东北林业大学：《生物化学》课程教学资源（教材讲义）第十二章核酸的生物合成.doc_大学文库

图Il-3证明DNA半保留复制的Meselsen-Sahl实验图解带，浮力密度为1.7I7g/ml,位于15N一DNA和14N一DNA之间，这条区带的DNA是由 4N/5N一DNA组成的。经二代之后，出现两条区带，其浮力密度分别为1.7I0g/ml和 1.717g/m,即一条区带为4N/I4N-DNA,另一条区带为14N/15N-DNA。再继续培养， 1N/1N一DNA分子逐渐增多，而1N/5N一DNA分子所占的比例逐渐减少。这些结果及其解释可用图11-3表示。这个试验结果证明DNA是以半保留方式进行复制的。以后用其他细菌、动物、植物、噬菌体、动物病毒等也证明了DNA的半保留复制。DNA的半保留复制可以使遗传信息的传递保持相对的稳定，这和它的遗传功能是相吻合的，说明半保留复制具有重要的生物学意义。但是这种稳定性是相对的。在一定条件下，DNA会发生损伤，需要修复：在复制和转录中DN会有损耗，必须进行更新：在发育和分化过程中， DNA特定序列可能修饰、删除、扩增和重排二、与DNA复制有关的酶和蛋白质 DNA的合成是以四种三磷酸脱氧核糖核苷为底物的聚合反应，该过程除了酶的催化之外，还需要以适量的DNA为模板，以RNA或DNA)为引物和镁离子的参与。 mdATP、 DNA聚合酶 DNA+(m+m+m+na)PPi mdCTP DNA,Mg" ndTTP 实际上，DNA合成的反应是很复杂的，催化这个反应的酶也有多种，除DNA聚合酶外，还有RNA引物合成酶（即引发酶），DNA连接酶、拓扑异构酶、解螺旋酶及多种蛋白质因子参与。现将与DNA合成有关的几种酶和蛋白质因子扼要介绍如下： 1.引物合成酶（亦称引发酶，Primase) 此酶以DNA为模板合成一段RNA,这段RNA作为合成DNA的引物Primer)。催化引物RNA合成的酶对利福平((rifampicin)不敏感，而且在一定程度上可用脱氧核糖核苷酸代替核糖核苷酸作为底物，而与经典的RNA聚合酶不同。大肠杆菌的引物酶为一条单链多肽，分子量为60000。 2.DNA聚合酶(DNA polymerase) 目前已知的DNA聚合酶有多种，它们的性状和在DNA合成中的功能均不相同。在大肠杆菌中发现有3种DNA聚合酶，分别称为DNA聚合酶I、I、Ⅲ。DNA聚合酶I最初是在1955年由Kornberg在大肠杆菌内发现的。Kornberg将其进行了高度纯化。纯化的酵是一条单链多肽，呈球状，直径约为6.5m,是DNA直径的3倍左右。分子量为109000。每个分子含一个锌原子。这个锌原子与酶的催化作用有关。DNA聚合酶I是多功能酶，它具有5’→3'聚合酶，5’→3'外切酶及3′→5'外切酶的活性。它的主要功能是对 DNA损伤的修复，以及在DNA复制时，填补RNA引物切除后留下的空隙。 272

272 图 11-3 证明 DNA 半保留复制的 Meselsen-Stahl 实验图解带，浮力密度为 1.7l7g／ml，位于 15N—DNA 和 14N—DNA 之间，这条区带的 DNA 是由 14N／15N—DNA 组成的。经二代之后，出现两条区带，其浮力密度分别为 1.710g／ml 和 1.717g／ml，即一条区带为 14N／14N—DNA，另一条区带为14N／15N -DNA。再继续培养， 14N／14N—DNA 分子逐渐增多，而 14N／15N—DNA 分子所占的比例逐渐减少。这些结果及其解释可用图 11-3 表示。这个试验结果证明 DNA 是以半保留方式进行复制的。以后用其他细菌、动物、植物、噬菌体、动物病毒等也证明了 DNA 的半保留复制。DNA 的半保留复制可以使遗传信息的传递保持相对的稳定，这和它的遗传功能是相吻合的，说明半保留复制具有重要的生物学意义。但是这种稳定性是相对的。在一定条件下，DNA 会发生损伤，需要修复；在复制和转录中 DNA 会有损耗，必须进行更新；在发育和分化过程中， DNA 特定序列可能修饰、删除、扩增和重排。