹混匀法左手持试管上端，用右手指轻轻弹动试管下部，使管内溶液作旋涡运动。（三）倒转混匀法适用于有塞量筒和容量瓶、试管内容物的混匀。一般试管内容物的混匀可用聚乙烯等薄膜封口，再用手按住管口倒转混匀。（四）吸管混匀法用吸量管将溶液反复吸放数次，使溶液充分混匀。（五）玻棒搅动法适用于烧杯内容物的混匀，如固体试剂的溶解和混匀。（六）甩动混匀法右手持试管上部，轻轻甩动振摇，即可混匀。（七）电磁搅拌混匀法在电磁搅拌机上放置烧杯，在烧杯内放入封闭于玻璃或塑料管中的小铁棒，利用磁力使小铁棒旋转以达到混匀杯中液体的目的，适用于酸碱自动滴定， pH 梯度滴定等。（八）振荡器混匀法利用振荡器使容器中的内容物振荡，达到混匀的目的。五、过滤是分离沉淀和滤液的一种方法，可用于收集滤液，收集或洗涤沉淀。生化实验的过滤，操作与化学实验中的操作相同，应注意以下几点：

(一)制备血滤液等实验过滤时，要用干滤纸而不能用水把滤纸弄湿，因为湿滤纸会影响血液稀释的体积。 (二)折叠滤纸与漏斗壁完全吻合，不留缝隙。一般采用平折法（即对折后再对折）。 (三)向漏斗中加溶液时最好使用玻棒引流，倒入速度不要太快，不得使液面超过滤纸上缘。 (四)组织匀浆等较粗样品的过滤可用脱脂棉或纱布代替滤纸，有时可用离心沉淀法代替过滤法。六、离心机的使用方法欲使沉淀与溶液分开，过滤和离心都可达到目的，但当沉淀粘稠、颗粒太小且能通过滤纸或总容量太少又需定量测定时，使用离心沉淀法优于过滤法。使用离心机前，应检查离心机转动状态是否平稳，以确定离心机的性能：检查套管与离心管大小是否相配，套管是否铺好软垫（用棉药或橡皮），检查套管底部应无碎玻璃片或漏缝。检查合格后，将一对离心管放入一对套管中，然后连套管一起分置粗天平两侧，用滴管向较轻的一侧离心管与套管之间加水，直至天平两侧彼此相等为止。将各对平衡的套管连同内容物放置于离心机内，两个等重的离心管必须放于对称位置。放妥后，接通电源开关，逐步扭动转速旋钮，缓慢增加离心机转速，直到所需的转速。达规定时间后，将转速旋钮逐步调回零，待离心机停稳后，取出离心管。 §3实验样品的制备在生物化学实验中，无论是分析组织中各种物质的含量，或是探索组织中的物质代谢过程，都需要利用预先处理过的特定生物样品。掌握实验样品的正确处理与制备方法是做好生物化学实验的先决条件。在基础生物化学实验中，最常用的实验样品是人或动物的血、尿和组织等。血样品常采用全血、血浆、血清或无蛋白血滤液。组织样品则常用动物的肝、肾、胰、胃粘膜或肌肉等组织。现将这些样品的制备方法扼要介绍如下：一、血液样品

