第十一章 荧光分析法 ®光致发光某些物质经光照射时，除吸收某些波长的光 之外，还能放射出能量较低（亦即波长较长）的光，这种 现象称为光致发光。 ®荧光物质分子接受光子能量激发后，由激发态的最低 振动能级下降到基态时发射出的光为荧光。 ®荧光分析法某些物质的分子能吸收能量而发射出荧光， 根据荧光的光谱和荧光强度，对物质进行定性或定量的 方法，称为荧光分析法
第十一章 荧光分析法 光致发光 某些物质经光照射时，除吸收某些波长的光 之外，还能放射出能量较低（亦即波长较长）的光，这种 现象称为光致发光。 荧光 物质分子接受光子能量激发后，由激发态的最低 振动能级下降到基态时发射出的光为荧光。 荧光分析法 某些物质的分子能吸收能量而发射出荧光， 根据 荧光的光谱和荧光强度，对物质进行定性或定量的 方法，称为荧光分析法
⊙ 种类：分子荧光，原子荧光。（紫外荧光和可见荧光，还有红 外荧光、X射线荧光等)。 特点： (1)荧光光谱第一个主要优点是灵敏度高、选择性好： 由于荧光辐射的波长比激发光波长长，因此测量到的荧光频率 与入射光的频率不同。另外，由于荧光光谱是发射光谱，可以 在与入射光成直角的方向上检测，这样，荧光不受来自激发光 的本底的干扰，灵敏度大大高于紫外-可见吸收光谱，测量用 的样品量很少，检测限低1010~10-12gmL。 (2)荧光光谱第二个主要优点是信息量大： 荧光光谱能提供较多的信息，例如激发光谱、发射光谱、峰位、 峰强度、荧光寿命等。在生化分析中的应用较广泛
种类：分子荧光，原子荧光。(紫外荧光和可见荧光，还有红 外荧光、X射线荧光等)。 特点： （1）荧光光谱第一个主要优点是灵敏度高、选择性好： 由于荧光辐射的波长比激发光波长长，因此测量到的荧光频率 与入射光的频率不同。另外，由于荧光光谱是发射光谱，可以 在与入射光成直角的方向上检测，这样，荧光不受来自激发光 的本底的干扰，灵敏度大大高于紫外-可见吸收光谱，测量用 的样品量很少，检测限低10-10 ~ 10-12g/mL。 （2）荧光光谱第二个主要优点是信息量大： 荧光光谱能提供较多的信息，例如激发光谱、发射光谱、峰位、 峰强度、荧光寿命等。在生化分析中的应用较广泛
一、荧光分析法的基本原理 二、荧光定量分析方法 三、荧光分光光度计
一、荧光分析法的基本原理 二、荧光定量分析方法 三、 荧光分光光度计
第一节荧光分析法的基本原理 一、分子荧光 (一)分子荧光的产生 1.分子的电子能级与激发过程 ◆当基态分子的一个成对电子吸收光辐射后，被激发跃迁到能量较 高的轨道上，电子 自旋方向不改变，为激发单 重态；以、S0、S1*、S2*表示， 澈发态 如果电子在跃迁过程中，伴随 着自旋方向的改变，这时便 具有两个自旋不配对的电子， 基态 这种受激态称为激发三重态； 激发单重态澈发三重态T 以T,*表示.三重态的能量较低。 电子自旋状态
第一节 荧光分析法的基本原理 一、分子荧光 （一）分子荧光的产生 1. 分子的电子能级与激发过程 当基态分子的一个成对电子吸收光辐射后，被激发跃迁到能量较 高的轨道上，电子 自旋方向不改变，为激发单 重态； 以、S0 、 S1 * 、 S2 *表示. 如果电子在跃迁过程中，伴随 着自旋方向的改变，这时便 具有两个自旋不配对的电子， 这种受激态称为激发三重态； 以T1 * 表示.三重态的能量较低
2.荧光的产生 ■分子在室温时基本上处于电子能级的基态，当吸 收了紫外一可见光后，基态分子中的电子跃迁到 激发单重态的各个不同振动一转动能级，（不能 直接跃迁到激发三重态的各个振动能级) ■处于激发态的分子是不稳定的，以辐射跃迁和韭 辐射跃迁的方式释放能量，返回基态
2.荧光的产生 ◼ 分子在室温时基本上处于电子能级的基态，当吸 收了紫外－可见光后，基态分子中的电子跃迁到 激发单重态的各个不同振动－转动能级，（不能 直接跃迁到激发三重态的各个振动能级）。 ◼ 处于激发态的分子是不稳定的，以辐射跃迁和非 辐射跃迁的方式释放能量，返回基态