二、与 DNA 复制有关的酶和蛋白质 DNA 的合成是以四种三磷酸脱氧核糖核苷为底物的聚合反应，该过程除了酶的催化之外，还需要以适量的 DNA 为模板，以 RNA(或 DNA)为引物和镁离子的参与。 n1dATP + n2dGTP DNA 聚合酶 + DNA+ (n1+n2+n3+n4)PPi n3dCTP DNA, Mg2+ + n4dTTP 实际上，DNA合成的反应是很复杂的，催化这个反应的酶也有多种，除DNA 聚合酶外，还有 RNA 引物合成酶(即引发酶)，DNA 连接酶、拓扑异构酶、解螺旋酶及多种蛋白质因子参与。现将与 DNA 合成有关的几种酶和蛋白质因子扼要介绍如下； 1．引物合成酶(亦称引发酶，Primase) 此酶以 DNA 为模板合成一段 RNA，这段 RNA 作为合成 DNA 的引物(Primer)。催化引物 RNA 合成的酶对利福平(rifampicin)不敏感，而且在一定程度上可用脱氧核糖核苷酸代替核糖核苷酸作为底物，而与经典的 RNA 聚合酶不同。大肠杆菌的引物酶为一条单链多肽，分子量为 60 000。 2． DNA 聚合酶(DNApolymerase) 目前已知的 DNA 聚合酶有多种，它们的性状和在 DNA 合成中的功能均不相同。在大肠杆菌中发现有 3 种 DNA 聚合酶，分别称为 DNA 聚合酶 I、Ⅱ、Ⅲ。DNA 聚合酶I 最初是在 1955 年由 Kornberg 在大肠杆菌内发现的。Kornberg 将其进行了高度纯化。纯化的酶是一条单链多肽，呈球状，直径约为6.5nm，是 DNA 直径的 3 倍左右。分子量为 109 000。每个分子含一个锌原子。这个锌原子与酶的催化作用有关。DNA 聚合酶 I 是多功能酶，它具有 5′ →3′ 聚合酶，5′→3′外切酶及 3′→5′外切酶的活性。它的主要功能是对 DNA 损伤的修复，以及在 DNA 复制时，填补 RNA 引物切除后留下的空隙

RNA引物切除的作用。DNA聚合酶I在细胞中担负者多种功能，如双链缺口的填补，单股链的置换合成，具有引物的环形、线形单股链的合成。 DNA聚合酶Ⅱ和Ⅲ与聚合酶的特性和功能有相同之处，也有区别，如表11-1所示。 DA聚合酶Ⅱ是由一条分子量为120000的多肽链组成，它的活力很低，其生理功能尚不清楚。可能在修复紫外光引起的DNA损伤中起某种作用。 DNA聚合酶Ⅲ极为复杂，目前己知它的全酶含有10种共22个亚基组分和锌原子，其组成是a2e,0,t2Y2626,'x:中，B,(如表11-2所示)。其中。亚基的分子量为132000，具有5'→3'DNA聚合酶活性。a、e和0三种亚基组成全酶的核心酶（称为PolI)。e 亚基具有3'外切酶的校对功能，可以提高NA复制的保真性。核心酶本身活力较低，只作用于带缺口的双链DNA,加上τ亚基后成为二聚体，称polⅢ'，pol'就可以利用带有引物的长单链DNA。Y和δ亚基则与酶功能的特续性有关，它们与8'、 x和中亚基组装成Y复合体，进一步与核心酶结合，成为o1Ⅲ'，即“天然的”聚合酶Ⅲ，它与B亚基结合就形成全酶。在复制起始中B亚基对引物的识别和结合有关，一旦全酶结合到DNA复制的起始部位，B亚基就被释放出来。现在一般认为，DN州聚合酶是原核生物DNA复制的主要聚合酶。Ⅲ 表11-2DNA聚合酶川全酶的亚基组成亚基分子量亚基数目其它名称 132000 27000 o1Ⅲ，核心酶、 10000 (at)t 71000 52000 pol II" 35000 Y复合体全 3000 2 15000 2 12000 37000 3.真核细胞的DNA聚合酶在真核细胞内己发现四种DNA聚合酶，分别用a、B、Y和6表示。这四种聚表11-3真核生物的DNM聚合酶 DNA紧合梅 DNA聚合南 NA聚合酶 DNA紧合酶分子量 110000220000 45000 60000 122000 亚基数 4~8个 1个 1个细胞内分布细胞核细胞核线拉体细胞核酶活力占总量的百分比 -80% 10%~15% 2%~15% 10%~25% 核酸外切酶活力无无 3'→5 274

