华中农业大学创建国家精品课程—细胞工程学文本教案(第三章) 主讲教师:柳俊博士、教授 第三章离体培养下的遗传与变异(5学时) 教学目的与要求 掌握离体培养中体细胞变异的特点和规律;了解体细胞变异的细胞遗传学和分子遗传学 基础;掌握体细胞变异的应用途径和选择方法。 细胞组织的离体培养属于无性繁殖范畴。从理论上来说,无论是细胞还是组织培养 再生的个体均承传了母体的遗传基础,这也是离体培养技术作为植物快速繁殖应用的基 由于培育过程的影响,离体培养的细胞、愈伤组织以及再生植株均普遍存在着变异。 由于离体培养条件下并没有发生雌雄配子的受精,因此, Larkin和 Scowcroft(1981)提出 把由任何形式的细胞培养所产生的植株统称为体细胞无性系( somaclones),而把这些植 株所表现出来的变异称之为体细胞无性系变异( somaclonal variation) 就对生物遗传的影响而言,细胞工程技术本身包含了双重性:遗传的稳定性和变异 性 第一节离体培养中的遗传与变异特点 离体培养中的遗传稳定性 离体培养的细胞学基础是有丝分裂。有丝分裂的DNA半保留复制和染色体均等分裂机 制,从理论上可以保证离体培养物在一般情况下的遗传稳定性。 在准确选择培养方式的前提下,离体无性繁殖可以具有较高的遗传稳定性( Phillip 等,1994)。正是基于这一理论,利用离体培养技术建立了多种植物的无性繁殖体系。 离体培养的遗传稳定性表现的另一个方面是,即使发生某些变异,也可以即时淘汰变 异 、离体培养条件下遗传变异的特点 普遍性 变异可发生在各种培养类型中; 变异发生在各种植物的培养中 变异发生与培养类型有关。 表3.1部分植物离体培养再生植株的表型变异频率* 植物种类 再生植株来源 变异频率(%) 体细胞愈伤组织10 水稻 胚愈伤组织 719 甘蔗 幼叶愈伤组织 18 玉米 体细胞愈伤组织 蔓青 花粉植株 12.7
华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 文本教案(第三章) 主讲教师：柳俊博士、教授 第三章 离体培养下的遗传与变异（5 学时） 教学目的与要求： 掌握离体培养中体细胞变异的特点和规律；了解体细胞变异的细胞遗传学和分子遗传学 基础；掌握体细胞变异的应用途径和选择方法。 细胞组织的离体培养属于无性繁殖范畴。从理论上来说，无论是细胞还是组织培养， 再生的个体均承传了母体的遗传基础，这也是离体培养技术作为植物快速繁殖应用的基 础。 由于培育过程的影响，离体培养的细胞、愈伤组织以及再生植株均普遍存在着变异。 由于离体培养条件下并没有发生雌雄配子的受精，因此，Larkin 和 Scowcroft（1981）提出 把由任何形式的细胞培养所产生的植株统称为体细胞无性系（somaclones），而把这些植 株所表现出来的变异称之为体细胞无性系变异（somaclonal variation）。 就对生物遗传的影响而言，细胞工程技术本身包含了双重性：遗传的稳定性和变异 性。 第一节 离体培养中的遗传与变异特点 一、离体培养中的遗传稳定性 离体培养的细胞学基础是有丝分裂。有丝分裂的 DNA 半保留复制和染色体均等分裂机 制，从理论上可以保证离体培养物在一般情况下的遗传稳定性。 在准确选择培养方式的前提下，离体无性繁殖可以具有较高的遗传稳定性（Phillip 等，1994）。正是基于这一理论，利用离体培养技术建立了多种植物的无性繁殖体系。 离体培养的遗传稳定性表现的另一个方面是，即使发生某些变异，也可以即时淘汰变 异。 二、离体培养条件下遗传变异的特点 普遍性： 变异可发生在各种培养类型中； 变异发生在各种植物的培养中； 变异发生与培养类型有关。 表 3.1 部分植物离体培养再生植株的表型变异频率* 植 物 种 类 再生植株来源 变异频率（％） 烟 草 体细胞愈伤组织 10 水 稻 胚愈伤组织 71.9 甘 蔗 幼叶愈伤组织 >18 玉 米 体细胞愈伤组织 14 蔓 青 花粉植株 12.7
华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 文本教案(第三章) 主讲教师:柳俊博士、教授 大麦 花粉植株 0-15 幼叶愈伤组织 马铃薯 肉原生质体 菠萝 冠芽愈伤组织 7 腋芽愈伤组织 裔芽愈伤组织 伤组织 100 引自李宝健和曾庆平,1990 局限性: 从表型上看,在不同植物类型中经常发生的体细胞变异主要是植株形态(株高、叶 形、叶色等)、生长势、育性、某些抗性等性状的变异。 从生理生化特性上看,容易出现同功酶谱、次生代谢的消长等变异。 些单基因控制的性状不仅发生隐形突变,也发生显性突变。 