（一）制备血滤液等实验过滤时，要用干滤纸而不能用水把滤纸弄湿，因为湿滤纸会影响血液稀释的体积。（二）折叠滤纸与漏斗壁完全吻合，不留缝隙。一般采用平折法（即对折后再对折）。（三）向漏斗中加溶液时最好使用玻棒引流，倒入速度不要太快，不得使液面超过滤纸上缘。（四）组织匀浆等较粗样品的过滤可用脱脂棉或纱布代替滤纸，有时可用离心沉淀法代替过滤法。六、离心机的使用方法欲使沉淀与溶液分开，过滤和离心都可达到目的，但当沉淀粘稠、颗粒太小且能通过滤纸或总容量太少又需定量测定时，使用离心沉淀法优于过滤法。使用离心机前，应检查离心机转动状态是否平稳，以确定离心机的性能；检查套管与离心管大小是否相配，套管是否铺好软垫（用棉药或橡皮），检查套管底部应无碎玻璃片或漏缝。检查合格后，将一对离心管放入一对套管中，然后连套管一起分置粗天平两侧，用滴管向较轻的一侧离心管与套管之间加水，直至天平两侧彼此相等为止。将各对平衡的套管连同内容物放置于离心机内，两个等重的离心管必须放于对称位置。放妥后，接通电源开关，逐步扭动转速旋钮，缓慢增加离心机转速，直到所需的转速。达规定时间后，将转速旋钮逐步调回零，待离心机停稳后，取出离心管。 §3 实验样品的制备在生物化学实验中，无论是分析组织中各种物质的含量，或是探索组织中的物质代谢过程，都需要利用预先处理过的特定生物样品。掌握实验样品的正确处理与制备方法是做好生物化学实验的先决条件。在基础生物化学实验中，最常用的实验样品是人或动物的血、尿和组织等。血样品常采用全血、血浆、血清或无蛋白血滤液。组织样品则常用动物的肝、肾、胰、胃粘膜或肌肉等组织。现将这些样品的制备方法扼要介绍如下：一、血液样品

收集动物或人的血液时应使用清洁干燥的试管或器皿，以防止溶血 (一)全血取出血液后，迅速置于含有抗凝剂的试管内，同时轻轻混匀，使血液和抗凝剂充分混合，以免血液凝固。取得的全血如不能立即进行实验，应储存于冰箱中。常用的抗凝剂有草酸盐、柠檬酸盐、氟化钠等，根据实验的要求而定，一般情况下使用肝素钠或肝素。抗凝剂的用量不宜过多，以免影响实验结果。通常每毫升血液加草酸盐 1-2mg,柠檬酸钠5mg或氟化钠5~10mg,肝素仅需要0.01-0.2mg。可将抗凝剂配成适当浓度的水溶液，按需要量加到准备盛血的试管中，并涂布于试管壁，横放烘干（肝素不宜超过 30℃)备用。 (二)血浆将上述抗凝全血在离心机中离心，血细胞下沉，上清液即为血浆。分离血浆时，必须严格防止溶血，除采血时一切用具（注射器、针头、试管等）都需要清洁干燥外，取出之血液也不能剧烈振摇。 (三)血清收集的血液若不加抗凝剂，在室温下约510分钟即自行凝固。血液凝固 3060分钟后，即可采用离心方式分离出血清。若血块粘附于容器壁过于牢固、血清不易分离出来时，可用细玻璃棒轻轻剥离血块。 (四)无蛋白血滤液分析血液中某些成分时（如血液中的非蛋白氨、葡萄糖、肌酸等)为了避免蛋白质的干扰，需预先除去血中的蛋白质成分。常用三氯醋酸，钨酸等沉淀剂与蛋白质作用，然后用过滤或离心方法制备无蛋白血滤液二、尿液样品一般定性实验可以用随时收集的新鲜尿液。定量测定尿液中各种成分时，应把收集的 24小时的尿液混合后再取样。因为一天之中各次排出尿液的成分，随食物、饮水及一昼夜体内生理变化等的影响而有很大的差异。收集尿液的方法一般在早晨一定的时间先排弃残余尿，再将每次尿均收集于清洁大玻璃瓶中，到第二天早晨同一时间收集最后一次尿液即可。把收集24小时尿液充分混合后用量筒量准其总体积，然后取样分析。收集的尿液如不能立即进行实验，应置于冷处保存。必要时可在收集尿液的瓶中预先放入防腐剂，通常每升尿中约加入甲苯10ml或浓盐酸10ml。收集实验动物的尿液时，可将动物置于代谢笼中，按以上方法通过笼下的漏斗收集动物24小时的尿液。三、组织样品在生物化学实验中，常常利用离体组织研究各种物质代谢的途径与酶系的作用，也可

