华中农业大学创建国家精品课程—细胞工程学文本教案(第四章) 主讲教师:柳俊博士、教授 第四章植物主要组织培养技术(5学时) 教学目的与要求 掌握植物组织培养的主要技术,特别是茎尖脱毒原理,花药培养获得单倍体以及幼胚培 养技术的应用。 第一节、植物脱毒及快速繁殖技术 概念与意义 意义:能够有效地保持优良品种的特性; 生产无病毒种苗,防止品种退化 快速繁殖新品种,使优良品种迅速应用: 节约耕地,提高农产品的商品率; 便于运输。 目前受病毒危害严重影响生产的有: 大田作物:马铃薯、甘薯、甘蔗、烟草 蔬菜:白菜、大蒜、葱、番茄、萝卜。 果树:柑橘、苹果、草莓、香蕉。 ●花卉:香石竹、各种菊花、天竹葵、紫罗兰等 块根、块茎、鳞茎为繁殖器官的作物,每年相当一部分产品要用留作种。如 大蒜:留种量占产量的五到八分之 马铃薯:留种量占产量的十分之 贝母:留种量占产量的三分之 、植物的脱毒技术 1.基本原理 病毒在植物体内的分布具有不均匀性 理论假说: (1)、能量竞争病毒核酸和植物细胞分裂时DNA合成均需要消耗大量的能量,而分生 组织细胞本身很活跃,其DNA合成是自我提供能量自我复制,而病毒核酸的合成要靠植物 提供能量来自我复制,因而就得不到足够的能量,从而就抑制了病毒核酸的复制。 (2)、传导抑制病毒在植物体内的传播主要是通过维管束实现的,但在分生组织中, 维管组织还不健全,从而抑制了病毒向分生组织的传导 (3)、激素抑制在分生组织中,生长素和细胞分裂素水平均很高,因而阻滞了病毒的 侵入或者抑制病毒的合成 (4)、酶缺乏1969年, Stace- Smith提出,可能病毒的合成需要的酶系统在分生组织中 缺乏或还没建立,因而病毒无法在分生组织中复制。 (5)、抑制因子1976年, Martin- Tanguy等提出了抑制因子假说,认为在分生组织中存
华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 文本教案(第四章) 主讲教师：柳俊博士、教授 第四章 植物主要组织培养技术（5 学时） 教学目的与要求： 掌握植物组织培养的主要技术，特别是茎尖脱毒原理，花药培养获得单倍体以及幼胚培 养技术的应用。 第一节、植物脱毒及快速繁殖技术 一、 概念与意义 意义：能够有效地保持优良品种的特性； 生产无病毒种苗，防止品种退化； 快速繁殖新品种，使优良品种迅速应用； 节约耕地，提高农产品的商品率； 便于运输。 目前受病毒危害严重影响生产的有： 大田作物：马铃薯、甘薯、甘蔗、烟草。 蔬 菜：白菜、大蒜、葱、番茄、萝卜。 果 树：柑橘、苹果、草莓、香蕉。 花 卉：香石竹、各种菊花、天竹葵、紫罗兰等 块根、块茎、鳞茎为繁殖器官的作物，每年相当一部分产品要用留作种。如： 大 蒜：留种量占产量的五到八分之一。 马铃薯：留种量占产量的十分之一。 贝 母：留种量占产量的三分之一。 二、植物的脱毒技术 1．基本原理 病毒在植物体内的分布具有不均匀性 理论假说： (1)、能量竞争 病毒核酸和植物细胞分裂时 DNA 合成均需要消耗大量的能量，而分生 组织细胞本身很活跃，其 DNA 合成是自我提供能量自我复制，而病毒核酸的合成要靠植物 提供能量来自我复制，因而就得不到足够的能量，从而就抑制了病毒核酸的复制。 (2)、传导抑制 病毒在植物体内的传播主要是通过维管束实现的，但在分生组织中， 维管组织还不健全，从而抑制了病毒向分生组织的传导。 (3)、激素抑制 在分生组织中，生长素和细胞分裂素水平均很高，因而阻滞了病毒的 侵入或者抑制病毒的合成。 (4)、酶缺乏 1969 年，Stace-Smith 提出，可能病毒的合成需要的酶系统在分生组织中 缺乏或还没建立，因而病毒无法在分生组织中复制。 (5)、抑制因子 1976 年，Martin-Tanguy等提出了抑制因子假说，认为在分生组织中存
