实验技术四 革兰氏染色法 一、实验目的 ➢ 学习并初步掌握革兰氏染色法； ➢了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分 类鉴定中的重要性
实验技术四 革兰氏染色法 一、实验目的 ➢ 学习并初步掌握革兰氏染色法； ➢了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分 类鉴定中的重要性
二、基本原理 革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家 C.Gram创立的。用革兰氏染色法不仅能 观察到细菌的形态而且还可将所有细菌 区分为两大类：G+—— 菌体反应呈深紫 色；G-——菌体反应呈红色
二、基本原理 革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家 C.Gram创立的。用革兰氏染色法不仅能 观察到细菌的形态而且还可将所有细菌 区分为两大类：G+—— 菌体反应呈深紫 色；G-——菌体反应呈红色
二、基本原理 为什么通过革兰氏染色会出现这两种不 同反应的细菌呢？这是由这两类细菌的 细胞壁的结构和化学成份的不同决定的
二、基本原理 为什么通过革兰氏染色会出现这两种不 同反应的细菌呢？这是由这两类细菌的 细胞壁的结构和化学成份的不同决定的
三、实验器材 ➢ 菌种 ➢ 试剂 ➢ 其他器材 大肠杆菌、金黄色葡萄球菌 草酸铵结晶紫、碘液、蕃红、95% 酒精 显微镜、酒精灯、载玻片、接种环、双层瓶、擦镜纸等 或枯草杆菌 或沙黄
三、实验器材 ➢ 菌种 ➢ 试剂 ➢ 其他器材 大肠杆菌、金黄色葡萄球菌 草酸铵结晶紫、碘液、蕃红、95% 酒精 显微镜、酒精灯、载玻片、接种环、双层瓶、擦镜纸等 或枯草杆菌 或沙黄
四、操作步骤 涂片 干燥与固定 草酸铵结 晶紫1min 水洗 碘液助 染1min 镜检 水洗 95%乙醇脱 色20-25s 水洗 蕃红复染 1-2min 水洗 干燥 要用活跃生长期的幼培养物做革兰氏染色， 涂片不宜过厚，以免脱色不完全造成假阳性 火焰固定不宜过热，以玻片不烫手为宜 滴加结晶紫，以刚好将菌膜覆盖为宜，此时， 阳性菌、阴性菌均着上结晶紫的颜色 碘液的助染，使结晶紫和碘在细胞内形成 分子量较大的复合物，不易透出细胞壁。 菌体被染成兰紫色的是革兰氏阳性菌， 被染成红色的是革兰氏阴性菌 乙醇的作用包括脱水和溶脂作用，G+菌脱 色后，细胞透性进一步降低，结晶紫—碘 复合物不易被抽提出来，而保留在细胞内， 复染后仍呈现初染的深紫色；G-菌经乙醇 处理后，脂类被溶解加大了孔径和通透性， 结晶紫-碘复合物容易被抽提出来，复染后， 就着上了蕃红的红色
四、操作步骤 涂片 干燥与固定 草酸铵结 晶紫1min 水洗 碘液助 染1min 镜检 水洗 95%乙醇脱 色20-25s 水洗 蕃红复染 1-2min 水洗 干燥 要用活跃生长期的幼培养物做革兰氏染色， 涂片不宜过厚，以免脱色不完全造成假阳性 火焰固定不宜过热，以玻片不烫手为宜 滴加结晶紫，以刚好将菌膜覆盖为宜，此时， 阳性菌、阴性菌均着上结晶紫的颜色 碘液的助染，使结晶紫和碘在细胞内形成 分子量较大的复合物，不易透出细胞壁。 菌体被染成兰紫色的是革兰氏阳性菌， 被染成红色的是革兰氏阴性菌 乙醇的作用包括脱水和溶脂作用，G+菌脱 色后，细胞透性进一步降低，结晶紫—碘 复合物不易被抽提出来，而保留在细胞内， 复染后仍呈现初染的深紫色；G-菌经乙醇 处理后，脂类被溶解加大了孔径和通透性， 结晶紫-碘复合物容易被抽提出来，复染后， 就着上了蕃红的红色
思 考 题 1. 制作革兰氏染色涂片为什么不能过于浓 厚？其染色成败的关键一步是什么？ 2. 当你对一株未知菌进行革兰氏染色时， 怎样能确定你的染色技术操作正确，结 果可靠？
思 考 题 1. 制作革兰氏染色涂片为什么不能过于浓 厚？其染色成败的关键一步是什么？ 2. 当你对一株未知菌进行革兰氏染色时， 怎样能确定你的染色技术操作正确，结 果可靠？