收集动物或人的血液时应使用清洁干燥的试管或器皿，以防止溶血。（一）全血取出血液后，迅速置于含有抗凝剂的试管内，同时轻轻混匀，使血液和抗凝剂充分混合，以免血液凝固。取得的全血如不能立即进行实验，应储存于冰箱中。常用的抗凝剂有草酸盐、柠檬酸盐、氟化钠等，根据实验的要求而定，一般情况下使用肝素钠或肝素。抗凝剂的用量不宜过多，以免影响实验结果。通常每毫升血液加草酸盐 1~2mg，柠檬酸钠 5mg 或氟化钠 5~10mg，肝素仅需要 0.01~0.2mg。可将抗凝剂配成适当浓度的水溶液，按需要量加到准备盛血的试管中，并涂布于试管壁，横放烘干（肝素不宜超过 30℃）备用。（二）血浆将上述抗凝全血在离心机中离心，血细胞下沉，上清液即为血浆。分离血浆时，必须严格防止溶血，除采血时一切用具（注射器、针头、试管等）都需要清洁干燥外，取出之血液也不能剧烈振摇。（三）血清收集的血液若不加抗凝剂，在室温下约 5~10 分钟即自行凝固。血液凝固 30~60 分钟后，即可采用离心方式分离出血清。若血块粘附于容器壁过于牢固、血清不易分离出来时，可用细玻璃棒轻轻剥离血块。（四）无蛋白血滤液分析血液中某些成分时（如血液中的非蛋白氮、葡萄糖、肌酸等）为了避免蛋白质的干扰，需预先除去血中的蛋白质成分。常用三氯醋酸，钨酸等沉淀剂与蛋白质作用，然后用过滤或离心方法制备无蛋白血滤液。二、尿液样品一般定性实验可以用随时收集的新鲜尿液。定量测定尿液中各种成分时，应把收集的 24 小时的尿液混合后再取样。因为一天之中各次排出尿液的成分，随食物、饮水及一昼夜体内生理变化等的影响而有很大的差异。收集尿液的方法一般在早晨一定的时间先排弃残余尿，再将每次尿均收集于清洁大玻璃瓶中，到第二天早晨同一时间收集最后一次尿液即可。把收集 24 小时尿液充分混合后用量筒量准其总体积，然后取样分析。收集的尿液如不能立即进行实验，应置于冷处保存。必要时可在收集尿液的瓶中预先放入防腐剂，通常每升尿中约加入甲苯 10ml 或浓盐酸 10ml。收集实验动物的尿液时，可将动物置于代谢笼中，按以上方法通过笼下的漏斗收集动物 24 小时的尿液。三、组织样品在生物化学实验中，常常利用离体组织研究各种物质代谢的途径与酶系的作用，也可

以从组织中提取各种代谢物质或酶进行研究。但是生物组织离体过久，其所含物质的含量和生物活性都将发生变化。因此，利用离体组织作为提取材料或代谢研究材料时，应在冰冷条件下迅速取出所需组织，并尽快进行提取或测定。一般采用断头法（或注射空气于动物心脏）处死动物，放出血液，立即取出实验所需之脏器或组织，去除外层的脂肪及结缔组织后，用冰冷的生理盐水洗去血液，必要时也可用冰冷的生理盐水灌注脏器以洗去血液，再用滤纸吸干。迅速称重后，根据实验的不同要求，用以下不同的方法制成不同的组织样品。 (一)组织糜将组织用剪刀迅速剪碎，或用绞肉机纹成糜状即可。 (二)组织匀浆向剪碎的新鲜组织中加入适量冰冷的匀浆制备液，用高速电动匀浆器或玻璃匀浆器制成匀浆。常用的玻璃匀浆器有5ml和10ml两种，由一个磨砂玻璃套管和个带有磨砂玻璃杵头的杵组成。玻璃杵的外壁必须紧靠玻璃套管的内壁。用时将套管放入冰浴中，玻璃杵与调速马达连接，将剪碎的组织悬浮于匀浆制备液中并倾入套管中，然后再把玻璃杵插入套管中。开动马达并调节杵的转速，小心地用手扶住套管口部，不断上下移动，直至组织碎块磨成匀浆为止。常用的匀浆制备液有生理盐水、缓冲液或0.25molL燕糖溶液等，可根据实验的不同要求，加以选择。 (三)组织浸出液将上法制成的组织匀浆进行离心，其上清液即为组织浸出液， §4离心分离技术原理离心机是利用离心力把溶液中的粒子进行分离的一种仪器。所谓离心力是指物体作圆周运动时形成的一种迫使物体脱离圆周运动中心的力。离心力的单位为g即重力加速度(980.6cm/s),离心力的大小可根据离心时的旋转速度 V(r/min,每分钟转数，revolution per minute)和物体离旋转轴中心的距离r(cm)按下式计算 g=r×V2×1.118×105 或按下式计算所需的转速 V=V(g×89445)斤在离心场中物体所受离心力的大小，与物体离旋转轴中心的距离有关，离轴心越远