华中农业大学创建国家精品课程—细胞工程学文本教案(第四章) 主讲教师:柳俊博士、教授 在有某种抑制因子。 茎尖脱毒是控制植物病毒的有效途径 (1)、药物防治病毒病效率低, (2)、抗病毒育种步履艰难 (3)、组织培养的高效隔离防治了病毒的再侵染 2.植物脱毒的技术规程 母体植株的选择和预处理 母体的选择:欲脱毒材料的品种典型性;外植体健康程度选择。 预处理 B C 热处理区 度 生长区 无损伤 脱毒区 热致死区 香石竹在38~40°C条件下经两个月处理可除去全部病毒 菊花在35~38°C的条件下处理60天可使病毒失活。 马铃薯在3τ°C条件下处理10~20天能除去卷叶病毒。 ●柑橘一速衰病毒、黄化病毒需在40°C/30°C条件下处理7~12周。 鳞皮病毒需要在40°C/30°C条件下处理8周 啐叶病毒需要在50°C条件下处理3~22小时。 亚洲青果病毒在50°C条件下处理30~40分钟。 实茎尖分生组织培养再生植株 茎尖分生组织培养有两个概念: shoot tip- shoot apex apical meristem-apical dome
华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 文本教案(第四章) 主讲教师：柳俊博士、教授 在有某种抑制因子。 茎尖脱毒是控制植物病毒的有效途径 (1)、药物防治病毒病效率低， (2)、抗病毒育种步履艰难 (3)、组织培养的高效隔离防治了病毒的再侵染 2．植物脱毒的技术规程 * 母体植株的选择和预处理 母体的选择：欲脱毒材料的品种典型性；外植体健康程度选择。 预处理： A B C 无损伤 脱毒区 热致死区 香石竹在 38～40°C 条件下经两个月处理可除去全部病毒。 菊花在 35～38°C 的条件下处理 60 天可使病毒失活。 马铃薯在 37°C 条件下处理 10～20 天能除去卷叶病毒。 柑橘－速衰病毒、黄化病毒需在 40°C/30°C 条件下处理 7～12 周。 鳞皮病毒需要在 40°C/30°C 条件下处理 8 周。 啐叶病毒需要在 50°C 条件下处理 3～22 小时。 亚洲青果病毒在 50°C 条件下处理 30～40 分钟。 * 茎尖分生组织培养再生植株 茎尖分生组织培养有两个概念：shoot tip－shoot apex； apical meristem－apical dome. 生长区 生 热处理区 长 温 度 高 温
华中农业大学创建国家精品课程—细胞工程学文本教案(第四章) 主讲教师:柳俊博士、教授 ☆脱毒效果检测 指示植物鉴定( test plants)所谓指示植物是指具有能够辨别某种病毒的专化性症状的 寄主植物。 血清鉴定( serologic test)试管沉淀反应;免疫双扩散;酶联免疫吸附测定( ELISA) *脱毒苗的保存与繁殖 脱毒苗的离体保存与繁殖 建立脱毒种苗生产繁殖网络体系 木本植物建立隔离的脱毒苗母本园 3.影响脱毒效果的因素 母体材料病毒侵染的程度 *起始培养的茎尖大小 离体茎尖大小的马铃薯脱毒效果的影响 茎尖长(mm)叶原基数小植株数脱毒植株数脱毒率(%) 50 24 48 0.27 42 18 42.9 *外植体的生理状态 、离体无性繁殖( propagation in vitro) 离体繁殖的一般技术 无菌培养物的建立 培养物的增殖:腋芽増殖:不定芽増殖;胚状体増殖;愈伤组织増殖 生根培养 生产用苗的培植 离体繁殖的使用范围 用于加速某些难繁殖或繁殖速度很低的植物,或某些需要需要加速繁殖的特殊基因 型,如名贵花卉、优良资源、果树芽变分离、工程植株等等 ●用于自然繁殖极易感染病毒的植物,如马铃薯、甘薯、甘蔗、香蕉、石竹、百合等 用于有性繁殖变异范围过大而自然条件下又不易无性繁殖的植物,如非洲菊、花 竹、紫罗兰等