嵌合性: 嵌合性是指同一有机体中同时存在有遗传组成不同的细胞,它是组织培养中常见的现 表3.2 Triticum durun6个无性系植株体细胞染色体数* 括号外为个体数,括号内为染色体数) 序号2n58 1(7) 737(16~24,26) 8(29.39.4 35(17,20,23)111(33) 5(9,11,621(15,18,21 12) 27) 3(7) 4(16,21,2,223 27) 51(11)65(15.22.26)14 (32) 18(18,20~26)21 (40) 引自张冬生,1989。 、影响体细胞遗传与变异的因素 供体植物 供体植物倍性水平;基因型;外植体细胞分化程度 表3.3谷子体细胞无性系R2的变异频率* R2未变异株系变异株系 总变 基因型株系株系百分稳定变%分离变%异 数 %异
华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 文本教案(第三章) 主讲教师：柳俊博士、教授 大 麦 花粉植株 10-15 番 茄 幼叶愈伤组织 >5.8 马铃薯 叶肉原生质体 100 菠 萝 冠芽愈伤组织 7 腋芽愈伤组织 34 裔芽愈伤组织 98 幼果愈伤组织 100 * 引自李宝健和曾庆平，1990。 局限性： 从表型上看，在不同植物类型中经常发生的体细胞变异主要是植株形态（株高、叶 形、叶色等）、生长势、育性、某些抗性等性状的变异。 从生理生化特性上看，容易出现同功酶谱、次生代谢的消长等变异。 一些单基因控制的性状不仅发生隐形突变，也发生显性突变。 嵌合性： 嵌合性是指同一有机体中同时存在有遗传组成不同的细胞，它是组织培养中常见的现 象。 表 3.2 Triticum durum 6 个无性系植株体细胞染色体数* （括号外为个体数，括号内为染色体数） 序号 2n58 1 1（7） 7 37（16～24, 26） 76 8（29, 39, 40） 4 2 2 3 5（17, 20, 23） 11 1（33） 1 3 5（9, 11, 12） 6 21（15,18,21～ 27） 33 3 4 3（7） 1 4（16, 21, 22, 27） 22 3 5 1（11） 6 5（15, 22, 26） 14 1（32） 6 2（12） 1 18（18, 20～26） 21 1（40） 2 * 引自张冬生，1989。 三、影响体细胞遗传与变异的因素 1．供体植物 供体植物倍性水平；基因型；外植体细胞分化程度 表 3.3 谷子体细胞无性系 R2 的变异频率* 基因型 R2 株系 数 未变异株系 变 异 株 系 株系 数 百分 率％ 稳定变 异 ％ 分离变 异 ％ 总变 异 ％
华中农业大学创建国家精品课程—细胞工程学文本教案(第三章) 主讲教师:柳俊博士、教授 豫谷1号21020195.7009434.3 豫谷5号120 4.211 高39 170 1528943 15 8.810.6 郑407 121 11090.93 2.58 6.69.1 冀谷145539 70.94 7312 21.829.1 32932 C445 100 83 83.06 6.011 110170 矮宁黄 引自刁现民等,2002。 2.培养基及培养方式 不同的激素浓度可以有选择地诱导不同倍性的细胞的分裂。 激素除了引起染色体倍性的增加外,在一些培养中还发现染色体倍性减少的现象。 培养基的物理状态以及培养类型也会引起细胞的变异。一般来讲,悬浮培养的细胞较 半固体培养的细胞易产生变异。 3.继代培养的次数 般来讲,继代时间越长,继代次数越多,细胞变异的几率就越高。 表34培养时间对掌叶半夏愈伤组织染色体变异的影响* 培养时 亚二倍体 二倍体 多倍体和非整倍 观察细胞数 体 (月) 细胞百分细胞%6细胞%6 率% 152 65 70.79 3 l1.8 76.56 118 12 30.0 54.07 14.0 39819 22.9 *引自李亮亮等,1998。 第二节体细胞变异的细胞遗传学基础 DNA核内重复复制 DNA在核内重复复制( endoreduplication)但不发生细胞分裂,其结果是染色体组数增 加,形成同源多倍体。如果这种DNA重复复制多次发生,细胞内DNA含量就会不断上 表35硬粒小麦中胚轴培养中DNA值的变化* 不同DNA值细胞比例(%) 培养天数8 5 80.7 16.8 2.5 4.8 795 6.6 79 0.9 引自张冬生,1989