以从组织中提取各种代谢物质或酶进行研究。但是生物组织离体过久，其所含物质的含量和生物活性都将发生变化。因此，利用离体组织作为提取材料或代谢研究材料时，应在冰冷条件下迅速取出所需组织，并尽快进行提取或测定。一般采用断头法（或注射空气于动物心脏）处死动物，放出血液，立即取出实验所需之脏器或组织，去除外层的脂肪及结缔组织后，用冰冷的生理盐水洗去血液，必要时也可用冰冷的生理盐水灌注脏器以洗去血液，再用滤纸吸干。迅速称重后，根据实验的不同要求，用以下不同的方法制成不同的组织样品。（一）组织糜将组织用剪刀迅速剪碎，或用绞肉机绞成糜状即可。（二）组织匀浆向剪碎的新鲜组织中加入适量冰冷的匀浆制备液，用高速电动匀浆器或玻璃匀浆器制成匀浆。常用的玻璃匀浆器有 5ml 和 10ml 两种，由一个磨砂玻璃套管和一个带有磨砂玻璃杵头的杵组成。玻璃杵的外壁必须紧靠玻璃套管的内壁。用时将套管放入冰浴中，玻璃杵与调速马达连接，将剪碎的组织悬浮于匀浆制备液中并倾入套管中，然后再把玻璃杵插入套管中。开动马达并调节杵的转速，小心地用手扶住套管口部，不断上下移动，直至组织碎块磨成匀浆为止。常用的匀浆制备液有生理盐水、缓冲液或 0.25mol/L 蔗糖溶液等，可根据实验的不同要求，加以选择。（三）组织浸出液将上法制成的组织匀浆进行离心，其上清液即为组织浸出液。 §4 离心分离技术原理离心机是利用离心力把溶液中的粒子进行分离的一种仪器。所谓离心力是指物体作圆周运动时形成的一种迫使物体脱离圆周运动中心的力。离心力的单位为 g 即重力加速度（980.6cm/s2），离心力的大小可根据离心时的旋转速度 V（r/min，每分钟转数，revolution per minute）和物体离旋转轴中心的距离 r（cm ）按下式计算： g = r× V2× 1.118 ×10-5 或按下式计算所需的转速在离心场中物体所受离心力的大小，与物体离旋转轴中心的距离有关，离轴心越远， V=√（g×89445）/r

