第七章基因精细结构遗传分析 教学内容 第一节基因概念 第二节重组测验 第三节互补测验 第四节缺失作图 第五节断裂基因与重叠基因 第六节基因功能 教学内容要点 基因的概念、重组测验、互补测验、 断裂基因与重叠基因、基因的功能 难点 重组测验、互补测验与基因的功能 7.1基因概念和精细结构 7.1.1基因概念的发展 (1)遗传因子（孟德尔） (2)染色体是基因载体（摩尔根〉 (3)DNA是遗传物质（肺炎双球菌的转化实验） (4)基因是有功能的DNA片段(G.Beadle和E.Tatum:一基因一酶) (⑤)操纵子模型(Jacob和Monod) (6)跳跃基因和断裂基因的发现 表了-1限成中特移植：哈 供体受体移描用的颈色 1 鲜红 鲜红 (33 cn 群红 4) 鲜红 5ù 6 鲜红 7.1.2基因的类别和相互关系 (1)结构基因 (2)rRNA和tRNA基因 (3)启动子和操纵基因 7.1.2基因的类别及其相互关系
第七章 基因精细结构遗传分析 教学内容 第一节 基因概念 第二节 重组测验 第三节 互补测验 第四节 缺失作图 第五节 断裂基因与重叠基因 第六节 基因功能 教学内容要点 基因的概念、重组测验、互补测验、 断裂基因与重叠基因、基因的功能 难点 重组测验、互补测验与基因的功能 7.1 基因概念和精细结构 7.1.1 基因概念的发展 (1)遗传因子(孟德尔） (2)染色体是基因载体（摩尔根） (3)DNA 是遗传物质（肺炎双球菌的转化实验） (4)基因是有功能的 DNA 片段（G.Beadle 和 E. Tatum:一基因一酶） (5)操纵子模型(Jacob 和 Monod) (6)跳跃基因和断裂基因的发现 7.1.2 基因的类别和相互关系 (1)结构基因 (2)rRNA 和 tRNA 基因 (3)启动子和操纵基因 7.1.2 基因的类别及其相互关系 表 7-1 眼成虫盘移植实验 供体 受体 移植眼的颜色 （1） + ν 鲜红 （2） ν + 鲜红 （3） + cn 鲜红 （4） cn + 鲜红 （5） cn ν 橙红 （6） ν cn 鲜红 + 鲜红的（bright red），v:桔黄色眼（vermilion）， c n 橙红色眼（cimnabar），和暗红色眼（scarlet）
根据基因的功能和性质，分为： (一)结构基因(structural genes)与调节基因(regulatory genes) (二)核糖体RM基因(ribosomal RNA genes,简称rDNA)与转移RNA (transfer RNAgenes,.简称tDNA) (三)启动子(promotor)与操纵基因(operator) 前者是转录时RNA聚合酶与DNA结合的部位：后者是调节基因产物阻遏蛋 白或激活蛋白与DNA结合的部位。 7.1.3基因与DN 多数肽链由150~300个氨基酸组成，按三联密码子，须有450~ 900个核苷酸对编码，加上基因内不编码的核苷酸序列，一个基因约 有500~6000个核苷酸对。并非DNA分子上任一含有几千个核苷酸 对的区段都是一个基因，基因是一个含有特定遗传信息的DNA分子区 段。特定核苷酸序列与其转录产物RNA核苷酸序列或翻译产物多肽 链氨基酸序列相对应就是基因，要同时测定某一段DNA的核苷酸序列 和相应产物的序列。 7.2 重组测验 7.2.1拟等位基因 黑腹果蝇红眼由一个显性基因控制，位于X染色体上，果蝇眼睛还 有许多其他颜色，如粉红色、杏色、伊红、象牙色和白色等突变型。 早期研究认为控制这些眼晴颜色性状的基因是等位的，之间是复等 位关系。用“十”代表野生型红色眼基因，W代表杏色眼基因，W代 表白色眼基因，当杏色眼(Wa/wa)与白眼(W/Y)果蝇杂交时， F1为杏色眼，如果w阳与w是等位基因，F1应只有两种亲本表型，但 在大量F1群体中约有1/1000野生型红眼果蝇。红眼的出现不是突 变，因为突变没有如此高频率。 进一步研究证明杏色眼基因和白眼基因虽然在染色体上所占位置相 同，即位于同一基因，但属于不同位点，之间可发生交换。 如杏色眼wa++/wa+x白眼w/Y,F1杏色眼。wa+/+W和wa+/Y, F1雌蝇减数分裂时发生交换形成+与Ww配子，+配子与任何其他配 子结合所形成的F1个体均表现为野生型红眼果蝇，因而F1群体中出 现野牛型个体。 对杏色限Wa+/+W与野生型++/W阳w两种个体进行比较发现，基因 组成一样，但排列不同，前者两个突变分别在两条染色体上，为反式