华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 文本教案(第三章) 主讲教师：柳俊博士、教授 豫谷 1 号 豫谷 5 号 高 39 郑 407 冀谷 14 号 C445 矮宁黄 210 120 170 121 55 70 100 201 104 152 110 39 47 83 95.7 86.7 89.4 90.9 70.9 67.1 83.0 0 5 3 3 4 0 6 0 4.2 8 2.5 7.3 0 6.0 9 11 15 8 12 23 11 4.3 9.1 8.8 6.6 21.8 32.9 11.0 4.3 13.3 10.6 9.1 29.1 32.9 17.0 * 引自刁现民等，2002。 2．培养基及培养方式 不同的激素浓度可以有选择地诱导不同倍性的细胞的分裂。 激素除了引起染色体倍性的增加外，在一些培养中还发现染色体倍性减少的现象。 培养基的物理状态以及培养类型也会引起细胞的变异。一般来讲，悬浮培养的细胞较 半固体培养的细胞易产生变异。 3．继代培养的次数 一般来讲，继代时间越长，继代次数越多，细胞变异的几率就越高。 表 3.4 培养时间对掌叶半夏愈伤组织染色体变异的影响* 培养时 间 （月） 观察细胞数 亚二倍体 二倍体 多倍体和非整倍 体 细胞 数 百分 率％ 细胞 数 ％ 细胞 数 ％ 1 3 12 18 92 51 50 83 14 6 15 29 15.2 11.8 30.0 34.9 65 39 27 33 70.7 76.5 54.0 39.8 9 6 7 19 9.8 11.8 14.0 22.9 * 引自李亮亮等，1998。 第二节 体细胞变异的细胞遗传学基础 一、DNA 核内重复复制 DNA 在核内重复复制（endoreduplication）但不发生细胞分裂，其结果是染色体组数增 加，形成同源多倍体。如果这种 DNA 重复复制多次发生，细胞内 DNA 含量就会不断上 升。 表 3.5 硬粒小麦中胚轴培养中 DNA 值的变化* 培养天数 不同 DNA 值细胞比例（％） 8c 0 88.3 11.7 5 80.7 16.8 2.5 13 4.8 79.5 6.6 9.1 17 9.7 81.5 7.9 0.9 * 引自张冬生，1989
华中农业大学创建国家精品课程—细胞工程学文本教案(第三章) 主讲教师:柳俊博士、教授 染色体断裂与重组 染色体结构变异是体细胞变异的另一重要类型。染色体断裂与重组是离体培养中染色 体结构变异的主要原因之一,也是体细胞变异中经常发生的现象 染色体结构变异的细胞学特征是,分裂中期出现断裂的染色体片段、落后染色体以及 染色体桥,其结果是在体细胞中出现染色体易位、缺失、倒位等多种类型的结构变异 、非正常有丝分裂 离体培养中,染色体除了整倍性变异外,还可观察到大量的非整倍性变异,这种愈伤 组织往往分化能力低下,再生植株大多生长不正常,有性繁殖的遗传稳定性差。纺锤体形 成异常使得有丝分裂不正常是其原因之 非正常有丝分裂包括多极纺锤体形成和核裂。 第三节体细胞变异的分子遗传学基础 、碱基突变 碱基突变是指DNA序列中碱基的改变。如果改变碱基的DNA序列处于结构基因的位 置或调控序列的位置,就可能导致遗传状态的改变。碱基突变是产生体细胞变异的重要途 径之 对于单基因控制的遗传性状,大多数碱基突变可以稳定遗传,而且符合孟德尔遗传分 离规律,这一点已在水稻、烟草和玉米的体细胞变异中得以证实(张春义和杨汉民, 1994) 、DNA序列的选择性扩增与丢失 在许多植物中均观察到,DNA分子中一些重复序列在培养条件下发生了扩增。 Capitan 等(1988)以生物素标记的480bp重复序列DNA片段为探针,发现小黑麦杂种再生植株当 代限R染色体短臂端粒位置上的这种重复序列发生了扩增,而且这种扩增可以遗传至少三 在许多植物种类中还观察到,在组织培养过程中,以及经组织培养再生的植株,甚至 在这些植株的后代中,有时也会发生DNA序列丢失的现象。 现有资料显示,DNA序列丢失多发生在rDNA及其间隔序列,某些重复序列DNA区 域也易发生丢失 研究还发现,DNA的减少不仅发生在核DNA中,也有发生在叶绿体基因组中。一些 DNA序列的减少只发生在愈伤组织形成阶段,植株再生过程中又恢复到正常状态,目前还 不清楚这种变化的生物学意义 转座子活化 转座子( transposon)首先是由 McClintock在玉米中发现的,现已证实它是引起许多遗 传不稳定现象的重要原因。 上个世纪80年代, Larkin和 Scowcroft首先提出,转座因子的活化可能是体细胞无性系 变异的原因之 我国学者朱至清(1991)认为,也可能是转座子在培养环境中首先被激活而转座,从 而造成染色体的结构变异