华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 文本教案(第四章) 主讲教师：柳俊博士、教授 * 脱毒效果检测 指示植物鉴定(test plants) 所谓指示植物是指具有能够辨别某种病毒的专化性症状的 寄主植物。 血清鉴定(serologic test) 试管沉淀反应；免疫双扩散；酶联免疫吸附测定(ELISA)。 * 脱毒苗的保存与繁殖 脱毒苗的离体保存与繁殖 建立脱毒种苗生产繁殖网络体系 木本植物建立隔离的脱毒苗母本园 3．影响脱毒效果的因素 * 母体材料病毒侵染的程度 * 起始培养的茎尖大小 离体茎尖大小的马铃薯脱毒效果的影响 茎尖长(mm) 叶原基数 小植株数 脱毒植株数 脱毒率（％） 0.12 1 50 24 48 0.27 2 42 18 42.9 0.6 4 64 0 0 * 外植体的生理状态 三、离体无性繁殖(propagation in vitro) 1．离体繁殖的一般技术 无菌培养物的建立 培养物的增殖: 腋芽增殖；不定芽增殖；胚状体增殖; 愈伤组织增殖 生根培养 生产用苗的培植 2．离体繁殖的使用范围 用于加速某些难繁殖或繁殖速度很低的植物，或某些需要需要加速繁殖的特殊基因 型，如名贵花卉、优良资源、果树芽变分离、工程植株等等。 用于自然繁殖极易感染病毒的植物，如马铃薯、甘薯、甘蔗、香蕉、石竹、百合等 等。 用于有性繁殖变异范围过大而自然条件下又不易无性繁殖的植物，如非洲菊、花 竹、紫罗兰等
华中农业大学创建国家精品课程—细胞工程学文本教案(第四章) 主讲教师:柳俊博士、教授 3.离体繁殖的有关问题: 外源生长调节剂对品种典型性的影响 继代次数与变异 增殖方式的合理选择 第二节、花药及花粉培养 概念及意义 1.概念 花药培养其外植体是植物雄性生殖器官的一部分,就培养方法和技术来讲,属于器官 培养的范畴 花粉培养的精确定义是:将处于一定发育阶段的花粉从花药中分离出来,再加以离体培 养。有时花粉培养也称为小孢子培养( microspore culture)。从培养方法和技术方面来讲,它 属于细胞培养的范畴 2.单倍体植物的特点 所谓单倍体 haploid)是指具有配子体染色体数的孢子体(植物个体) diploid植物其 haploid即为 monoploid 玉米2n=2x=20n=x=10 水稻2n=2x=24n=x=12 柑橘2n=2x=18n=x=9 tetraploid植物其 haploid为 dihaploid 马铃薯2n=4x=48n=2x=24 陆地棉2n=4x=52n=2x=26 hexaploid植物其 haploid为 triploid 普通小麦2n=6x=42n=3x=21 octoploid植物其 haploid为 tetraploid 草莓2n=8x=56n=4x=28 单倍体植物与它们的二倍体相比较,有三个明显的特点: 体细胞染色体数减半 生长发育弱,体形小、各器官明显减小 雌雄配子严重败育,有的甚至不能进入有性世代 3.单倍体的应用潜力 ●迅速获得纯合型材料,缩短育种年限
华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 文本教案(第四章) 主讲教师：柳俊博士、教授 3．离体繁殖的有关问题： 外源生长调节剂对品种典型性的影响 继代次数与变异 增殖方式的合理选择 第二节、花药及花粉培养 一、 概念及意义 1．概念 花药培养其外植体是植物雄性生殖器官的一部分，就培养方法和技术来讲，属于器官 培养的范畴。 花粉培养的精确定义是：将处于一定发育阶段的花粉从花药中分离出来，再加以离体培 养。有时花粉培养也称为小孢子培养(microspore culture)。从培养方法和技术方面来讲，它 属于细胞培养的范畴。 2．单倍体植物的特点 所谓单倍体(haploid)是指具有配子体染色体数的孢子体(植物个体)。 diploid 植物其 haploid 即为 monoploid 玉米 2n = 2x = 20 n = x = 10 水稻 2n = 2x = 24 n = x = 12 柑橘 2n = 2x = 18 n = x = 9 tetraploid 植物其 haploid 为 dihaploid 马铃薯 2n = 4x = 48 n = 2x = 24 陆地棉 2n = 4x = 52 n = 2x = 26 hexaploid 植物其 haploid 为 triploid 普通小麦 2n = 6x = 42 n = 3x = 21 octoploid 植物其 haploid 为 tetraploid 草莓 2n = 8x = 56 n = 4x = 28 单倍体植物与它们的二倍体相比较，有三个明显的特点： 体细胞染色体数减半； 生长发育弱，体形小、各器官明显减小； 雌雄配子严重败育，有的甚至不能进入有性世代。 3．单倍体的应用潜力 迅速获得纯合型材料，缩短育种年限