274 RNA 引物切除的作用。DNA聚合酶 I 在细胞中担负着多种功能，如双链缺口的填补，单股链的置换合成，具有引物的环形、线形单股链的合成。 DNA聚合酶Ⅱ和Ⅲ与聚合酶I的特性和功能有相同之处，也有区别，如表11-1所示。 DNA聚合酶Ⅱ是由一条分子量为120 000的多肽链组成，它的活力很低，其生理功能尚不清楚。可能在修复紫外光引起的DNA损伤中起某种作用。 DNA聚合酶Ⅲ极为复杂，目前已知它的全酶含有10种共22个亚基组分和锌原子，其组成是α2ε2θ2τ2γ2δ2δ2′χ2ψ2β4（如表11-2所示）。其中。亚基的分子量为132 000，具有5′→3′DNA聚合酶活性。α、ε和θ三种亚基组成全酶的核心酶(称为pol Щ)。ε 亚基具有3′外切酶的校对功能，可以提高DNA复制的保真性。核心酶本身活力较低，只作用于带缺口的双链DNA，加上τ亚基后成为二聚体，称pol Ⅲ′，pol Ⅲ′就可以利用带有引物的长单链DNA。γ和δ亚基则与酶功能的持续性有关，它们与δ′、χ和ψ亚基组装成γ复合体，进一步与核心酶结合，成为pol Ⅲ *，即“天然的”聚合酶Ⅲ，它与β亚基结合就形成全酶。在复制起始中β亚基对引物的识别和结合有关，一旦全酶结合到DNA复制的起始部位，β亚基就被释放出来。现在一般认为，DNA聚合酶Ⅲ是原核生物DNA复制的主要聚合酶。Ⅲ 表 11-2 DNA聚合酶Ⅲ全酶的亚基组成 3．真核细胞的DNA聚合酶在真核细胞内已发现四种DNA聚合酶，分别用α、β、γ和δ表示。这四种聚表 11-3 真核生物的DNA聚合酶亚基分子量亚基数目其它名称 α ε θ τ γ δ δ′ χ ψ β 132 000 27 000 10 000 71 000 52 000 35 000 33 000 15 000 12 000 37 000 2 2 2 2 2 2 2 2 2 4 Pol Ⅲ ,核心酶 pol Ⅲ ′ (αεθ) (αεθ)2τ2 pol Ⅲ * γ复合体全酶 DNA 聚合酶 α DNA 聚合酶 β DNA 聚合酶 γ DNA 聚合酶 δ 分子量亚基数细胞内分布酶活力占总量的百分比核酸外切酶活力 110 000～220 000 4～8 个细胞核～80％无 45 000 1 个细胞核 10％～15％无 60 000 1 个线粒体 2％～15％无 122 000 1 个细胞核 10％～25％ 3′→5′

合酶的特性见表11-3。现在一般认为DNA聚合酶a和6的作用是复制染色体DNA,主要的根据是它们在细胞内活力水平的变化与DA复制有明显的平行关系，在分裂细胞的S期达到高峰。聚合酶ā催化随后链的合成，而聚合酶6催化领头链的合成，它还具有3'→5'外切酶的活力。NA聚合酶B的功能主要是修复作用。NA聚合爵Y是从线粒体中分离得到的，推测它与线粒体DNA的复制有关。 4.DNA连接酶(DNM1 igase) 其作用是催化双链DNA中的切口处的相邻5'一磷酸基与3'一羟基之间形成磷酸酯键。但是它不能将两条游离的DNA单链连接起来大肠杆菌的DNA连接酶要求NAD提供能量，产物是AMP和烟酰胺单核苷酸（图11-5）。而在高等生物中，则要求ATP提供能量，产物是AMP和焦磷酸。大肠杆菌的DNA连接酶是分子量为 75000的多肽链。在哺乳动物细胞中发现至少有两种连接酵，分别称为连接酶I和Ⅱ。连接酶I的分子量为200000，连接酶Ⅱ的为85000。连接酶主要在正在繁殖的细胞中起作用。连接酶Ⅱ则在停止分裂的细胞中起作用。DNA连接酶在DNA复制、修复、重组中均起重要作用。 E+ATR或NAD EAMP+PP或NMN E-AMP+-5-DNA= E+AMP-(B-5'-DNA DNA-3-OH+AMP-5-DNA= =DNA-3-0-5'-DNA+AMP DNA-3OH+®-5DNA+ATP或NAD) =DNA-3O-⊙-S-DNA+AMP+PP或NMN 图11-5DNA连接酶催化反应的机理 5.拓扑异构酶(topoisomerase) 生物体内DNA分子通常处于超螺旋状态，而DNA的许多生物功能需要解开双链才能进行。拓扑异构酶就是催化DNA的拓扑连环数发生变化的酶，它可分为拓扑异构酶和拓扑异构酶Ⅱ（也称为旋转酶，gyrase)。