华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 文本教案(第三章) 主讲教师：柳俊博士、教授 二、染色体断裂与重组 染色体结构变异是体细胞变异的另一重要类型。染色体断裂与重组是离体培养中染色 体结构变异的主要原因之一，也是体细胞变异中经常发生的现象。 染色体结构变异的细胞学特征是，分裂中期出现断裂的染色体片段、落后染色体以及 染色体桥，其结果是在体细胞中出现染色体易位、缺失、倒位等多种类型的结构变异。 三、非正常有丝分裂 离体培养中，染色体除了整倍性变异外，还可观察到大量的非整倍性变异，这种愈伤 组织往往分化能力低下，再生植株大多生长不正常，有性繁殖的遗传稳定性差。纺锤体形 成异常使得有丝分裂不正常是其原因之一。 非正常有丝分裂包括多极纺锤体形成和核裂。 第三节 体细胞变异的分子遗传学基础 一、碱基突变 碱基突变是指 DNA 序列中碱基的改变。如果改变碱基的 DNA 序列处于结构基因的位 置或调控序列的位置，就可能导致遗传状态的改变。碱基突变是产生体细胞变异的重要途 径之一。 对于单基因控制的遗传性状，大多数碱基突变可以稳定遗传，而且符合孟德尔遗传分 离规律，这一点已在水稻、烟草和玉米的体细胞变异中得以证实（张春义和杨汉民， 1994）。 二、DNA 序列的选择性扩增与丢失 在许多植物中均观察到，DNA 分子中一些重复序列在培养条件下发生了扩增。Lapitan 等（1988）以生物素标记的 480 bp 重复序列 DNA 片段为探针，发现小黑麦杂种再生植株当 代 7R 染色体短臂端粒位置上的这种重复序列发生了扩增，而且这种扩增可以遗传至少三 代。 在许多植物种类中还观察到，在组织培养过程中，以及经组织培养再生的植株，甚至 在这些植株的后代中，有时也会发生 DNA 序列丢失的现象。 现有资料显示，DNA 序列丢失多发生在 rDNA 及其间隔序列，某些重复序列 DNA 区 域也易发生丢失。 研究还发现，DNA 的减少不仅发生在核 DNA 中，也有发生在叶绿体基因组中。一些 DNA 序列的减少只发生在愈伤组织形成阶段，植株再生过程中又恢复到正常状态，目前还 不清楚这种变化的生物学意义。 三、转座子活化 转座子（transposon）首先是由 McClintock 在玉米中发现的，现已证实它是引起许多遗 传不稳定现象的重要原因。 上个世纪 80 年代，Larkin 和 Scowcroft 首先提出，转座因子的活化可能是体细胞无性系 变异的原因之一。 我国学者朱至清（1991）认为，也可能是转座子在培养环境中首先被激活而转座，从 而造成染色体的结构变异
华中农业大学创建国家精品课程—细胞工程学文本教案(第三章) 主讲教师:柳俊博士、教授 目前关于转座子引起体细胞变异的直接实验证据还十分有限,但许多学者认为,用转 座子解释体细胞变异有许多合理性,如变异频率高、沉默基因活化等。因此,有关转座子 在体细胞无性系变异中的作用,也是将来体细胞遗传变异研究的热点 四、DNA甲基化 DNA甲基化( methylation)在基因表达调控中具有重要作用。 离体培养再生植株的甲基化变化首先在玉米体细胞无性系再生植株中发现。来自玉米 幼胚再生植株的某些无性系与供体相比发生了超甲基化,而另一些再生植株却只在与G相 邻的C上发生甲基化,而且这种甲基化在基因组中的分布是不均匀的 胡萝卜、番茄、马铃薯等多种植物的培养细胞或再生植株中,均报道发现了因DNA甲 基化改变而产生的体细胞变异(刁现民和孙敬三,1994) 除了DNA甲基化程度的增加外,离体培养中的某些变异还来自于DNA甲基化程度的 降低。最典型的例子是油棕体细胞胚植株由于甲基化的减少而造成的雄蕊雌性化变异 ( Rival,1997)。 第四节体细胞无性系变异的诱导与选择 体细胞无性系变异的表示方法主要有两种: 种是 Chaleff(1981)提出的以R0、R1、R2、…分别代表体细胞无性系变异的当代 和自交以后的世代 另一种是由 Larkin和 Scowcroft(1983)提出的以SCl、RC2、RC3、…来分别代表体 细胞无性系变异的当代和自交以后的世代。现在,这两种表述方式在体细胞无性系变异研 究中均有应用 离体条件下的体细胞无性系变异的筛选有以下一些明显的优点 (1)由于筛选可以在离体条件下进行,从而可以在小空间内对大量个体进行选择。 (2)细胞突变体的筛选可以在几个细胞周期内完成,且不受季节限制,因此筛选效率 高 (3)因为试验是在人工设计的培养条件下进行的,因此诱变和筛选条件可以根据需要 进行调节和控制,从而提高了试验的重复性。 (4)由于变异是在单细胞水平上进行的,因此,一个突变体就是来自一个细胞,不会 有非突变细胞的干扰,避免了整体植株水平上无性变异常呈现出的嵌合体,因而可以省去 变异分离的麻烦。 (5)在细胞培养系统中,理化诱变剂可较均匀地接触细胞,因此可以引起培养细胞相 对较高频率地发生突变,增加了选择机会 体细胞变异诱导材料的选择 选择起始材料需根据试验目标确定,一般需考虑以下几方面的问题: 其一,目标性状的可行性。体细胞突变的频率虽然较高,但对于某一个体来讲,变异 的性状是个别的,因此选择综合性状良好的植物品种材料,通过诱变改变个别不良性状, 是体细胞突变系选择的目的 其二,必需充分考虑试验植物的细胞培养技术水平,只有对起始材料有良好的培养技 术,才有可能制定完满的诱变及选择方案。如果起始细胞的培养技术不成熟,不能再生整 株,则不能进行后续的各项操作。 其三,适当的细胞类型亦是提高体细胞突变系筛选效率的重要条件