非辐射能量传递过程 振动弛豫：在溶液中，处于激发态的溶质分子与溶剂分子 间发生碰撞，把一部分能量以热的形式迅速传递给溶剂分 子，回到同一电子激发态的最低振动能级的过程。 内转换：当激发态S2的较低振动能级与S1*的较高振动能 级的能量相当或重叠时，分子有可能从S2*的振动能级以无 辐射方式过渡到S,*的能量相等的振动能级上的过程
非辐射能量传递过程 振动弛豫：在溶液中，处于激发态的溶质分子与溶剂分子 间发生碰撞，把一部分能量以热的形式迅速传递给溶剂分 子，回到同一电子激发态的最低振动能级的过程。 内转换：当激发态S2 *的较低振动能级与S1 * 的较高振动能 级的能量相当或重叠时，分子有可能从S2 *的振动能级以无 辐射方式过渡到S1 *的能量相等的振动能级上的过程
外转换： 激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而转移能量 的非辐射跃迁；从S,*、T,*最低振动能级回到基态。 外转换使荧光或磷光减弱或“淬灭”。 体系间跨跃： 当电子激发单重态的最低振动能级与电子三重激发态的较 高振动能级相重叠时，发生电子自旋状态改变的S,*一T,* 跃迁，这一过程称为“体系间跨跃
外 转 换： 激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而转移能量 的非辐射跃迁；从S1 * 、 T1 * 最低振动能级回到基态。 外转换使荧光或磷光减弱或“淬灭”。 体系间跨跃: 当电子激发单重态的最低振动能级与电子三重激发态的较 高振动能级相重叠时，发生电子自旋状态改变的 S1 *—T1 * 跃迁，这一过程称为 “体系间跨跃”
·荧光发射 无论分子最初处于哪一个激发单重态，通 过内转换及振动弛豫，均可返回到第一激发单重态的最 低振动能级，然后再以辐射形式发射光量子而返回至基 态的任一振动能级上，这时发射的光量子称为荧光。 ■ 磷光发射 经过体系间跨越的分子再通过振动驰豫降 至激发三重态的最低振动能级，分子在激发三重态的最 低振动能级可以存活一段时间，然后返回至基态的各个 振动能级，而发出光辐射，这种光辐射称为磷光
◼ 荧光发射 无论分子最初处于哪一个激发单重态，通 过内转换及振动弛豫，均可返回到第一激发单重态的最 低振动能级，然后再以辐射形式发射光量子而返回至基 态的任一振动能级上，这时发射的光量子称为荧光。 ◼ 磷光发射 经过体系间跨越的分子再通过振动驰豫降 至激发三重态的最低振动能级，分子在激发三重态的最 低振动能级可以存活一段时间，然后返回至基态的各个 振动能级，而发出光辐射，这种光辐射称为磷光
So 基态 S1*,S2* 激发单重态 a (d) (g) T1* 激发三重态 入1,2： 激发光 (b) 13 荧光 图11-2荧光和磷光产生示意图 n.吸收b.振动地豫。内转换d.荧光 入4 璘光 c外转换1.体系间跨越g醉光 分子吸收和发射过程的能级图
分子吸收和发射过程的能级图 S0 : 基态 S1 * , S2 * : 激发单重态 T1 * : 激发三重态 λ1 , λ2 : 激发光 λ 3 : 荧光 λ 4 : 磷光
电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐 射跃迁（发光）和无辐射跃迁等方式失去能量； 传递途径 辐射跃迁 无辐射跃迁 荧光 磷光 系间跨越 内转移 外转移 振动弛豫 荧光：10-7~109s,第一激发单重态的最低振动能级→基态各振动能级； 磷光：104。~10s,第一激发三重态的最低振动能级→基态各振动能级；
电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐 射跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式失去能量； 荧光：10-7～10 -9 s, 第一激发单重态的最低振动能级→基态各振动能级； 磷光：10-4～10s, 第一激发三重态的最低振动能级→基态各振动能级； 传递途径 辐射跃迁 荧光 振动弛豫 无辐射跃迁 磷光 系间跨越 内转移 外转移