1型酶可使双链DNA分子中的一条链发生断裂和再连接，反应不需要提供能量，它们主要集中在活性转录区，同转录有关。Ⅱ型酶能使DN八的两条链同时发生断裂和再连接，当它引入负超螺旋时需要由ATP提供能量。一个拓扑异构酶Ⅱ 的分子1mi分钟可引入100个负超螺旋。它们主要分布在染色质骨架蛋白和核基质部位，同复制有关。拓扑异构酶可减少负超螺旋：拓扑异构酶红可引入负超螺旋，它们协同作用控制着DNA的拓扑结构。拓扑异构酶在重组、修复和DNA的其他转变方面起着重要的作用。 6.解螺旋與helicase) 这类酶能通过水解ATP将DNA的两条链打开。ATP水解活力要有单链DNA存在时才表现。大肠杆菌中的rep蛋白(rep基因的产物就是这样一种酶。由分子量为65000的一条多肽链组成。每解开一对碱基需要水解2个ATP分子。 7.其他蛋白因子 (I)单链结合蛋白SSP)它的功能是稳定已被解开的DNA单链，阻止复性和保护单链不被核酸酶降解。 (2)引发前体(preprimosome)它是由6种蛋白质即dnaB、dhaC、n、n'、n”和i组成。引发前体再与RNA引物合成酶（引发酶）结合，组装成引发体(primosome)。引发体结 275

275 合酶的特性见表11-3。现在一般认为DNA聚合酶α和δ的作用是复制染色体DNA，主要的根据是它们在细胞内活力水平的变化与DNA复制有明显的平行关系，在分裂细胞的S期达到高峰。聚合酶α催化随后链的合成，而聚合酶δ催化领头链的合成，它还具有3′→5′外切酶的活力。DNA聚合酶β的功能主要是修复作用。DNA聚合酶γ是从线粒体中分离得到的，推测它与线粒体DNA的复制有关。 4.DNA连接酶(DNA ligase) 其作用是催化双链DNA中的切口处的相邻5′—磷酸基与3′—羟基之间形成磷酸酯键。但是它不能将两条游离的DNA单链连接起来。大肠杆菌的DNA连接酶要求NAD+提供能量，产物是AMP和烟酰胺单核苷酸(图11-5)。而在高等生物中，则要求ATP提供能量，产物是AMP和焦磷酸。大肠杆菌的DNA连接酶是分子量为 75 000的多肽链。在哺乳动物细胞中发现至少有两种连接酶，分别称为连接酶I和Ⅱ。连接酶I的分子量为200 000，连接酶Ⅱ的为85 000。连接酶I主要在正在繁殖的细胞中起作用。连接酶Ⅱ则在停止分裂的细胞中起作用。DNA连接酶在DNA复制、修复、重组中均起重要作用。图 11-5 DNA连接酶催化反应的机理 5．拓扑异构酶(topoisomerase) 生物体内DNA分子通常处于超螺旋状态，而DNA的许多生物功能需要解开双链才能进行。拓扑异构酶就是催化DNA的拓扑连环数发生变化的酶，它可分为拓扑异构酶I和拓扑异构酶Ⅱ(也称为旋转酶，gyrase)。I型酶可使双链DNA分子中的一条链发生断裂和再连接，反应不需要提供能量，它们主要集中在活性转录区，同转录有关。Ⅱ型酶能使DNA的两条链同时发生断裂和再连接，当它引入负超螺旋时需要由ATP提供能量。一个拓扑异构酶Ⅱ 的分子1min分钟可引入100个负超螺旋。它们主要分布在染色质骨架蛋白和核基质部位，同复制有关。拓扑异构酶I可减少负超螺旋；拓扑异构酶II可引入负超螺旋，它们协同作用控制着DNA的拓扑结构。拓扑异构酶在重组、修复和DNA的其他转变方面起着重要的作用。 6.解螺旋酶(helicase) 这类酶能通过水解ATP将DNA的两条链打开。ATP水解活力要有单链DNA存在时才表现。大肠杆菌中的rep蛋白(rep基因的产物)就是这样一种酶。由分子量为65 000的一条多肽链组成。每解开一对碱基需要水解2个ATP分子。 7．其他蛋白因子（1）单链结合蛋白(SSP) 它的功能是稳定已被解开的DNA单链，阻止复性和保护单链不被核酸酶降解。（2）引发前体(preprimosome) 它是由6种蛋白质即dnaB、dnaC、n、n′、n″和i组成。引发前体再与RNA引物合成酶(引发酶)结合，组装成引发体（primosome）。引发体结 NAD +） P P P P + AMP P NAD +） P +AMP + PPi(或NMN) E + AT（P 或 E·AMP + PPi(或NMN) E-AMP + 5'-DNA E + AMP 5'-DNA DNA-3'-OH + AMP 5'-DNA DNA-3'-O 5'-DNA DNA-3'-OH + 5'-DNA + AT（P 或 DNA-3'-O 5'-DNA