根据基因的功能和性质，分为: (一)结构基因（structural genes）与调节基因（regulatory genes） (二)核糖体 RNA 基因（ribosomal RNA genes，简称 rDNA）与转移 RNA （transfer RNAgenes，简称 tDNA） (三)启动子（promotor）与操纵基因（operator） 前者是转录时 RNA 聚合酶与 DNA 结合的部位；后者是调节基因产物阻遏蛋 白或激活蛋白与 DNA 结合的部位。 7.1.3 基因与 DNA 多数肽链由 150～ 300 个氨基酸组成，按三联密码子，须有 450～ 900 个核苷酸对编码，加上基因内不编码的核苷酸序列，一个基因约 有 500～6 000 个核苷酸对。并非 DNA 分子上任一含有几千个核苷酸 对的区段都是一个基因，基因是一个含有特定遗传信息的 DNA 分子区 段。 特定核苷酸序列与其转录产物 RNA 核苷酸序列或翻译产物多肽 链氨基酸序列相对应就是基因,要同时测定某一段 DNA 的核苷酸序列 和相应产物的序列。 7.2 重组测验 7.2.1 拟等位基因 黑腹果蝇红眼由一个显性基因控制，位于 X 染色体上，果蝇眼睛还 有许多其他颜色，如粉红色、杏色、伊红、象牙色和白色等突变型。 早期研究认为控制这些眼睛颜色性状的基因是等位的，之间是复等 位关系。用“＋”代表野生型红色眼基因，wa 代表杏色眼基因，w 代 表白色眼基因，当杏色眼（ w a／ wa ）与白眼（w ／Y）果蝇杂交时， F1 为杏色眼，如果 wa 与 w 是等位基因，F１应只有两种亲本表型，但 在大量 F1 群体中约有 1／1000 野生型红眼果蝇。红眼的出现不是突 变，因为突变没有如此高频率。 进一步研究证明杏色眼基因和白眼基因虽然在染色体上所占位置相 同，即位于同一基因，但属于不同位点，之间可发生交换。 如杏色眼 wa+ + /wa + x 白眼 w/Y，F1 杏色眼。wa +/+ w 和 w a +/Y， F1 雌蝇减数分裂时发生交换形成++与 waw 配子，++配子与任何其他配 子结合所形成的 F1 个体均表现为野生型红眼果蝇，因而 F1 群体中出 现野生型个体。 对杏色眼 wa+/+w 与野生型++/ wa w 两种个体进行比较发现,基因 组成一样，但排列不同，前者两个突变分别在两条染色体上，为反式
(trans)排列，后者则是两个突变同时排在一条染色体上，而另一条 染色体上两个位点均正常，为顺式(cis)排列。 反式排列表现为突变型，顺式排列为野生型。这种由于排列方式不 同而表型不同的现象称为顺反位置效应(cis-trans position effects),并将这种紧密连锁的功能性等位基因，但不是结构性的等 位基因称为拟等位基因(pseudoallele)。拟等位基因的发现证明了 基因的可分性。 7.2.2噬菌体突变型 S.Benzer对大肠杆菌噬菌体T4的rIIA和rIIB两个基因的结构 分析，证明了基因的可分性，基因内有大量的突变子和重组子。 噬菌体的突变型可归为： ①噬菌斑形态突变型：一些是由于侵染寄主后溶菌速度的快慢而形成 大小不同的噬菌斑(plaque):另一些是由于被感染细菌是全部或是 部分被杀死而形成清晰或混浊的噬菌斑。 ②寄主范围突变型： 噬菌体感染细菌时，首先吸附于细胞表面专一受体上，由受体基因控 制，如果受体发生改变，可能使噬菌体不能附着，从而该噬菌体的寄 主范围缩小。另外噬菌体突变也可扩大寄生范围。因为决定噬菌斑形 态和宿主范围突变的基因在其基因组中相当狭窄的特定区段里，大多 数基因涉及生命过程必不可少的功能，所以上述突变通常是致死的。 ③条件致死突变型： 条件致死突变型在遗传学研究中具重要意义，通过这种突变已鉴定出噬 菌体的大部分基因 Benzer所用T4的rII突变就是责传学研究中所用的第个条件改 死突变型。 T4噬菌体有多个迅速裂解突变型，分别称为rl,rIL,rIII等 它们位于染色体DNA的不同区段，这3组突变型由于在大肠杆菌不同 菌株上的反应不同可以相互区别 T4rIⅡ突变使所侵染细胞迅速裂解形成大噬菌斑，所以称为rII 突变型 Benzer对rII区域的突变进行了分析：rII突变感染大肠杆菌B菌株 后迅速裂解，形成比野生型大的噬菌斑，从而从大量的r11+中筛选出 r1。另外r11突变型感染带有原噬菌体的大肠杆菌K(入)菌株时， 不产生子代，而野生型 T4rII在大肠杆菌K(入)菌株中能正常增