华中农业大学创建国家精品课程—细胞工程学文本教案(第四章) 主讲教师:柳俊博士、教授 获得育种中间材料 与诱变育种相结合可以提高诱变频率 ●与细胞融合相结合,使这一育种途径更具有实际应用意义 作为遗传工程受体更为有效 用作基础遗传研究的各个领域 Utilization of haploid cell line Haploid cell line Mutation Cel induction and Genetic hybridization selection of cells engineering Regeneration f plants Utilization of new forms in breeding and crop improvement 、花药培养 首先报道通过花药培养获得单倍体植株成功的是印度学者Guha和 Maheshwari(1964, 1966}。目前己有250多种植物花药培养成功 目前,花药培养获得单倍体的技术途径已在禾本科作物、茄科作物、十字花科作物的 育种中广泛应用。 花药培养的基本程序是 外植体选择一外植体(花蕾)预处理一外植体消毒一剥取花药一接种一诱导培养-分化培 养
华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 文本教案(第四章) 主讲教师：柳俊博士、教授 获得育种中间材料 与诱变育种相结合可以提高诱变频率 与细胞融合相结合，使这一育种途径更具有实际应用意义 作为遗传工程受体更为有效 用作基础遗传研究的各个领域 Utilization of haploid cell line 二、花药培养 首先报道通过花药培养获得单倍体植株成功的是印度学者 Guha 和 Maheshwari (1964, 1966)。目前已有 250 多种植物花药培养成功。 目前，花药培养获得单倍体的技术途径已在禾本科作物、茄科作物、十字花科作物的 育种中广泛应用。 花药培养的基本程序是： 外植体选择－外植体(花蕾)预处理—外植体消毒—剥取花药—接种—诱导培养—分化培 养 Haploid cell line Mutation induction and selection of cells Cell habridization Genetic engineering Regeneration of plants Utilization of new forms in breeding and crop improvement
华中农业大学创建国家精品课程—细胞工程学文本教案(第四章) 主讲教师:柳俊博士、教授 1.外植体的选择:供试材料的遗传背景 供试材料的生理状态 花粉的发育时期 四分体一小孢子一单核花粉一双核花粉 最适期 Sunderland(1971)对烟草不同花粉发育时期的培养反应进行了观察: 花粉发育时期 胚状体诱导频率(%) 减数分裂期 0 单核早期 单核晚期 40 双核早期 55 2、花药预处理 大量试验结果表明,花药培养前给予一定的低温处理是十分必要的 烟草、茄子3~5°C72小时 水稻 10°C10~14天 柑橘 3°C5~10天 马铃薯 4°C48小时 低温处理的作用: 可以激发花粉母细胞产生两个相等核,二不是一个营养核一个生殖核; 保持高比例的强生活力花粉,同时延缓体细胞组织的衰老; 激发花粉产生原胚; ●促使细胞同步分裂 3.培养基及培养条件 培养基 花药培养常用的基本培养基:MS( Murashige& Skoog,1962); Nitsch( Nitsch 1969);N(朱至清,1974); Bs( Gamborg et al.,1976 ●附加成分:蔗糖:激素。 番茄花药培养对蔗糖浓度的诱导反 蔗糖浓度|2 6% 10% 17 诱导频率|5% 10%12%18%25% 45% 8% 花药培养常用的激素有: 细胞分裂素类:BA-6- benzyladenine KT- kinetin