合到随后链的模板上，具有识别合成起始位点的功能，可以沿模板链'→3'方向移动，移动到一定位置上即可以引发RNA引物的合成。三、DNA的复制过程 DNA的复制按一定的程序进行，双螺旋的DNA是边解开边合成新链的。复制从特定位点开始，可以单向或双向进行，但是以双向复制为主。由于DNA双链的合成延伸均为5 一3'的方向，因此复制是以半不连续))的方式进行的，即其中一条链相对地连续合成，称之为领头链(leading strand),另一条链的合成则是不连续的，称为随后链 (laggingstrand)。在DNA复制叉上进行的基本活动包括双链的解开：RNA引物的合成：DNA 的延长：切除RNA引物，填补缺口，连接相邻的DNA片段，如图11-6所示。 1.双链的解开很多实验都证明了复制是从 DNA分子的特定位置开始的，这一位署叫复制原点，常用拓扑异构酶 ori(或o)表示。许多生物的复制解螺刷单链结合蛋白原点都是富含A、T的区段。这引发体一区段产生的瞬时单链与单链引物RNA 结合蛋白结合，对复制的起始十 √聚合酸川分重要。原核生物基因组一般只有一个复制原点。所有DNA的聚m ,冈崎片段复制原点都处于双螺旋结构内部，就是线状DNA也不是从未端开始复制的。DNA复制速率 3 的调节主要在于起始频率，而 DNA连接南领头特 DNA延长的速度则大体上是恒随后链定的。在讯谏生长的细菌中，当图11-6大肠杆菌的复制叉结构示意图第一次复制起始后，在复制未完成之前.复制原占可以起始第二次复制.这可加快复制的速府。直核细胞口可以在D八NA钵的多个不同位点同时起始进行复制，所以原核细胞的复制速度尽管比真核细胞快，但由于直核细朐响可以在名个位占同时讲行，其总谏度反而比原核细朐快在DNA的复制原点，双股螺旋解开，成单链状态，分别作为模板，各自合成其互补链。在起点处形成一个“眼”状结构。在“眼”的两端，则出现两个叉子状的生长点，称为复制叉(replication fork)。在复制叉上结合着各种各样与复制有关的酶和辅助因子，如DNA解旋酶、引发体和DNA聚合酶，它们在DNA链上构成与核糖体相似大小的复合体称为复制体 (replisome)。彼此配合，进行高度精确的复制（图1l-6)。 2.RNA引物的合成 276

276 合到随后链的模板上，具有识别合成起始位点的功能，可以沿模板链5′→3′方向移动，移动到一定位置上即可以引发RNA引物的合成。三、DNA的复制过程 DNA的复制按一定的程序进行，双螺旋的DNA是边解开边合成新链的。复制从特定位点开始，可以单向或双向进行，但是以双向复制为主。由于DNA双链的合成延伸均为5′ →3′的方向，因此复制是以半不连续(semidiscontinuous)的方式进行的，即其中一条链相对地连续合成，称之为领头链(1eading strand)，另一条链的合成则是不连续的，称为随后链 (1aggingstrand)。在DNA复制叉上进行的基本活动包括双链的解开；RNA引物的合成；DNA 链的延长；切除RNA引物，填补缺口，连接相邻的DNA片段，如图11-6所示。 1．双链的解开很多实验都证明了复制是从 DNA分子的特定位置开始的，这一位置叫复制原点，常用 ori(或o)表示。许多生物的复制原点都是富含A、T的区段。这一区段产生的瞬时单链与单链结合蛋白结合，对复制的起始十分重要。原核生物基因组一般只有一个复制原点。所有DNA的复制原点都处于双螺旋结构内部，就是线状DNA也不是从末端开始复制的。DNA复制速率的调节主要在于起始频率，而 DNA延长的速度则大体上是恒定的。在迅速生长的细菌中，当第一次复制起始后，在复制未完成之前，复制原点可以起始第二次复制，这可加快复制的速度。