（trans）排列，后者则是两个突变同时排在一条染色体上，而另一条 染色体上两个位点均正常，为顺式（cis）排列。 反式排列表现为突变型，顺式排列为野生型。这种由于排列方式不 同 而 表型 不同 的现 象 称为 顺反 位置 效 应（ cis-trans position effects），并将这种紧密连锁的功能性等位基因，但不是结构性的等 位基因称为拟等位基因（pseudoallele）。拟等位基因的发现证明了 基因的可分性。 7.2.2 噬菌体突变型 S．Benzer 对大肠杆菌噬菌体 T4 的 r IIA 和 r IIB 两个基因的结构 分析，证明了基因的可分性，基因内有大量的突变子和重组子。 噬菌体的突变型可归为： ①噬菌斑形态突变型：一些是由于侵染寄主后溶菌速度的快慢而形成 大小不同的噬菌斑（plaque）；另一些是由于被感染细菌是全部或是 部分被杀死而形成清晰或混浊的噬菌斑。 ②寄主范围突变型： 噬菌体感染细菌时，首先吸附于细胞表面专一受体上，由受体基因控 制，如果受体发生改变，可能使噬菌体不能附着，从而该噬菌体的寄 主范围缩小。另外噬菌体突变也可扩大寄生范围。因为决定噬菌斑形 态和宿主范围突变的基因在其基因组中相当狭窄的特定区段里，大多 数基因涉及生命过程必不可少的功能，所以上述突变通常是致死的。 ③条件致死突变型： 条件致死突变型在遗传学研究中具重要意义，通过这种突变已鉴定出噬 菌体的大部分基因。 Benzer 所用 T4 的 r II 突变就是遗传学研究中所用的第一个条件致 死突变型。 T4 噬菌体有多个迅速裂解突变型，分别称为 rl， r II，rIII 等， 它们位于染色体 DNA 的不同区段，这 3 组突变型由于在大肠杆菌不同 菌株上的反应不同可以相互区别。 T4 r II 突变使所侵染细胞迅速裂解形成大噬菌斑，所以称为 r II 突变型。 Benzer 对 r II 区域的突变进行了分析： r II 突变感染大肠杆菌 B 菌株 后迅速裂解，形成比野生型大的噬菌斑，从而从大量的 rll+中筛选出 rll。另外 rll 突变型感染带有原噬菌体的大肠杆菌 K（λ）菌株时， 不产生子代，而野生型 T4 rII 在大肠杆菌 K（λ）菌株中能正常增
殖，由此也很容易在r11噬菌体中检出r11+噬菌体，所以可检出两种 不同的r1突变型之间重组频率极低的重组子。 Benzer的噬菊体重组实险 Discovery of Recombination Within the Gene 克B 以4 行 单独 不能正生 Benzer以T4噬菌体为材料进行了研究工作，正式提出“顺反子"这个术语 Benzer 顺反子既念和基因内重组 生出 a8o3.29 typ r4☑ r47 r47 r104 精细 作图 47 r106 r47 r102 该方法称重组测哈(rec mbination est),以遗传图方式确定突变子间的关 系 该法测定重组频率极灵敏，即使在 106rⅡ噬菌体中只出现 个 + 重组子，也可通过感染E.cohK(入)菌株的平板检查出来 7.3互补测验 7.3.1 互补测验原理和方法
殖，由此也很容易在 rll 噬菌体中检出 rll+噬菌体，所以可检出两种 不同的 rll 突变型之间重组频率极低的重组子。 Benzer 以 T4 噬菌体为材料进行了研究工作 ，正式提出“顺反子”这个术语 该方法称重组测验（recombination test），以遗传图方式确定突变子间的关 系。该法测定重组频率极灵敏，即使在 106 r II 噬菌体中只出现一个 rII+ 重组子，也可通过感染 E.coli K(λ)菌株的平板检查出来. 7.3 互补测验 7.3.1 互补测验原理和方法