华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 文本教案(第四章) 主讲教师：柳俊博士、教授 1．外植体的选择：供试材料的遗传背景 供试材料的生理状态 花粉的发育时期 四分体 — 小孢子 — 单核花粉 — 双核花粉 最适期 Sunderland (1971)对烟草不同花粉发育时期的培养反应进行了观察： 花粉发育时期 胚状体诱导频率(％) 减数分裂期 0 单核早期 14 单核晚期 40 双核早期 55 2、花药预处理 大量试验结果表明，花药培养前给予一定的低温处理是十分必要的。 烟草、茄子 3～5°C 72 小时 水稻 10°C 10～14 天 柑橘 3°C 5～10 天 马铃薯 4°C 48 小时 低温处理的作用： 可以激发花粉母细胞产生两个相等核，二不是一个营养核一个生殖核； 保持高比例的强生活力花粉，同时延缓体细胞组织的衰老； 激发花粉产生原胚； 促使细胞同步分裂。 3．培养基及培养条件 培养基 花药培养常用的基本培养基：MS（Murashigc & Skoog，1962）； Nitsch(Nitsch， 1969)；N6(朱至清，1974)；B5(Gamborg et al.，1976)。 附加成分：蔗糖；激素。 番茄花药培养对蔗糖浓度的诱导反应 蔗糖浓度 2％ 3％ 4％ 6％ 10％ 13％ 17％ 诱导频率 5％ 10％ 12％ 18％ 25％ 45％ 8％ 花药培养常用的激素有： 细胞分裂素类： BA— 6-benzyladenine KT— kinetin
华中农业大学创建国家精品课程—细胞工程学文本教案(第四章) 主讲教师:柳俊博士、教授 Zeatin 生长素类:NAA- naphthalene acetic acid IAA-indole-3-acetic acid 2, 4-D--2, 4-dichlorophenoxyacetic acid 2, 4 高秀云等对茄子的研究表明 MS+2, 4-D0.5mgltKT Ingl n 93. 8% 2n 6.2% MS+2.4-D 2mgl-+ KT Ingl- n 64. 1% 2n 35.9% 高浓度的2,4-D主要诱导花药形成愈伤组织,而不能形成胚状体,从而增加了二倍体 细胞发育的机会。 培养条件一温度和光照 温度:不同植物对温度的要求不同,如 柑橘在20°C以下,完全不能形成胚状体,且愈伤组织形成亦很少,当将温度提高到 25°C时便会有胚状体形成,而当温度提高到26以上时又完全不能形成胚状体 油菜若将接种后的花药在30条件下培养2~3天,可显著提高花粉胚的形成率,小麦 在33°C条件下培养3~5天,可提高成愈率和绿苗率。 光照:先弱后强 4.花药培养中单倍体形成的途径 花药的结构:花药壁(2n)、药隔(2n)、花粉粒(n) 培养初期花粉发育的途径 根据 Sunderland,、 Wicks和 Norrell的研究,可以把早期的花粉发育分为三类: 1)、单核一正常分裂成一个生殖核、一个营养核。以后或一个生殖核发育,或一个营 养核发育,或二者均等发育。 (2)、单核一均等分裂为两个子细胞,以后不断发育 (3)、异常多核花粉粒发育 Nitsch(1970)在南洋金花中观察到4核花粉发育成胚状体; emec在风信子中发现,有些小孢子核连续分裂3次,形成类似8核胚囊的现象,称为花粉 胚囊。 单倍体植株形成途径 ●通过胚状体形成单倍体植株 NAA浓度对品种“二猪咀”花药诱导胚状体的影响 NAA(mgl) 0.25 11.0 2.0 embryoid(%) allus 6.7 9.2 12.9