真核细胞可以在DNA链上的多个不同位点同时起始进行复制，所以原核细胞的复制速度尽管比真核细胞快，但由于真核细胞可以在多个位点同时进行，其总速度反而比原核细胞快。在DNA的复制原点，双股螺旋解开，成单链状态，分别作为模板，各自合成其互补链。在起点处形成一个“眼”状结构。在“眼”的两端，则出现两个叉子状的生长点，称为复制叉(replication fork)。在复制叉上结合着各种各样与复制有关的酶和辅助因子，如DNA解旋酶、引发体和DNA聚合酶，它们在DNA链上构成与核糖体相似大小的复合体称为复制体 (replisome)。彼此配合，进行高度精确的复制(图11-6)。 2．RNA引物的合成图 11-6 大肠杆菌的复制叉结构示意图 5' 3' 5' 3' 5' 3' 拓扑异构酶 rep蛋白单链结合蛋白解螺旋酶引发体冈崎片段 Ⅰ Ⅲ DNA 聚合酶 Ⅲ DNA 聚合酶 DNA 聚合酶 DNA连接酶领头链随后链引物RNA

在DA复制的起始处双链解开，领头链先引发开始合成，与其模板形成双链结构，而另条亲代链则被置换出来。只有在领头链将另一条亲本链的特别序列置换出来，才能产生随后链的前体片段的前引发作用。需要引发酶与引发前体结合形成引发体。引发体在复制叉上移动，识别合成的起始点，引发RNA引物的合成。移动和引发均需要由ATP提供能量，以DNA为模板，按5'一3'的方向，合成一段引物RNA链。引物长度约为几个至10个核苷酸。在引物的5'端含3个磷酸残基，3'端为游离的羟基。 3.DNA链的延长当RNA引物合成之后，在DNA聚合酶的催化下，以四种脱氧核糖核苷5'-三磷酸为底物，在RNA引物的3'端以磷酸二酯键连接上脱氧核糖核苷酸并释放出PPi。DNA链的合成是以两条亲代DNA链为模板，按碱基配对原则进行复制的，亲代NA的双股链呈反向平行，条链是5'◆3'方向，另一条链是3”◆5方向。在个复制叉内两条链的复制方向不同 (图11-7)，所以新合成的二条子链极性也正好相反。由于迄今为止还没有发现一种DN聚合酶能按3'→5'方向延伸，因此子链中有一条链沿着亲代DNA单链的3'→5'方向（亦即新合成的DNA沿5'→3'方向)不断延长。这条新链称为领头链。而另一条链的合成方向与复制叉的前进方向相反，只能断续地合成5'→3'的多个短片段。1968年冈崎发现了这些片段故又称为冈崎片段(Okazaki fragment)。它们随后连接成大片段，这条新链称为随后链。这种领头链是连续合成的，随后链断续合成的方式称为半不连续复制(semidiscontinuous replication。)原核细胞的冈崎片段长度为1000~2000个核苷酸。真核细胞的较短，长度为 100200个核苷酸。复制 Lm 随后链儿领头鼓氧头链随后链延伸 WΠΠ 延伸起点图II-7DNA的双向复制尽管领头链的合成总是领先一段，但是从来没有发现领头链跑得太远，而总是与随后链保持相对稳定的一段距离。988年Kornberg等人从大肠杆菌中分离出8O0kDa的polⅢ 和900kDa的polⅢ全酶，其中各个亚基均有两个，并证明是具有双活性部位的非对称结构，这表明同一个p©Ⅲ全酶可能同时负责领头链和随后链的复制。根据实验资料提出如下复制模型（图11-8），随后链的模板在DNA聚合酶Ⅲ全酶上绕转180°形城一个小环，使冈崎片段的合成方向能够与领头链的合成方向以及复制体的移动方向保持一致。随着冈崎片段的延长，这个大环从DNA聚合酶上释放。在此之前，领头链的合成已将另一部分随后链的模板置换出来，并在适于引发的位点上由引发体合成新的引物，然后再形成一个小环而进行新的冈崎片段的合成。 277