基础遗传学研究首先须有突变型，然后分析突变型间的关系。重组 测验与互补测验是确定这种关系的两个基本方法」 重组测验以遗传图距确定突变的空间关系，而互补测验则是确定突变 的功能 关系。 如1区有3000多个突变型都有相同表型，这是由于所有的rⅡ突变都导 致丧失合成Ec0ⅱK(入)发育所需要一种或几种蛋白质能力，这些突变型对 E.cK(入)寄主细胞致死，但可在E,cohB菌株细胞中增殖」 既然它们有相同表型，是否它们都影响同 一种遗传功能？中这 3000多个突变型是属于 一个基因还是属于几个基因？为划分这种功能单 位界线，要讲行互补测验。 用不同l突变型成对组合同时感染大肠杆菌K(入)菌株： 如果被双重感染的细菌中产生两种亲代基因型的子代噬菌体（也有少 量重组型的噬菌体)，那么必然是一个突变型补偿了另一个突变型所不具有 的功能，两个突变型称彼此互补()。如果双重感 染 的细 不产生子代噬菌体，那么这两种突变型一定有一个相同功能受到损伤。 互补测验斑点测试法(spot test) 用一种rII突变型以0.1感染比（噬菌体1细菌10）感染E.cohK(入) 菌株。噬菌体和细菌在温热的琼脂中混合，涂布在平板，琼脂凝固后在平 板上划出的 定位置上再加一滴含 一种rⅡ突变型的培养基。在这 培养基范围内， 些细菌会被两种噬菌体所感染。如在这范围内形成噬菌 斑，证明这两种突变型互补，相反不能互补。在一个培养皿平板上可做6~8 个斑点试验。 (I)rIA和rB的突变型可以互朴 rIB HIA+rIB A产物B产物 TIA rIB (2)rIB的两个突变型不能互补 rIB Q TIAt rIB A产物 +不提制 入HIA'FIB 该方法测定重组频率极敏感，重组检出率达1106，理论上可测得0.002% 的重组值，实际上所观察的最小重组频率为0.02%。根据二点杂交的结果， 可作成连锁图 互补测验结果发现，除一些缺失突变型外，突变型可分成rⅡA和「 IB两个互补群。 lA突变型的突变位点都在区的一头，是一个独立的功能单位：所 有邮突变型的突变位点都在l区的另一头，也是一个独立功能单位
基础遗传学研究首先须有突变型，然后分析突变型间的关系。重组 测验与互补测验是确定这种关系的两个基本方法。 重组测验以遗传图距确定突变的空间关系，而互补测验则是确定突变 的功能 关系。 如 rII 区有 3 000 多个突变型都有相同表型，这是由于所有的 r II 突变都导 致丧失合成 E.coli K(λ)发育所需要一种或几种蛋白质能力，这些突变型对 E.coli K(λ)寄主细胞致死，但可在 E.coli B 菌株细胞中增殖。 既然它们有相同表型，是否它们都影响同一种遗传功能？rII 中这 3 000 多个突变型是属于一个基因还是属于几个基因？为划分这种功能单 位界线，要进行互补测验。 用不同 rll 突变型成对组合同时感染大肠杆菌 K(λ)菌株： 如果被双重感染的细菌中产生两种亲代基因型的子代噬菌体（也有少 量重组型的噬菌体），那么必然是一个突变型补偿了另一个突变型所不具有 的功能，两个突变型称彼此互补（complementation）。如果双重感染的细菌 不产生子代噬菌体，那么这两种突变型一定有一个相同功能受到损伤。 互补测验斑点测试法（spot test） 用一种 r II 突变型以 0.1 感染比（噬菌体 1/细菌 10）感染 E.coli K(λ) 菌株。噬菌体和细菌在温热的琼脂中混合，涂布在平板，琼脂凝固后在平 板上划出的一定位置上再加一滴含另一种 r II 突变型的培养基。在这一滴 培养基范围内，一些细菌会被两种噬菌体所感染。如在这范围内形成噬菌 斑，证明这两种突变型互补，相反不能互补。在一个培养皿平板上可做 6～8 个斑点试验。 该方法测定重组频率极敏感，重组检出率达 1/106，理论上可测得 0.002% 的重组值，实际上所观察的最小重组频率为 0.02%。根据二点杂交的结果， 可作成连锁图 。 互补测验结果发现，除一些缺失突变型外， rII 突变型可分成 r IIA 和 r IIB 两个互补群。 rllA 突变型的突变位点都在 rll 区的一头，是一个独立的功能单位；所 有 rllB 突变型的突变位点都在 rll 区的另一头，也是一个独立功能单位