华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 文本教案(第四章) 主讲教师：柳俊博士、教授 Zeatin 生长素类： NAA— naphthalene acetic acid I A A— indole-3-acetic acid 2,4-D— 2,4-dichlorophenoxyacetic acid 2,4 高秀云等对茄子的研究表明： MS＋2,4-D0.5mgl-1＋KT 1mgl-1 n 93.8% 2n 6.2% MS＋2,4-D 2mgl-1 ＋ KT 1mgl-1 n 64,1% 2n 35.9% 高浓度的 2,4-D 主要诱导花药形成愈伤组织，而不能形成胚状体，从而增加了二倍体 细胞发育的机会。 培养条件－温度和光照 温度：不同植物对温度的要求不同，如： 柑橘在 20°C 以下，完全不能形成胚状体，且愈伤组织形成亦很少，当将温度提高到 21 ～25°C 时便会有胚状体形成，而当温度提高到 26 以上时又完全不能形成胚状体。 油菜若将接种后的花药在 30 条件下培养 2～3 天，可显著提高花粉胚的形成率，小麦 在 33°C 条件下培养 3～5 天，可提高成愈率和绿苗率。 光照：先弱后强 4．花药培养中单倍体形成的途径 花药的结构：花药壁(2n)、药隔(2n)、花粉粒(n) 培养初期花粉发育的途径 根据 Sunderland,、Wicks 和 Norreel 的研究，可以把早期的花粉发育分为三类： (1)、单核—正常分裂成一个生殖核、一个营养核。以后或一个生殖核发育，或一个营 养核发育，或二者均等发育。 (2)、单核—均等分裂为两个子细胞，以后不断发育。 (3)、异常多核花粉粒发育 Nitsch(1970)在南洋金花中观察到 4 核花粉发育成胚状体； Nemec 在风信子中发现，有些小孢子核连续分裂 3 次，形成类似 8 核胚囊的现象，称为花粉 胚囊。 单倍体植株形成途径 通过胚状体形成单倍体植株 NAA 浓度对品种“二猪咀”花药诱导胚状体的影响 NAA(mgl -1) 0.25 1.0 2.0 embryoid(%) 6.45 1.9 1.11 callus 6.7 9.2 12.9
华中农业大学创建国家精品课程—细胞工程学文本教案(第四章) 主讲教师:柳俊博士、教授 ●通过愈伤组织形成植株 植株来源 倍性 细胞类型 embryoid 单个花粉粒 callus n/2n/2n+ 单个或多个花粉粒、花粉 细胞与花药壁细胞等 、花粉及小孢子培养 1.取材时期的确定 四分体—单核早期一单核晚期一双核早期一双核晚期一三核期 小孢子 花粉粒 花粉培养 花药培养 2.花粉或小孢子的分离 3.培养方法花药看护培养 花粉悬浮培养 双层培养 四、单倍体植株的鉴定与二倍化 1.鉴定方法:形态学鉴定 染色体分析 单倍体植株的二倍化:继代加倍 创伤法加倍 秋水仙素处理加倍
华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 文本教案(第四章) 主讲教师：柳俊博士、教授 通过愈伤组织形成植株 植株来源 倍性 细胞类型 embryoid n 单个花粉粒 callus n / 2n / 2n+ 单个或多个花粉粒、花粉 细胞与花药壁细胞等 三、花粉及小孢子培养 1．取材时期的确定 四分体—单核早期—单核晚期—双核早期—双核晚期—三核期 ------------------- --------------------------------------- 小 孢 子 花 粉 粒 ---------------- ------------------ 花粉培养 花药培养 2．花粉或小孢子的分离 3．培养方法 花药看护培养 花粉悬浮培养 双层培养 四、单倍体植株的鉴定与二倍化 1．鉴定方法：形态学鉴定 染色体分析 2．单倍体植株的二倍化：继代加倍 创伤法加倍 秋水仙素处理加倍
