第十二章 荧光分析法 (fluorometry) 2021/2/24
2021/2/24 第十二章 荧光分析法 （fluorometry)
荧光与荧光分析法 (fluorescene and fluorometry) ◆荧光( fluorescene) 物质分子接受光子能量被激发后,从激发态 的最低能级返回基态时发射出的光。 今荧光分析法( fluorometry): 根据物质的荧光谱线位置及其强度进行物质 鉴定和含量测定的方法。选择性好,灵敏度 高,检测限达100g/m1,甚至10-12g/m1
荧光与荧光分析法 （fluorescene and fluorometry) ❖荧光（fluorescene): 物质分子接受光子能量被激发后，从激发态 的最低能级返回基态时发射出的光。 ❖荧光分析法（fluorometry)： 根据物质的荧光谱线位置及其强度进行物质 鉴定和含量测定的方法。选择性好，灵敏度 高，检测限达10-10g/ml,甚至10-12g/ml
电子能级的多重态 电子能级的多重度:M=2S+1 S为电子自旋量子数的代数和(0或1) M=1,单重态,用S表示( single state) M=3,三重态,用T表示( triplet state) 能 ↑(禁阻跃迁 量↓ 单重基态激发单重态激发三重态
电子能级的多重态 电子能级的多重度：M=2S+1 S为电子自旋量子数的代数和(0或1) M=1，单重态，用S表示（single state） M＝3，三重态，用T表示（tripletstate） ↑↓ ↑ ↑ ↑ ↓ 能 量 单重基态 激发单重态 激发三重态 禁阻跃迁
内转换 振动弛豫 体系间跨越 能量 吸收 发射荧光 (外转换 发射磷光
S2 S1 S0 T1 吸 收 发 射 荧 光 发 射 磷 光 能 量 l l 1 2 l 3 外转换 l 2 内转换 振动弛豫 体系间跨越
激发态→基态 的能量传递途径 传递途径 辐射跃迁 无辐射跃迁 荧光『磷光体系间跨越囱转换卧转换桭动弛瓈 激发态停留时间短、返回速度快的途径,发生的几率大, 发光强度相对大。 荧光:107~109s,第一激发单重态的最低振动能级→基态 磷光:10-~10s,第一激发三重态的最低振动能级→基态
激发态→基态 的能量传递途径 传递途径 辐射跃迁 荧光 体系间跨越 内转换 外转换 振动弛豫 无辐射跃迁 激发态停留时间短、返回速度快的途径，发生的几率大， 发光强度相对大。 荧光：10-7～10 -9 s, 第一激发单重态的最低振动能级→基态 磷光：10-4～10s， 第一激发三重态的最低振动能级→基态 磷光
激发光谱与荧光光谱 excitation spectrum and fluorescence spectrum 1.荧光(磷光)的激发光谱曲线 固定测量波长(选最大发射波长),化合物 发射的荧光(磷光)强度与照射光波长的关系 曲线 激发光谱曲线的最高处,处于激发态的分 子最多,荧光强度最大
激发光谱与荧光光谱 excitation spectrum and fluorescence spectrum 1.荧光(磷光)的激发光谱曲线 固定测量波长(选最大发射波长),化合物 发射的荧光(磷光)强度与照射光波长的关系 曲线 。 激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分 子最多，荧光强度最大
激发光谱与荧光光谱 excitation spectrum and fluorescence spectrum 2.荧光(磷光)的发 射光谱曲线:固定 激发光波长(选最大 Ⅲ 激发波长),化合物 发射的荧光(或磷光 强度)与发射光波长 300 0 500 关系曲线。 nm 荼的激发光谱(I)、荧光光谱() 和磷光光谱(Ⅲ)
2.荧光(磷光)的发 射光谱曲线：固定 激发光波长(选最大 激发波长), 化合物 发射的荧光(或磷光 强度)与发射光波长 关系曲线。 激发光谱与荧光光谱 excitation spectrum and fluorescence spectrum 萘的激发光谱（Ⅰ）、荧光光谱（Ⅱ） 和磷光光谱（Ⅲ）
荧光发射光谱磷光光谱 F 荧光激发光谱 200260320380440500560620mm 室温下菲的乙醇溶液荧(磷)光光谱
200 260 320 380 440 500 560 620 荧光激发光谱 荧光发射光谱 磷光光谱 室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱 nm F
激发光谱与发射光谱的关系 1. Stokes位移 荧光发射光谱波长大于激发光谱波长的现象。 内转换和振动弛豫是主要原因。 2.发射光谱的形状与激发波长无关 电子跃迁到不同激发态能级,吸收不同波长的能 量,产生不同吸收带,但均回到第一激发单重态的最 低振动能级再跃迁回到基态,产生一个发射带。 3.镜像关系 通常荧光发射光谱与它的吸收光谱成镜像对称 关系
激发光谱与发射光谱的关系 1.Stokes位移 荧光发射光谱波长大于激发光谱波长的现象。 内转换和振动弛豫是主要原因。 2.发射光谱的形状与激发波长无关 电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能 量,产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最 低振动能级再跃迁回到基态，产生一个发射带。 3.镜像关系 通常荧光发射光谱与它的吸收光谱成镜像对称 关系
100 a bI co 荧光强度 280 360 440 520 n 波长 蒽的激发光谱和荧光光谱
n m 蒽的激发光谱和荧光光谱