凡属A的突变之间不能互补：同理属于B的突变之间也不能互补， 只有rIA的突变和B的突变间可互补，双重感染E.cohK(入)菌株后可产 说明r11A和r11B是两个独立的功能单位，分别具不同的功能，但 它们又是功能互补的，要在E.coK(入)菌株中增殖，两种功能缺一不可。 可见Ⅱ是由于这两种遗传功能丧失而成的。 R106 51 R106 顺反 则验 106 Apree
凡属 rIIA 的突变之间不能互补；同理属于 rllB 的突变之间也不能互补， 只有 rIIA 的突变和 rllB 的突变间可互补，双重感染 E.coli K(λ)菌株后可产 生子代。 说明 r 11A 和 r 11B 是两个独立的功能单位，分别具不同的功能，但 它们又是功能互补的，要在 E.coliK(λ )菌株中增殖，两种功能缺一不可。 可见 r II 是由于这两种遗传功能丧失而成的。 测验 + + r47 + + r106 K菌株 B菌株 顺反 R106 r51 + + R106 + + r51 R47 106 + +
同一顺反子中的两个突变 A亚区 B亚区 a 一噬菌体1 顺式 野生型 噬菌体2 (A+B) + 赠菌体3 反式 4磁黄体4 赛瓷哥 不同顺式反子中的两个突变 式 上日4噬第体1 野生型 噬菌体2 (AB】 反式 上十一噬曹体3 野生型 T噬菌体4 (AB)】 图3-3顶反子互补试验 口和b是两个突变：两个菌体(1和2，或3和4)杂交，反式杂合子如果是突变 型，表明两个突变不能互补，是发生在同一顺反子中的突变一非等位突变 Benzer将不同突变间没有互补的功能区称为顺顺反子(cistron) 一个顺反子就是一个功能水平上的基因，因此常用顺反子作为基因的同义 词。 如r风里rA是一个顺反子 、B另一个顺反子。每个师反子在边任 体上的区域称为基因座，而每个基因座中有若干个突变位点，是顺反子内 部能发生突变的最小单位。DNA中每一核苷酸对改变都可引起多肽链中氨 基酸改变，从而影响顺反子功能。它们本身没有独立的功能，在它们之间 可以重组。 由此可见顺反子既具有功能上的完整性，又具有结构上的可分割性。 73.3 基因内互补 互补测验中已知同一顺反子内两突变不能互补，但有例外：发生于同一 基因内两个不同位点突变致使两条原来相同的多肽转变成两条分别在不同 位点上发生变异的多肽链，而后将这两条多肽构成双重杂合子，两者配合
Benzer 将不同突变间没有互补的功能区称为顺顺反子（cistron）。 一个顺反子就是一个功能水平上的基因，因此常用顺反子作为基因的同义 词。 如 r II 区里 r IIA 是一个顺反子， rIIB 另一个顺反子。每个顺反子在染色 体上的区域称为基因座，而每个基因座中有若干个突变位点，是顺反子内 部能发生突变的最小单位。DNA 中每一核苷酸对改变都可引起多肽链中氨 基酸改变，从而影响顺反子功能。它们本身没有独立的功能，在它们之间 可以重组。 由此可见顺反子既具有功能上的完整性，又具有结构上的可分割性。 7.3.3 基因内互补 互补测验中已知同一顺反子内两突变不能互补，但有例外: 发生于同一 基因内两个不同位点突变致使两条原来相同的多肽转变成两条分别在不同 位点上发生变异的多肽链，而后将这两条多肽构成双重杂合子，两者配合
起来，可表现程度不同的恢复酶活性部位，称为基因内互补(intragenic complementation)。 基因内互补对互补测验存在一定干扰，通过研究发现，基因内互补与基 因间互补可区分开： ①基因间互补普遍存在，而同一基因内不同位点突变绝大多数不 能互补，只有少数例外。 ②基因内两个突变能互补的只能是点突变，无缺失，突变一定是 错义突变，不是无义突变或移码突变：③基因内互补作用的酶活 性明显低于正常水平，最多只有野生型酶活性的25%，形成的 蛋白质常有某种异常，如温度的稳定性或pH依赖性等。 7.4缺失作图 7.4.1缺失作图原理 Benzer研究rII突变型时发现一些突变由于核苷酸对发生改变，称点 突变(point mutation)。而另一些突变由于缺失相邻的许多核苷酸对，称 缺失突变(deletion mutation)。尽管两种突变形成相同表型效应，但有区 ①点突变是单个位点突变，缺失突变是多个位点突变 (multisitemutation): ②点突变可发生回复突变，而缺失突变不可逆： ③点突变与其他点突变间可发生重组，而缺失突变同另一个点突 变间不 能重组，因为相应片段已缺失。