华中农业大学创建国家精品课程—细胞工程学文本教案(第四章) 主讲教师:柳俊博士、教授 第三节、植物胚胎培养 植物胚胎培养包括胚培养、胚珠培养、子房培养、胚乳培养 植物胚培养( embryo culture of plants) 1.胚培养的意义和类型 胚培养在实践中的应用意义 克服杂交育种中杂种胚的早期天折 克服珠心胚干扰,提高育种效率 理论研究领域的应用 胚培养的类型 成熟胚( mature embryo)培养;幼胚( (immature embryo培养 2.幼胚培养 前发ig早在1904年就培养了萝卜和辣根菜的胚,发现离体胚可以充分发育,并且提 形成小苗,这是世界上胚培养最早获得成功的一例 Laibach在1925~1929年间,通过培养亚麻种间杂种幼胚,成功地获得了种间杂种, 首次证实了这种方法在实际应用中的价值 李继侗,1933年在银杏培养中发现了胚乳提取物能够促进银杏离体胚的生长。这一发 现为后人使用植物胚乳汁液、幼嫩种子及果实提取液等天然物质促进培养物生长具有启示作 用 幼胚培养的关键技术:取材时期 幼胚剥离 培养条件的控制(是否需要特殊处理) 幼胚离体培养的生长发育方式 幼胚培养中,常见的生长方式有三种 (1)、胚性发育( embryonal development幼胚接种到培养基上以后,仍然按照在活体内 的发育方式发育,最后形成成熟胚(有时甚至可能类似种子),然后再按种子萌发途径出苗形 成完整植株,这种途径发育的幼胚一般一个幼胚将来就是一个植株 2)、早熟萌发( early mature sprouting)幼胚接种后,离体胚不继续胚性生长,而是在 培养基上迅速萌发成幼苗,通常称之为早熟萌发。在大多数情况下,一个幼胚萌发成一个植 株,但有时会由于细胞分裂产生大量的胚性细胞,以后形成许多胚状体,从而可以形成许多 植株,这种现象就是所谓的丛生胚现象。 (3)、愈伤组织( callus)在许多情况下,幼胚在离体培养中首先发生细胞增殖,形成愈伤
华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 文本教案(第四章) 主讲教师：柳俊博士、教授 第三节、植物胚胎培养 植物胚胎培养包括胚培养、胚珠培养、子房培养、胚乳培养。 一、植物胚培养(embryo culture of plants) 1．胚培养的意义和类型 胚培养在实践中的应用意义 克服杂交育种中杂种胚的早期夭折 克服珠心胚干扰，提高育种效率 理论研究领域的应用 胚培养的类型 成熟胚(mature embryo)培养；幼胚(immature embryo)培养 2．幼胚培养 Hanning 早在 1904 年就培养了萝卜和辣根菜的胚，发现离体胚可以充分发育，并且提 前萌发形成小苗，这是世界上胚培养最早获得成功的一例。 Laibach 在 1925～1929 年间，通过培养亚麻种间杂种幼胚，成功地获得了种间杂种， 首次证实了这种方法在实际应用中的价值。 李继侗，1933 年在银杏培养中发现了胚乳提取物能够促进银杏离体胚的生长。这一发 现为后人使用植物胚乳汁液、幼嫩种子及果实提取液等天然物质促进培养物生长具有启示作 用。 幼胚培养的关键技术：取材时期 幼胚剥离 培养条件的控制（是否需要特殊处理） 幼胚离体培养的生长发育方式 幼胚培养中，常见的生长方式有三种： (1)、胚性发育(embryonal development) 幼胚接种到培养基上以后，仍然按照在活体内 的发育方式发育，最后形成成熟胚(有时甚至可能类似种子)，然后再按种子萌发途径出苗形 成完整植株，这种途径发育的幼胚一般一个幼胚将来就是一个植株。 (2)、早熟萌发(early mature sprouting) 幼胚接种后，离体胚不继续胚性生长，而是在 培养基上迅速萌发成幼苗，通常称之为早熟萌发。在大多数情况下，一个幼胚萌发成一个植 株，但有时会由于细胞分裂产生大量的胚性细胞，以后形成许多胚状体，从而可以形成许多 植株，这种现象就是所谓的丛生胚现象。 (3)、愈伤组织(callus) 在许多情况下，幼胚在离体培养中首先发生细胞增殖，形成愈伤
