华中农业大学创建国家精品课程—细胞工程学文本教案(第二章) 主讲教师:柳俊博士、教授 第二章细胞全能性与形态发生(6学时) 教学目的与要求 掌握细胞离体培养的基本理论基础,从而深入理解培养条件下组织细胞脱分化和再分化 的调控原理,了解体细胞胚形成过程及其与合子胚的差异, 第一节细胞全能性及其表达 细胞全能性概述 简单地讲,一个生活细胞所具有的产生完整生物个体的潜在能力称之为细胞的全能 性。 参照动物细胞研究分类类型,植物细胞也可分为三类: 第一类是茎尖、根尖及形成层细胞,这类细胞始终保持分裂能力,从一个周期进入另 个周期,为周期细胞。 第二类是筛管、导管、气孔保卫细胞等特化细胞,他们为永久失去分裂能力的细胞, 为终端分化细胞 第三类是表皮细胞及各种薄壁细胞,这类细胞在通常情况下不分裂,但在受到外界刺 激后可重新启动分裂,称为Go细胞 个植物细胞向分生状态回复过程所能进行的程度,取决于它在自然部位上所处的位 置和生理状态。 培养条件下的细胞脱分化 培养条件下使一个已分化的细胞回复到原始无分化状态或分生细胞状态的过程就是细 胞脱分化( dedifferentiation)。 1.细胞脱分化过程中生理活动与细胞结构的变化 脱分化过程中细胞结构会发生急剧变化。这些变化总体上包括:细胞质显著变浓,大液 泡消失,核体积增加并逐渐移位至细胞中央,细胞器增加 液泡蛋白体的出现和质体转变为原质体被认为是细胞脱分化的重要特征。 根据脱分化过程的时空顺序,细胞的脱分化过程可分为三个阶段 第一阶段为启动阶段,表现为细胞质增生,并开始向细胞中央伸出细胞质丝,液泡蛋白 体出现; 第二阶段为演变阶段,此时细胞核开始向中央移动,质体演变成原质体 第三阶段为脱分化终结期,细胞回复到分生细胞状态,细胞分裂即将开始 2.细胞脱分化的调控机理 细胞周期调控 激素的作用 PSK的调控作用 染色体变化 3.细胞分裂与愈伤组织形成 脱分化是细胞生理状态的改变,而形成愈伤组织是离体培养中的一个阶段 、细胞分化
华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 文本教案(第二章) 主讲教师：柳俊博士、教授 第二章 细胞全能性与形态发生（6 学时） 教学目的与要求： 掌握细胞离体培养的基本理论基础，从而深入理解培养条件下组织细胞脱分化和再分化 的调控原理，了解体细胞胚形成过程及其与合子胚的差异。 第一节 细胞全能性及其表达 一、细胞全能性概述 简单地讲，一个生活细胞所具有的产生完整生物个体的潜在能力称之为细胞的全能 性。 参照动物细胞研究分类类型，植物细胞也可分为三类： 第一类是茎尖、根尖及形成层细胞，这类细胞始终保持分裂能力，从一个周期进入另 一个周期，为周期细胞。 第二类是筛管、导管、气孔保卫细胞等特化细胞，他们为永久失去分裂能力的细胞， 为终端分化细胞。 第三类是表皮细胞及各种薄壁细胞，这类细胞在通常情况下不分裂，但在受到外界刺 激后可重新启动分裂，称为 Go 细胞 一个植物细胞向分生状态回复过程所能进行的程度，取决于它在自然部位上所处的位 置和生理状态。 二、培养条件下的细胞脱分化 培养条件下使一个已分化的细胞回复到原始无分化状态或分生细胞状态的过程就是细 胞脱分化（dedifferentiation）。 1．细胞脱分化过程中生理活动与细胞结构的变化 脱分化过程中细胞结构会发生急剧变化。这些变化总体上包括：细胞质显著变浓，大液 泡消失，核体积增加并逐渐移位至细胞中央，细胞器增加。 液泡蛋白体的出现和质体转变为原质体被认为是细胞脱分化的重要特征。 根据脱分化过程的时空顺序，细胞的脱分化过程可分为三个阶段： 第一阶段为启动阶段，表现为细胞质增生，并开始向细胞中央伸出细胞质丝，液泡蛋白 体出现； 第二阶段为演变阶段，此时细胞核开始向中央移动，质体演变成原质体； 第三阶段为脱分化终结期，细胞回复到分生细胞状态，细胞分裂即将开始。 2．细胞脱分化的调控机理 细胞周期调控 激素的作用 PSK 的调控作用 染色体变化 3．细胞分裂与愈伤组织形成 脱分化是细胞生理状态的改变，而形成愈伤组织是离体培养中的一个阶段。 三、细胞分化