这个杂交中没有一个基因组在这个点 突变位置上正确的核苷酸对，无法通过重组而恢复野生型核苷酸顺序。 7.4.2缺失作图方法 0.5mlE.coiB菌株培养物加1滴缺失型噬菌体和1滴待测rⅡ突变 噬菌体，几分钟后取一滴菌液加在灭菌纸条上，铺在长有E.coK(A)菌 株平板上，经培养如在纸条覆盖区域内形成清晰噬菌斑，说明它们之间 发生重组，产生野生型噬菌体，阴性结果就说明子代中重组体非常低， 空白对照出现几个噬菌斑是点突变回复突变产生的。 通过两个步骤把未定位的rⅡ突变定位在rⅡ区域某个小片段上 第一步将待测突变型与“大缺失”突变型分别进行杂交，以确定这一突 变位点所属大范围：第二步将待测突变型进一步与有关“小缺失”突变型 分别进行杂交，以缩小这一突变点所属的范围。 如待测突变型rⅡ548，第一次杂交结果说明它和缺失突变型A105 和638发生重组，而与其他5个不发生重组，确定这一突变位点在区
起来，可表现程度不同的恢复酶活性部位，称为基因内互补（intragenic complementation）。 基因内互补对互补测验存在一定干扰，通过研究发现，基因内互补与基 因间互补可区分开： ① 基因间互补普遍存在，而同一基因内不同位点突变绝大多数不 能互补，只有少数例外。 ② 基因内两个突变能互补的只能是点突变，无缺失，突变一定是 错义突变，不是无义突变或移码突变；③ 基因内互补作用的酶活 性明显低于正常水平，最多只有野生型酶活性的 25％，形成的 蛋白质常有某种异常，如温度的稳定性或 pH 依赖性等。 7.4 缺失作图 7.4.1 缺失作图原理 Benzer 研究 r II 突变型时发现一些突变由于核苷酸对发生改变，称点 突变(point mutation)。而另一些突变由于缺失相邻的许多核苷酸对，称 缺失突变(deletion mutation)。尽管两种突变形成相同表型效应，但有区 别： ①点突变是单个位点突变，缺失突变是多个位点突变 （multisitemutation）； ②点突变可发生回复突变，而缺失突变不可逆； ③点突变与其他点突变间可发生重组，而缺失突变同另一个点突 变间不 能重组，因为相应片段已缺失。这个杂交中没有一个基因组在这个点 突变位置上正确的核苷酸对，无法通过重组而恢复野生型核苷酸顺序。 7.4.2 缺失作图方法 0.5ml E.coli B 菌株培养物加 1 滴缺失型噬菌体和 1 滴待测 r II 突变 噬菌体，几分钟后取一滴菌液加在灭菌纸条上，铺在长有 E.coliK(A)菌 株平板上，经培养如在纸条覆盖区域内形成清晰噬菌斑，说明它们之间 发生重组，产生野生型噬菌体，阴性结果就说明子代中重组体非常低， 空白对照出现几个噬菌斑是点突变回复突变产生的。 通过两个步骤把未定位的 r II 突变定位在 r II 区域 某个小片段上。 第一步将待测突变型与 “大缺失”突变型分别进行杂交，以确定这一突 变位点所属大范围；第二步将待测突变型进一步与有关“小缺失”突变型 分别进行杂交，以缩小这一突变点所属的范围。 如待测突变型 r II 548，第一次杂交结果说明它和缺失突变型 A105 和 638 发生重组，而与其他 5 个不发生重组，确定这一突变位点在区
域A5中：第二步与A中3个缺失突变型1605、1589、PB230分别进 行杂交，同一原理可把l548进一步定位在A5某一位置上。用该方 法已绘制出r11区域自发突变的精细结构图。P203 可见测定每一个「Ⅱ突变型位置需做两次实验，虽然每次 实验要 做若干杂交组合，但杂交在同一培养皿上用滴加法进行，实际测定工 作很简单。适用于测定大量突变型定位，只需确定这些突变型彼此间 的位置。这一方法还可应用选择性培养方法提高效率，而且杂交后只 需观察能否重组，而无须统计重组子的多少。 这一方法也适用于其他基因定位。 Benzer根据这一原理方便地把数千个独立的rIⅡ突变定位 在rⅡ遗传图上更小的区段内，这种方法称为缺失作图(deletion mapping)。比重组作图简便且精确。因为重组作图工作量大，为了确 定一个新突变的位点，往往要进行大量杂交分析。 