华中农业大学创建国家精品课程—细胞工程学文本教案(第四章) 主讲教师:柳俊博士、教授 组织。一般来讲由胚形成的愈伤组织大多为胚性愈伤组织,这种胚性愈伤组织很容易分化形 成植株。 子房培养 子房培养包括授粉前和授粉后的子房培养 1942年, La rue首先对番茄、落地生根属( Kalanchoe)、连翅属( Forsythia)和驴蹄草属 ( Canthal授粉的花连带一段花梗进行了培养,在无机盐培养基上得到了正常的果实。 1949年和1951年 Nitsch建立了较完整的子房培养技术,他培养了小黄瓜、番茄、菜 豆、草莓和烟草等植物授粉前和授粉后的子房,在含蔗糖的无机盐培养基上,授粉后的小黄 瓜和番茄获得了成熟果实及具有生活力的种子。 1969年 Nitsch等在水稻上进行了未授粉子房培养的尝试,并得到了植株,但这些植株 是属于二倍体和四倍体的 1971年 Uchimiya等从未授粉玉米子房培养中获得了愈伤组织和分化的不定根,但也不 是单倍体的。 1976年 San neum在未授粉的大麦子房培养中首次获得了单倍体植株。以后,相继在 大麦、烟草、小麦、向日葵、水稻、玉米、百合、青稞、荞麦、白魔芋、杨树等数十种植物 上获得了单倍体植株(孔凡伦等,1990)。 1.材料的选择 品种间的差异 胚囊发育时期 大麦胚囊发育时期与花粉发育时期的相关性 花粉发育时期 胚囊发育时期 单核中期 大孢子四分体 单核靠边期 单核至四核胚囊 核花粉期 八核胚囊 三核花粉期 成熟胚囊 2.培养基 植物激素的影响 百合未授粉子房培养24-D单独使用诱导频率为1887% 2,4-D+6BA诱导频率为33.73% 24-D+KT诱导频率为47.76% 荞麦未授粉子房培养2,4-D单独使用诱导频率为76% 24-D+KT诱导频率为18%
华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 文本教案(第四章) 主讲教师：柳俊博士、教授 组织。一般来讲由胚形成的愈伤组织大多为胚性愈伤组织，这种胚性愈伤组织很容易分化形 成植株。 二、子房培养 子房培养包括授粉前和授粉后的子房培养。 1942 年，La Rue 首先对番茄、落地生根属(Kalanchoe)、连翅属(Forsythia)和驴蹄草属 (Caltha)授粉的花连带一段花梗进行了培养，在无机盐培养基上得到了正常的果实。 1949 年和 1951 年 Nitsch 建立了较完整的子房培养技术，他培养了小黄瓜、番茄、菜 豆、草莓和烟草等植物授粉前和授粉后的子房，在含蔗糖的无机盐培养基上，授粉后的小黄 瓜和番茄获得了成熟果实及具有生活力的种子。 1969 年 Nitsch 等在水稻上进行了未授粉子房培养的尝试，并得到了植株，但这些植株 是属于二倍体和四倍体的。 1971 年 Uchimiya 等从未授粉玉米子房培养中获得了愈伤组织和分化的不定根，但也不 是单倍体的。 1976 年 San Noeum 在未授粉的大麦子房培养中首次获得了单倍体植株。以后，相继在 大麦、烟草、小麦、向日葵、水稻、玉米、百合、青稞、荞麦、白魔芋、杨树等数十种植物 上获得了单倍体植株(孔凡伦等，1990)。 1．材料的选择 品种间的差异 胚囊发育时期 大麦胚囊发育时期与花粉发育时期的相关性 花粉发育时期 胚囊发育时期 单核中期 大孢子四分体 单核靠边期 单核至四核胚囊 二核花粉期 八核胚囊 三核花粉期 成熟胚囊 2．培养基 植物激素的影响 百合未授粉子房培养 2,4 - D 单独使用诱导频率为 18.87% 2,4 - D＋6-BA 诱导频率为 33.73% 2,4 - D＋KT 诱导频率为 47.76% 荞麦未授粉子房培养 2,4 - D 单独使用诱导频率为 7.6% 2,4 - D＋KT 诱导频率为 1.8%