所受到的离心力越大。计算时通常采用平均距离根据离心机转速的不同，常将离心机分为普通离心机（最高转速4000rmi)、高速离心机（最高转速20000rmim)和超高速离心机（最高转速60000r/min以上）。超速离心机又可分为分析超速离心机和制备超速离心机两类，前者能精确控制离心力，并且可用照相方法或者电子技术记录沉降粒子在离心过程中的行为，对这些记录进行分析，可以测定粒子的物理性质，如沉降系数、分子量、扩散系数、沉降物质的不均一性等。制备离心技术包括两种方法：一种是分级离心法，另一种是密度梯度离心法。一、分级离心法非均一的粒子悬浮液在离心机中离心时，各种粒子以各自的沉降速度移向离心管底部，逐步在底部形成一层沉淀物质。这层沉淀物质含有各种组分，但是最多的是那些沉降得最快的组分（图2）。为了分出某一特定组分，需要进行一系列离心。通常先选择一个离心速度和离心时间，进行第一次离心，把大部分不需要的大粒子沉降去掉，这时所需要的组分大部分仍留在上清液内：然后将收集到的上清液用更高的转速离心，把需要的粒子沉积下来。离心时间要选择得当，使大部分不需要的小粒子仍留在上清液中。经过较高速度离心后，倾去上清液，把沉淀悬浮起来，再用较低转速离心。如此反复高速、低速离心，直至达到所需粒子的纯度为止。这种基于粒子沉降速度不同而分离的方法，用得非常普遍，对病毒和亚细胞组分的浓缩特别有用：但是要得到一个纯组分较困难，即使沉降最慢的组分较纯，它的收得率也是很低的。 1 2 3 图2分级离心法二、密度梯度离心法密度梯度离心法较分级离心法复杂，但是具有很好的分辨能力。密度梯度离心可以同时使样品中几个或全部组分分离，这是分级离心法所不及的。这个方法是把样品粒子在一个密度梯度介质中离心，这个介质由一合适的可使小分子和样品粒子在其中悬浮的溶剂组成。离心时，离轴心愈远介质密度愈大。密度梯度离心法又可分为两种操作方法：速率区带离心技

所受到的离心力越大。计算时通常采用平均距离。根据离心机转速的不同，常将离心机分为普通离心机（最高转速 4 000 r/min）、高速离心机（最高转速 20 000r/min）和超高速离心机（最高转速 60 000r/min 以上）。超速离心机又可分为分析超速离心机和制备超速离心机两类，前者能精确控制离心力，并且可用照相方法或者电子技术记录沉降粒子在离心过程中的行为，对这些记录进行分析，可以测定粒子的物理性质，如沉降系数、分子量、扩散系数、沉降物质的不均一性等。制备离心技术包括两种方法：一种是分级离心法，另一种是密度梯度离心法。一、分级离心法非均一的粒子悬浮液在离心机中离心时，各种粒子以各自的沉降速度移向离心管底部，逐步在底部形成一层沉淀物质。这层沉淀物质含有各种组分，但是最多的是那些沉降得最快的组分（图 2）。为了分出某一特定组分，需要进行一系列离心。通常先选择一个离心速度和离心时间，进行第一次离心，把大部分不需要的大粒子沉降去掉，这时所需要的组分大部分仍留在上清液内；然后将收集到的上清液用更高的转速离心，把需要的粒子沉积下来。离心时间要选择得当，使大部分不需要的小粒子仍留在上清液中。经过较高速度离心后，倾去上清液，把沉淀悬浮起来，再用较低转速离心。如此反复高速、低速离心，直至达到所需粒子的纯度为止。这种基于粒子沉降速度不同而分离的方法，用得非常普遍，对病毒和亚细胞组分的浓缩特别有用；但是要得到一个纯组分较困难，即使沉降最慢的组分较纯，它的收得率也是很低的。二、密度梯度离心法密度梯度离心法较分级离心法复杂，但是具有很好的分辨能力。密度梯度离心可以同时使样品中几个或全部组分分离，这是分级离心法所不及的。这个方法是把样品粒子在一个密度梯度介质中离心，这个介质由一合适的可使小分子和样品粒子在其中悬浮的溶剂组成。离心时，离轴心愈远介质密度愈大。密度梯度离心法又可分为两种操作方法：速率区带离心技 1 2 3 4 图 2 分级离心法

蚌埠医科大学（蚌埠医学院）：《生物化学》课程教学资源（实验指导）第一部分 生物化学技术概论

蚌埠医科大学（蚌埠医学院）：《生物化学》课程教学资源（实验指导）第一部分生物化学技术概论