缺失作图须有一组重叠缺失突变系作工具，把要测定的突变型 和这一系列缺失突变型分别进行重组测验。凡能和某一缺失突变型进 行重组的，它的位置一定不在缺失范围内，凡不能重组的，它的位置 一定在缺失范围内。Benzer所选择的一组缺失突变就将rl区划分成 47个片段，只需做十几个杂交，而且只要记录E.coK(入)平板上是否 出现重组体，就能将一个新的rⅡ突变位点定位在rⅡ区47个片段 中。 7.5 断裂基因与重登基因 7.5.1 外显子与内含子 传统观点认为每一结构基因是一段连续的DNA序列。法国 Chambon(1977)和美国Berget首次报道基因内部有间隔顺序(space sequence)。提出断裂基因(split gene)概念。 指基因由几个互不相邻的段落组成，内部被长达数百个乃至上 千个核苷酸对的间隔序列（内含子）隔开。自从在猴类病毒SV40和 腺病毒中发现断裂基因以后，又发现珠蛋白基因、卵清蛋白基因、免 疫球蛋白基因、tRNA基因、RNA基因均是断裂基因。高等真核生物 基因多数都有内含子，只有少数基因没有内含子。原核生物的基因 般无内含子。 1977年Flavell和Jeffreys将兔B珠蛋白基因mRNA反转录 成cDNA,然后再与B珠蛋白基因杂交，结果发现B珠蛋白基因片段 比cDNA大两倍，说明B珠蛋白基因内部含有不属于cDNA的片断，即不
域 A5 中；第二步与 A 中 3 个缺失突变型 1605、1589、PB230 分别进 行杂交，同一原理可把 rII 548 进一步定位在 A5 某一位置上。用该方 法已绘制出 r 11 区域自发突变的精细结构图。P203 可见测定每一个 r II 突变型位置需做两次实验，虽然每次 实验要 做若干杂交组合，但杂交在同一培养皿上用滴加法进行，实际测定工 作很简单。适用于测定大量突变型定位，只需确定这些突变型彼此间 的位置。这一方法还可应用选择性培养方法提高效率，而且杂交后只 需观察能否重组，而无须统计重组子的多少。 这一方法也适用于其他基因定位。 Benzer 根据这一原理方便地把数千个独立的 r II 突变定位 在 r II 遗传图上更小的区段内，这种方法称为缺失作图（ deletion mapping）。比重组作图简便且精确。因为重组作图工作量大，为了确 定一个新突变的位点，往往要进行大量杂交分析。 缺失作图须有一组重叠缺失突变系作工具，把要测定的突变型 和这一系列缺失突变型分别进行重组测验。凡能和某一缺失突变型进 行重组的，它的位置一定不在缺失范围内，凡不能重组的，它的位置 一定在缺失范围内。Benzer 所选择的一组缺失突变就将 rll 区划分成 47 个片段，只需做十几个杂交，而且只要记录 E.coli K(λ)平板上是否 出现重组体，就能将一个新的 r II 突变位点定位在 r II 区 47 个片段 中。 7.5 断裂基因与重叠基因 7.5.1 外显子与内含子 传统观点认为每一结构基因是一段连续的 DNA 序列。法国 Chambon （1977）和美国 Berget 首次报道基因内部有间隔顺序（space sequence）。提出断裂基因（split gene）概念。 指基因由几个互不相邻的段落组成，内部被长达数百个乃至上 千个核苷酸对的间隔序列（内含子）隔开。自从在猴类病毒 SV40 和 腺病毒中发现断裂基因以后，又发现珠蛋白基因、卵清蛋白基因、免 疫球蛋白基因、tRNA 基因、rRNA 基因均是断裂基因。高等真核生物 基因多数都有内含子，只有少数基因没有内含子。原核生物的基因一 般无内含子。 1977 年 Flavell 和 Jeffreys 将兔β珠蛋白基因 mRNA 反转录 成 cDNA，然后再与β珠蛋白基因杂交，结果发现β珠蛋白基因片段 比 cDNA 大两倍，说明β珠蛋白基因内部含有不属于 cDNA 的片断，即不