277 在DNA复制的起始处双链解开，领头链先引发开始合成，与其模板形成双链结构，而另一条亲代链则被置换出来。只有在领头链将另一条亲本链的特别序列置换出来，才能产生随后链的前体片段的前引发作用。需要引发酶与引发前体结合形成引发体。引发体在复制叉上移动，识别合成的起始点，引发RNA引物的合成。移动和引发均需要由ATP提供能量。以DNA为模板，按5′→3′的方向，合成一段引物RNA链。引物长度约为几个至10个核苷酸。在引物的5′端含3个磷酸残基，3′端为游离的羟基。 3．DNA链的延长当RNA引物合成之后，在DNA聚合酶Ⅲ的催化下，以四种脱氧核糖核苷5′-三磷酸为底物，在RNA引物的3′端以磷酸二酯键连接上脱氧核糖核苷酸并释放出PPi。DNA链的合成是以两条亲代DNA链为模板，按碱基配对原则进行复制的，亲代DNA的双股链呈反向平行，一条链是5′→3′方向，另一条链是3′→5′方向。在一个复制叉内两条链的复制方向不同 (图11-7)，所以新合成的二条子链极性也正好相反。由于迄今为止还没有发现一种DNA聚合酶能按3′→5′方向延伸，因此子链中有一条链沿着亲代DNA单链的3′→5′方向(亦即新合成的DNA沿5′→3′方向)不断延长。这条新链称为领头链。而另一条链的合成方向与复制叉的前进方向相反，只能断续地合成5′→3′的多个短片段。1968年冈崎发现了这些片段故又称为冈崎片段(Okazaki fragment)。它们随后连接成大片段，这条新链称为随后链。这种领头链是连续合成的，随后链断续合成的方式称为半不连续复制(semidiscontinuous replication)。原核细胞的冈崎片段长度为1 000～2 000个核苷酸。真核细胞的较短，长度为 100～200个核苷酸。随后链领头链复制叉延伸 3' 5' 起点随后链领头链复制叉延伸 3' 5' 起点 3' 3' 3' 3' 图11-7 DNA的双向复制尽管领头链的合成总是领先一段，但是从来没有发现领头链跑得太远，而总是与随后链保持相对稳定的一段距离。1988年Kornberg等人从大肠杆菌中分离出800 kDa的pol Ⅲ* 和900 kDa的pol Ⅲ全酶，其中各个亚基均有两个，并证明是具有双活性部位的非对称结构，这表明同一个pol Ⅲ全酶可能同时负责领头链和随后链的复制。根据实验资料提出如下复制模型(图11-8)，随后链的模板在DNA聚合酶Ⅲ全酶上绕转180º形成一个小环，使冈崎片段的合成方向能够与领头链的合成方向以及复制体的移动方向保持一致。随着冈崎片段的延长，这个大环从DNA聚合酶Ⅲ上释放。在此之前，领头链的合成已将另一部分随后链的模板置换出来，并在适于引发的位点上由引发体合成新的引物，然后再形成一个小环而进行新的冈崎片段的合成

4.切除引物，填补缺口，连接修复当新形成的冈崎片段延长至一定长度，其3'一OH端与前面一条老片段的5'端接近时，即发生下列变化：在DNA聚合酶的作用下，在引物RNA与DNA片段的连接处切断：切去RNA引物后留下的空隙，由DNA聚合酶I催化合成一段DNA填补上：在DNA连接酶的作用下，连接相邻的DNA链：修复掺入DNA链的错配碱基。这样以两条亲代DNA链为模板，各自形成一条新的DNA互补链，结果是形城了两个DNA双股螺旋分子。每个分子中条链来自亲代DNA,另一条链则是新合成的，故称为半保留复制。四、逆转录以RNA为模板，按照RNA中的核苷酸顺序合成DNA,这与通常转录过程中遗传信息流从DNA到RNA的方向相反，故称为逆转录(reverse transcription)。在20世纪六十年代Temin 根据有关的实验结果提出，由RNA肿瘤病毒逆向转录为DNA前病毒，然后由DNA前病毒再转录为RNA肿瘤病毒的设想，但当时未得到重视。直至l97O年，Temin和Baltimore各自在鸟类劳氏肉瘤病毒和小鼠白血病病毒等RNA肿瘤病毒中找到了逆转录酶，才证明了存在逆向转录过程。现在人们已发现各种高等真核生物的RNA肿瘤病毒都有逆转录酶。鸟类的劳氏肉瘤病毒的逆转录酶具有三种分子形式，分别为a、āB和B2,其中āB是主要形式。 a亚基分子量为63kDa,B亚基分子量为94kDa。a亚基是B亚基的水解产物。只有a亚基具有酶活性。哺乳动物的NA肿瘤病毒的逆转录酶一般为单亚基结构。如小鼠白血病病毒中的逆转录酶是分子量为7OkDa的单条多肽链。逆转录酶需要以RNAM或DNA)为模板，以四种NTP为原料，要求短链RNA(或DNA)作为引物，此外还需要适当浓度的二价阳离子 Mg2和M2,沿5'→3'方向合成DNA,形成RNA-DNA杂交分子（或DNA双链分子）。