华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 文本教案(第三章) 主讲教师：柳俊博士、教授 目前关于转座子引起体细胞变异的直接实验证据还十分有限，但许多学者认为，用转 座子解释体细胞变异有许多合理性，如变异频率高、沉默基因活化等。因此，有关转座子 在体细胞无性系变异中的作用，也是将来体细胞遗传变异研究的热点。 四、DNA 甲基化 DNA 甲基化（methylation）在基因表达调控中具有重要作用。 离体培养再生植株的甲基化变化首先在玉米体细胞无性系再生植株中发现。来自玉米 幼胚再生植株的某些无性系与供体相比发生了超甲基化，而另一些再生植株却只在与 G 相 邻的 C 上发生甲基化，而且这种甲基化在基因组中的分布是不均匀的。 胡萝卜、番茄、马铃薯等多种植物的培养细胞或再生植株中，均报道发现了因 DNA 甲 基化改变而产生的体细胞变异（刁现民和孙敬三，1994）。 除了 DNA 甲基化程度的增加外，离体培养中的某些变异还来自于 DNA 甲基化程度的 降低。最典型的例子是油棕体细胞胚植株由于甲基化的减少而造成的雄蕊雌性化变异。 （Rival，1997）。 第四节 体细胞无性系变异的诱导与选择 体细胞无性系变异的表示方法主要有两种： 一种是 Chaleff（1981）提出的以 R0、R1、R2、…分别代表体细胞无性系变异的当代 和自交以后的世代； 另一种是由 Larkin 和 Scowcroft（1983）提出的以 SC1、RC2、RC3、…来分别代表体 细胞无性系变异的当代和自交以后的世代。现在，这两种表述方式在体细胞无性系变异研 究中均有应用。 离体条件下的体细胞无性系变异的筛选有以下一些明显的优点： （1）由于筛选可以在离体条件下进行，从而可以在小空间内对大量个体进行选择。 （2）细胞突变体的筛选可以在几个细胞周期内完成，且不受季节限制，因此筛选效率 高。 （3）因为试验是在人工设计的培养条件下进行的，因此诱变和筛选条件可以根据需要 进行调节和控制，从而提高了试验的重复性。 （4）由于变异是在单细胞水平上进行的，因此，一个突变体就是来自一个细胞，不会 有非突变细胞的干扰，避免了整体植株水平上无性变异常呈现出的嵌合体，因而可以省去 变异分离的麻烦。 （5）在细胞培养系统中，理化诱变剂可较均匀地接触细胞，因此可以引起培养细胞相 对较高频率地发生突变，增加了选择机会。 一、体细胞变异诱导材料的选择 选择起始材料需根据试验目标确定，一般需考虑以下几方面的问题： 其一，目标性状的可行性。体细胞突变的频率虽然较高，但对于某一个体来讲，变异 的性状是个别的，因此选择综合性状良好的植物品种材料，通过诱变改变个别不良性状， 是体细胞突变系选择的目的。 其二，必需充分考虑试验植物的细胞培养技术水平，只有对起始材料有良好的培养技 术，才有可能制定完满的诱变及选择方案。如果起始细胞的培养技术不成熟，不能再生整 株，则不能进行后续的各项操作。 其三，适当的细胞类型亦是提高体细胞突变系筛选效率的重要条件
华中农业大学创建国家精品课程—细胞工程学文本教案(第三章) 主讲教师:柳俊博士、教授 、培养细胞的自发变异 离体培养的植物细胞会出现较高频率的自发变异, 离体培养中体细胞自发突变所产生的变异往往比较稳定,没有人工诱变的后续干扰, 有利于分离和选择。育种家们应用自发突变的这些优点,已选育出一些新品种,如美国 RNA植物技术公司己从番茄体细胞无性系变异中选育出新品种,台湾的育种家也从甘蔗体 细胞无性系再生植株变异中选育出新品种。 、培养细胞的诱变 1.物理诱变 物理诱变主要是通过射线、磁场以及温度等对培养物进行一定处理,然后对处理后的 培养物进行培养筛选。常用的射线处理包括X射线、γ射线、快中子、紫外线等 2.化学诱变 化学诱变是通过在培养基中添加一些化学物质,细胞对这些化学物质吸收后直接或间 接引起碱基突变。常用的化学诱变剂主要有: 烷化剂(硫酸二乙酯DES,乙基磺酸乙酯EES,甲基黄酸乙酯EMS,环氧乙烷 EO,乙烯亚胺HI等),此类诱变剂有一个或多个活化烷基,可与DNA分子中的碱基或磷 酸基结合,改变DNA的结构而引起突变; 碱基类似物(5一溴尿嘧啶是胸腺嘧啶类似物,2一氨基嘌呤是腺嘌呤类似物等),在 细胞内核酸复制时,这些类似物可以掺入到新合成的DNA分子中引起错配; 移码诱变剂,如ICR化合物和吖啶类似物等 其它如亚硝酸、羟胺等某些抗菌素亦可引起突变产生。 