出现在mRNA分子中的非编码序列。同年，Chambon对鸡输卵管的卵清蛋 白基因做了同样的实验，并在电子显微镜下观察，得到了直接证据和相同 的结果： 鸡卵清蛋白基因(ovalbumin gene)mRNA比该基因DNA短很多。用该 mRNA与卵清蛋白DNA杂交，或者先以mRNA为模板反转录出互补 cDNA,然后用这种cDNA与卵清蛋白DNA杂交，再用电子显微镜观察照 相，结果表明A、B、C、D、E、F和G等DNA序列在成熟的mRNA中未 能反应出米。DNA是完整的，只是有些片段找不到可和它配对的mRNA 于是这段DNA拱起来。拱起来的DNA序列可能未转录，至少在成熟的 mRNA序列中没有这部分DNA的转录产物。 将DNA序列中被转录成为mRNA的片段称为外显子(exon或 extron),而在成熟mRNA未转录的DNA区段为内含子(intron)。 卵清蛋白基因含7个内含子，将基因分隔为8个外显子，还有一前导 序列。由此Gbet提出基因是由被表达的外显子镶嵌在沉默的内含子中的 一种嵌合体，而且内含子的核苷酸数量可比外显子多5~10倍。 7.5.2 断裂基因的意义 研究表明，真核生物基因中存在断裂基因具有普遍性，那么在进化中 又有什么意义？ ①有利于储存较多的信息，增加信息量。 一个基因只转录出一种mRNA 但是一些断裂基因以不同剪接方式可产生两种至多种mRNA,编码不同 功能的多肽。如SV40的同一段DNA在一种情况下读成一种蛋白质， 在另一种情况下读成另一种蛋白质。 ②有利于变异和进化。虽然单个碱基改变有时可引起氨基酸改化而造成蛋 白质变化，但很难产生重大改变而形成新蛋白质。 如果这些单个碱基突 变发生在密码子第三位上往往沉默，突变效应会大大降低。而断裂基因 中如果突变发生在内含子与外显子结合部位，就会造成剪接方式改变， 结果使蛋白质结构发生大幅度变化，从而加速进化。 ③增加重组机率。内含子可能不断增减造成新的剪接方式。 一方面形成新 基因，另一方面在剪接过程中增加重组频率；同时断裂基因中由于内含 的存在 基因 度增加，重组频率也增力 ④可能是基因调控序列。内含子可能在基因表达中有一定调控作用，在基 因转录水平上以及在合成mRNA以后的加工过程中起着调控基因表达 的作用
出现在 mRNA 分子中的非编码序列。同年，Chambon 对鸡输卵管的卵清蛋 白基因做了同样的实验，并在电子显微镜下观察，得到了直接证据和相同 的结果： 鸡卵清蛋白基因（ovalbumin gene） mRNA 比该基因 DNA 短很多。用该 mRNA 与卵清蛋白 DNA 杂交，或者先以 mRNA 为模板反转录出互补 cDNA，然后用这种 cDNA 与卵清蛋白 DNA 杂交，再用电子显微镜观察照 相，结果表明 A、B、C、D、E、F 和 G 等 DNA 序列在成熟的 mRNA 中未 能反应出来。DNA 是完整的，只是有些片段找不到可和它配对的 mRNA， 于是这段 DNA 拱起来。拱起来的 DNA 序列可能未转录，至少在成熟的 mRNA 序列中没有这部分 DNA 的转录产物。 将 DNA 序列中被转录成为 mRNA 的片段称为外显子（exon 或 extron），而在成熟 mRNA 未转录的 DNA 区段为内含子（intron）。 卵清蛋白基因含 7 个内含子，将基因分隔为 8 个外显子，还有一前导 序列。由此 Gilbert 提出基因是由被表达的外显子镶嵌在沉默的内含子中的 一种嵌合体，而且内含子的核苷酸数量可比外显子多 5～10 倍。 7.5.2 断裂基因的意义 研究表明，真核生物基因中存在断裂基因具有普遍性，那么在进化中 又有什么意义？ ① 有利于储存较多的信息，增加信息量。一个基因只转录出一种 mRNA， 但是一些断裂基因以不同剪接方式可产生两种至多种 mRNA，编码不同 功能的多肽。如 SV40 的同一段 DNA 在一种情况下读成一种蛋白质， 在另一种情况下读成另一种蛋白质。 ②有利于变异和进化。虽然单个碱基改变有时可引起氨基酸改化而造成蛋 白质变化，但很难产生重大改变而形成新蛋白质。如果这些单个碱基突 变发生在密码子第三位上往往沉默，突变效应会大大降低。而断裂基因 中如果突变发生在内含子与外显子结合部位，就会造成剪接方式改变， 结果使蛋白质结构发生大幅度变化，从而加速进化。 ③增加重组机率。内含子可能不断增减造成新的剪接方式。一方面形成新 基因，另一方面在剪接过程中增加重组频率；同时断裂基因中由于内含 子的存在，基因长度增加，重组频率也增加。 ④可能是基因调控序列。内含子可能在基因表达中有一定调控作用，在基 因转录水平上以及在合成 mRNA 以后的加工过程中起着调控基因表达 的作用