以后，再以RNA-DNA杂交分子中的DNA链为模板，在寄主细胞的DNA聚合酶作用下，可合成另一条DNA互补链，这样便形成了新的双DNA分子。逆转录酶是一种多功能酶，它除了具有以RNA为模板的DNA聚合酶和以DNA为模板的DNA聚合酶活性外还兼有RNaseH、DNA内切、DNA拓扑异构酵、DNA解链酶和tRNA 结合的活性。逆转录酶的发现，表明遗传信息也可以从RNA传递到DNA,从而丰富了分子遗传学中心法则的内容。几乎所有的真核生物的mRNA分子的3'末端都有一段多聚腺苷酸。当加入寡聚dT作引物时，mRNA就可以成为逆转录酶的模板，在体外合成与其互补的DNA,称为cDNA 这种方法已成为生物技术和分子生物学研究中最常见的方法之一，也使逆转录酶得到广泛的应用。五、基因突变和DNA的损伤修复 1.基因突变是指DNA的碱基顺序发生突然而永久性地变化，从而影响DNA的复制，并使DNA的转录和翻译也跟着改变，因而表现出异常的遗传特征。DNA的突变可以有几种形式：() 279

279 4．切除引物，填补缺口，连接修复当新形成的冈崎片段延长至一定长度，其3′—OH端与前面一条老片段的5′端接近时，即发生下列变化：在DNA聚合酶I的作用下，在引物RNA与DNA片段的连接处切断；切去RNA引物后留下的空隙，由DNA聚合酶I催化合成一段DNA填补上；在DNA连接酶的作用下，连接相邻的DNA链；修复掺入DNA链的错配碱基。这样以两条亲代DNA链为模板，各自形成一条新的DNA互补链，结果是形成了两个DNA双股螺旋分子。每个分子中一条链来自亲代DNA，另一条链则是新合成的，故称为半保留复制。四、逆转录以RNA为模板，按照RNA中的核苷酸顺序合成DNA，这与通常转录过程中遗传信息流从DNA到RNA的方向相反，故称为逆转录(reverse transcription)。在20世纪六十年代Temin 根据有关的实验结果提出，由RNA肿瘤病毒逆向转录为DNA前病毒，然后由DNA前病毒再转录为RNA肿瘤病毒的设想，但当时未得到重视。直至1970年，Temin和Baltimore各自在鸟类劳氏肉瘤病毒和小鼠白血病病毒等RNA肿瘤病毒中找到了逆转录酶，才证明了存在逆向转录过程。现在人们已发现各种高等真核生物的RNA肿瘤病毒都有逆转录酶。鸟类的劳氏肉瘤病毒的逆转录酶具有三种分子形式，分别为α、αβ和β2，其中αβ是主要形式。 α亚基分子量为63 kDa，β亚基分子量为94 kDa。α亚基是β亚基的水解产物。只有α亚基具有酶活性。哺乳动物的RNA肿瘤病毒的逆转录酶一般为单亚基结构。如小鼠白血病病毒中的逆转录酶是分子量为70 kDa的单条多肽链。逆转录酶需要以RNA(或DNA)为模板，以四种dNTP为原料，要求短链RNA(或DNA)作为引物，此外还需要适当浓度的二价阳离子 Mg2+和Mn2+，沿5′→3′方向合成DNA，形成RNA-DNA杂交分子(或DNA双链分子)。以后，再以RNA-DNA杂交分子中的DNA链为模板，在寄主细胞的DNA聚合酶作用下，可合成另一条DNA互补链，这样便形成了新的双链DNA分子。逆转录酶是一种多功能酶，它除了具有以RNA为模板的DNA聚合酶和以DNA为模板的DNA聚合酶活性外还兼有RNaseH、DNA内切酶、DNA拓扑异构酶、DNA解链酶和tRNA 结合的活性。逆转录酶的发现，表明遗传信息也可以从RNA传递到DNA，从而丰富了分子遗传学中心法则的内容。几乎所有的真核生物的mRNA分子的3′末端都有一段多聚腺苷酸。当加入寡聚dT作引物时，mRNA就可以成为逆转录酶的模板，在体外合成与其互补的DNA，称为cDNA。这种方法已成为生物技术和分子生物学研究中最常见的方法之一，也使逆转录酶得到广泛的应用。五、基因突变和DNA的损伤修复 1．基因突变是指DNA的碱基顺序发生突然而永久性地变化，从而影响DNA的复制，并使DNA的转录和翻译也跟着改变，因而表现出异常的遗传特征。DNA的突变可以有几种形式：(1)

东北林业大学：《生物化学》课程教学资源（教材讲义）第十二章 核酸的生物合成

东北林业大学：《生物化学》课程教学资源（教材讲义）第十二章核酸的生物合成