3.复合因子诱变 诱变处理可以是单因子处理,亦可以是复合因子诱变。一般来说,复合诱变的效果比 单因子诱变好。 4.转座子插入诱变 转座子既可直接将外源基因带入细胞内获得新性状,又可以独立插入通过其转座功能 诱导变异。 目前,使用较多的转座子体系主要是玉米的AcDs系统,其主要操作过程是,首先采 用基因转化的方法将AcDs导入受体细胞,再通过体细胞培养或再生植株的自交或测交使 Ac因子切除,由于转座子插入的随机性,即可在切除Ac的植株中筛选出不同变异 利用这一途径已在苜蓿、马铃薯、番茄、甘蓝等多种植物上获得可利用的体细胞变异 植株 四、体细胞突变体的筛选 1.直接筛选法 直接筛选法是在设计的选择条件下,能使培养细胞或再生个体获得直接感官上的差 异,因此能将突变个体和非突变个体分离 最直接的做法是用一种含有特定物质的选择培养基,在此培养基上只有突变细胞能够 生长,而非突变细胞不能生长,从而直接筛选岀突变体。如抗除草剂、抗盐碱突变体的筛 选,均可直接在培养基中加入一定浓度的除草剂或增加渗透压的物质 目前采用这一途径,已从多种植物中筛选出可利用的体细胞变异体
华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 文本教案(第三章) 主讲教师：柳俊博士、教授 二、培养细胞的自发变异 离体培养的植物细胞会出现较高频率的自发变异， 离体培养中体细胞自发突变所产生的变异往往比较稳定，没有人工诱变的后续干扰， 有利于分离和选择。育种家们应用自发突变的这些优点，已选育出一些新品种，如美国 RNA 植物技术公司已从番茄体细胞无性系变异中选育出新品种，台湾的育种家也从甘蔗体 细胞无性系再生植株变异中选育出新品种。 三、培养细胞的诱变 1．物理诱变 物理诱变主要是通过射线、磁场以及温度等对培养物进行一定处理，然后对处理后的 培养物进行培养筛选。常用的射线处理包括 X 射线、γ 射线、快中子、紫外线等。 2．化学诱变 化学诱变是通过在培养基中添加一些化学物质，细胞对这些化学物质吸收后直接或间 接引起碱基突变。常用的化学诱变剂主要有： 烷化剂（硫酸二乙酯 DES，乙基磺酸乙酯 EES，甲基黄酸乙酯 EMS，环氧乙烷 EO，乙烯亚胺 EI 等），此类诱变剂有一个或多个活化烷基，可与 DNA 分子中的碱基或磷 酸基结合，改变 DNA 的结构而引起突变； 碱基类似物（5－溴尿嘧啶是胸腺嘧啶类似物，2－氨基嘌呤是腺嘌呤类似物等），在 细胞内核酸复制时，这些类似物可以掺入到新合成的 DNA 分子中引起错配； 移码诱变剂，如 ICR 化合物和吖啶类似物等； 其它如亚硝酸、羟胺等某些抗菌素亦可引起突变产生。 3．复合因子诱变 诱变处理可以是单因子处理，亦可以是复合因子诱变。一般来说，复合诱变的效果比 单因子诱变好。 4．转座子插入诱变 转座子既可直接将外源基因带入细胞内获得新性状，又可以独立插入通过其转座功能 诱导变异。 目前，使用较多的转座子体系主要是玉米的 Ac/Ds 系统，其主要操作过程是，首先采 用基因转化的方法将 Ac/Ds 导入受体细胞，再通过体细胞培养或再生植株的自交或测交使 Ac 因子切除，由于转座子插入的随机性，即可在切除 Ac 的植株中筛选出不同变异。 利用这一途径已在苜蓿、马铃薯、番茄、甘蓝等多种植物上获得可利用的体细胞变异 植株。 四、体细胞突变体的筛选 1．直接筛选法 直接筛选法是在设计的选择条件下，能使培养细胞或再生个体获得直接感官上的差 异，因此能将突变个体和非突变个体分离。 最直接的做法是用一种含有特定物质的选择培养基，在此培养基上只有突变细胞能够 生长，而非突变细胞不能生长，从而直接筛选出突变体。如抗除草剂、抗盐碱突变体的筛 选，均可直接在培养基中加入一定浓度的除草剂或增加渗透压的物质。 目前采用这一途径，已从多种植物中筛选出可利用的体细胞变异体
华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 文本教案(第三 主讲教师:柳俊博士、教授 2.间接筛选法 间接选择法是一种借助于与突变表现型有关的性状作为选择指标的筛选方法。当缺乏 直接选择表型指标或直接选择条件对细胞生长不利时,可考虑采用间接筛选法。如脯氨酸 (Pro)作为一种渗透调节物质,在维持细胞膜稳定性、细胞水分平衡等方面具有重要的生 物学意义。植物在非生物胁迫如干旱、低温等条件下,体内Pro常常有不同程度的升高,而 且耐干旱和耐寒植物的体内Pro往往较高。 抗病突变体的筛选也常常用间接筛选的策略。由于在离体培养中直接接种病原物会严 重障碍细胞生长,因此可以在培养基中加入一定剂量的病原物类毒素来增加选择压力。赤 霉病是小麦最严重的真菌性病害之一,同时由赤霉菌产生的赤霉菌毒素(DON)不仅影响 小麦正常生长,还可残留在籽粒中,严重时可造成人畜中毒。陆维忠等(2003)以小麦幼 穗为外植体诱导愈伤组织,然后将愈伤组织转入添加DON的培养基中,经过两次连续诱导 筛选,获得了抗DON的愈伤组织。再将抗DON的愈伤组织转入分化培养基再生植株,获 得的再生植株经过连续田间抗病性鉴定筛选,已培养出抗赤霉病小麦新品种“宁962390°。 五、体细胞变异的利用 1.创造育种中间材料或直接筛选新品种 据统计,诱导突变已被用来改良诸如小麦、水稻、大麦、棉花、花生和菜豆这些种子 繁殖的重要作物。在全世界50多个国家中,已培育出1000多个由直接突变获得的或由这些 突变体杂交而衍生的品种。这些品种的主要特性包括品质改良、增强抗病性和抗逆性等。 2.遗传研究 突变体作为基因克隆和标记筛选具有独特的优点。因为突变一旦发生,即可在表现型 上与供体显著不同,通过差异显示或分子杂交筛选,即可快速获得突变位点的DNA序列, 经过测序与功能鉴定,就可能获得与突变性状相关的基因。即使通过分析不能获得功能基 因,这些DNA序列也可作为与突变性状相关的分子标记,用于相关遗传研究。 突变体用于基因克隆和功能鉴定早已成为模式植物如拟南芥等的常规方法,近年来也 已开始广泛用于其它作物中。特别是与转座子标签插入突变技术相结合,更显现出这一途 径的高效性。目前,利用突变体策略已分离出一些功能基因和抗病基因,如玉米乙醇脱氢 酶基因ADH,赤霉素合成相关基因GAⅠ、GA4,生长素敏感性基因AUXⅠ、AUX2、番茄抗 病基因D等。 3.发育生物学研究 植物的个体发育是一个渐进过程,每一个器官和组织的分化都是一个复杂的调控过 程。利用体细胞突变策略对植物发育的基因调控硏究取得了突破性进展。特别是利用拟南 芥和金鱼草等模式植物,已分离出一大批不同发育阶段和组织类型的突变体,包括顶端分 生组织、根、开花转变、花序、花分生组织、胚胎发育等的一系列突变体。通过对这些突 变体的研究,不仅建立了器官发育模式,而且分离鉴定了一大批与发育有关的基因,包括 维持正常发育状态的基因、促进发育进程的基因,以及相关修饰基因(许智宏和刘春明, 1998)。 4.生化代谢途径研究 生物的各种代谢活动涉及到一系列酶相关基因的表达。如果某一代谢过程的关键酶基 因突变,则会影响到下游代谢链的正常进行。因此,突变体作为代谢活动调控研究的工 具,具有十分便利和高效的优势 体细胞突变技术的不断成熟,使多细胞生物大群体突变的建立成为可能。我们可以根 据需要建立某一代谢途径中每一个调节点的突变体,也可以根据需要与基因工程相结合 对一些关键调控过程进行修饰和改造,使代谢过程按照人类需要进行,因此而发展起来的 新型学科领域称之为代谢工程
华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 文本教案(第三章) 主讲教师：柳俊博士、教授 2．间接筛选法 间接选择法是一种借助于与突变表现型有关的性状作为选择指标的筛选方法。当缺乏 直接选择表型指标或直接选择条件对细胞生长不利时，可考虑采用间接筛选法。如脯氨酸 （Pro）作为一种渗透调节物质，在维持细胞膜稳定性、细胞水分平衡等方面具有重要的生 物学意义。植物在非生物胁迫如干旱、低温等条件下，体内 Pro 常常有不同程度的升高，而 且耐干旱和耐寒植物的体内 Pro 往往较高。 抗病突变体的筛选也常常用间接筛选的策略。由于在离体培养中直接接种病原物会严 重障碍细胞生长，因此可以在培养基中加入一定剂量的病原物类毒素来增加选择压力。赤 霉病是小麦最严重的真菌性病害之一，同时由赤霉菌产生的赤霉菌毒素（DON）不仅影响 小麦正常生长，还可残留在籽粒中，严重时可造成人畜中毒。陆维忠等（2003）以小麦幼 穗为外植体诱导愈伤组织，然后将愈伤组织转入添加 DON 的培养基中，经过两次连续诱导 筛选，获得了抗 DON 的愈伤组织。再将抗 DON 的愈伤组织转入分化培养基再生植株，获 得的再生植株经过连续田间抗病性鉴定筛选，已培养出抗赤霉病小麦新品种“宁 962390”。 五、体细胞变异的利用 1．创造育种中间材料或直接筛选新品种 据统计，诱导突变已被用来改良诸如小麦、水稻、大麦、棉花、花生和菜豆这些种子 繁殖的重要作物。在全世界 50 多个国家中，已培育出 1000 多个由直接突变获得的或由这些 突变体杂交而衍生的品种。这些品种的主要特性包括品质改良、增强抗病性和抗逆性等。 2．遗传研究 突变体作为基因克隆和标记筛选具有独特的优点。因为突变一旦发生，即可在表现型 上与供体显著不同，通过差异显示或分子杂交筛选，即可快速获得突变位点的 DNA 序列， 经过测序与功能鉴定，就可能获得与突变性状相关的基因。即使通过分析不能获得功能基 因，这些 DNA 序列也可作为与突变性状相关的分子标记，用于相关遗传研究。 突变体用于基因克隆和功能鉴定早已成为模式植物如拟南芥等的常规方法，近年来也 已开始广泛用于其它作物中。特别是与转座子标签插入突变技术相结合，更显现出这一途 径的高效性。目前，利用突变体策略已分离出一些功能基因和抗病基因，如玉米乙醇脱氢 酶基因 ADH，赤霉素合成相关基因 GA1、GA4，生长素敏感性基因 AUX1、AUX2、番茄抗 病基因 Df9 等。 3．发育生物学研究 植物的个体发育是一个渐进过程，每一个器官和组织的分化都是一个复杂的调控过 程。利用体细胞突变策略对植物发育的基因调控研究取得了突破性进展。特别是利用拟南 芥和金鱼草等模式植物，已分离出一大批不同发育阶段和组织类型的突变体，包括顶端分 生组织、根、开花转变、花序、花分生组织、胚胎发育等的一系列突变体。通过对这些突 变体的研究，不仅建立了器官发育模式，而且分离鉴定了一大批与发育有关的基因，包括 维持正常发育状态的基因、促进发育进程的基因，以及相关修饰基因（许智宏和刘春明， 1998）。 4．生化代谢途径研究 生物的各种代谢活动涉及到一系列酶相关基因的表达。如果某一代谢过程的关键酶基 因突变，则会影响到下游代谢链的正常进行。因此，突变体作为代谢活动调控研究的工 具，具有十分便利和高效的优势。 体细胞突变技术的不断成熟，使多细胞生物大群体突变的建立成为可能。我们可以根 据需要建立某一代谢途径中每一个调节点的突变体，也可以根据需要与基因工程相结合， 对一些关键调控过程进行修饰和改造，使代谢过程按照人类需要进行，因此而发展起来的 新型学科领域称之为代谢工程
华中农业大学创建国家精品课程 胞工程学 文本教案(第三 主讲教师:柳俊博士、教授 植物突变体用于代谢硏究,早期最经典的例子是通过烟草突变体对硝酸还原酶的研 究。硝酸还原酶缺失突变体有两种类型:cnx和nia。两种突变体具有同一表现型,即在以 硝态氮为唯一氮源的培养基上不能生存。但将这两种突变体的原生质体融合后,融合细胞 即可在只有硝态氮源的培养基上生长。由此说明,两种突变体存在独立的基因位点,而不 同位点的基因又可能通过不同的途径控制硝酸还原酶的活性。研究显示。cnx和nia突变体 分别通过影响钼因子和酶蛋白来影响硝酸还原酶的活性。近年来,通过体细胞突变研究激 素、次生代谢产物等代谢途径的研究已有许多报道。 离体培养中遗传的稳定性是相对的,而体细胞变异发生是普遍的,但变异的程度可以 通过培养类型和条件进行控制,从而使我们能够更好地应用离体培养技术。选用适当的外 植体和培养方式,减少体细胞变异发生,使培养群体维持遗传稳定,可以充分利用离体培 养的快速繁殖优势繁殖健康种苗。将离体培养技术与诱变技术相结合,可以提髙变异频 率,增加变异选择的基础材料,丰富遗传资源。特别是随着诱变途径的不断完善和分子生 物学技术的应用,必将使体细胞变异的研究和应用潜力得以更充分的发挥 思考题 1.体培养物的遗传变异有何特点? 2.哪些因素会影响培养物的遗传变异? 3.从细胞学和分子生物学机制上理解体细胞无性系变异的机制。 4.体细胞无性系变异的诱导和选择方法 5.体细胞无性系变异的应用途径
华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 文本教案(第三章) 主讲教师：柳俊博士、教授 植物突变体用于代谢研究，早期最经典的例子是通过烟草突变体对硝酸还原酶的研 究。硝酸还原酶缺失突变体有两种类型：cnx 和 nia。两种突变体具有同一表现型，即在以 硝态氮为唯一氮源的培养基上不能生存。但将这两种突变体的原生质体融合后，融合细胞 即可在只有硝态氮源的培养基上生长。由此说明，两种突变体存在独立的基因位点，而不 同位点的基因又可能通过不同的途径控制硝酸还原酶的活性。研究显示。cnx 和 nia 突变体 分别通过影响钼因子和酶蛋白来影响硝酸还原酶的活性。近年来，通过体细胞突变研究激 素、次生代谢产物等代谢途径的研究已有许多报道。 离体培养中遗传的稳定性是相对的，而体细胞变异发生是普遍的，但变异的程度可以 通过培养类型和条件进行控制，从而使我们能够更好地应用离体培养技术。选用适当的外 植体和培养方式，减少体细胞变异发生，使培养群体维持遗传稳定，可以充分利用离体培 养的快速繁殖优势繁殖健康种苗。将离体培养技术与诱变技术相结合，可以提高变异频 率，增加变异选择的基础材料，丰富遗传资源。特别是随着诱变途径的不断完善和分子生 物学技术的应用，必将使体细胞变异的研究和应用潜力得以更充分的发挥。 思考题 1．体培养物的遗传变异有何特点？ 2．哪些因素会影响培养物的遗传变异？ 3．从细胞学和分子生物学机制上理解体细胞无性系变异的机制。 4．体细胞无性系变异的诱导和选择方法。 5．体细胞无性系变异的应用途径