华中农业大学创建国家精品课程—细胞工程学文本教案(第二章) 主讲教师:柳俊博士、教授 所谓细胞分化( diferentiation),是指导致细胞形成不同结构,引起功能改变或潜在 发育方式改变的过程(许智宏,1998)。 个细胞在不同的发育阶段上可以有不同的形态和机能,这是在时间上的分化;同 种细胞后代,由于所处的环境(如部位)不同而可以有相异的形态和机能,这是在空间上 的分化 单细胞生物仅有时间上的分化,如噬菌体的溶菌型和溶原型。多细胞生物的细胞不但 有时间上的分化,而且由于在同一个体上的各个细胞所处的位置不同,因而发生机能上的 分工,于是又有空间上的分化,如一个植物个体在其顶端、根、茎、叶等不同部位具有不 同的细胞。 1.细胞分化与基因组变化 染色体重复复制 DNA的差异扩增 基因重排 2.极性与细胞分化 所谓极性是指植物的器官、组织、甚至单个细胞在不同的轴向上存在的某种形态结构 以及生理生化上的梯度差异。极 性无论在低等植物或高等植物中均普遍存在。 极性一旦建立,在一般情况下不可逆转 在很多情况下,细胞的不均等分裂是细胞极性建立的标志 3.TE细胞分化及其调控 作为维管系统的主要成分,管状分子( tracheary elements,TEs)在维管系统的形成中 具有中心作用。在植物系统发育条件下,TEs由根和芽的原形成层或次生形成层细胞分化形 成。在离体培养条件下,TEsS则由愈伤组织薄壁细胞分化形成,这也是愈伤组织细胞分化器 官的前提 4.激素在细胞分化中的调控作用 激素在植物生长发育中具有重要的调控作用,也是离体培养条件下调控细胞脱分化和 再分化的主要因素,其中生长素和细胞分裂素是两类主要的调控培养条件下细胞生长和分 化的植物激素。此外,在有些试验中也显示,GA3、ABA、乙烯等也在细胞分化中起到 定的调节作用。 第二节器官发生 植物的离体器官发生是指培养条件下的组织或细胞团(愈伤组织)分化形成不定根 ( adventitious roots)、不定芽( adventitious shoots)等器官的过程。 离体培养中器官发生的方式 通过器官发生形成再生植株大体上有三种方式 第一种方式是先芽后根 二种方式为先根后芽 第三种方式是在愈伤组织的不同部位形成芽和根,再通过维管组织的联系形成完整植 株 、器官分化过程
华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 文本教案(第二章) 主讲教师：柳俊博士、教授 所谓细胞分化（differentiation），是指导致细胞形成不同结构，引起功能改变或潜在 发育方式改变的过程（许智宏，1998）。 一个细胞在不同的发育阶段上可以有不同的形态和机能，这是在时间上的分化；同一 种细胞后代，由于所处的环境（如部位）不同而可以有相异的形态和机能，这是在空间上 的分化。 单细胞生物仅有时间上的分化，如噬菌体的溶菌型和溶原型。多细胞生物的细胞不但 有时间上的分化，而且由于在同一个体上的各个细胞所处的位置不同，因而发生机能上的 分工，于是又有空间上的分化，如一个植物个体在其顶端、根、茎、叶等不同部位具有不 同的细胞。 1．细胞分化与基因组变化 染色体重复复制 DNA 的差异扩增 基因重排 2．极性与细胞分化 所谓极性是指植物的器官、组织、甚至单个细胞在不同的轴向上存在的某种形态结构 以及生理生化上的梯度差异。极 性无论在低等植物或高等植物中均普遍存在。 极性一旦建立，在一般情况下不可逆转。 在很多情况下，细胞的不均等分裂是细胞极性建立的标志。 3．TE 细胞分化及其调控 作为维管系统的主要成分，管状分子（tracheary elements，TEs）在维管系统的形成中 具有中心作用。在植物系统发育条件下，TEs 由根和芽的原形成层或次生形成层细胞分化形 成。在离体培养条件下，TEs 则由愈伤组织薄壁细胞分化形成，这也是愈伤组织细胞分化器 官的前提。 4．激素在细胞分化中的调控作用 激素在植物生长发育中具有重要的调控作用，也是离体培养条件下调控细胞脱分化和 再分化的主要因素，其中生长素和细胞分裂素是两类主要的调控培养条件下细胞生长和分 化的植物激素。此外，在有些试验中也显示，GA3、ABA、乙烯等也在细胞分化中起到一 定的调节作用。 第二节 器官发生 植物的离体器官发生是指培养条件下的组织或细胞团（愈伤组织）分化形成不定根 （adventitious roots）、不定芽（adventitious shoots）等器官的过程。 一、离体培养中器官发生的方式 通过器官发生形成再生植株大体上有三种方式： 第一种方式是先芽后根 第二种方式为先根后芽 第三种方式是在愈伤组织的不同部位形成芽和根，再通过维管组织的联系形成完整植 株。 二、器官分化过程
华中农业大学创建国家精品课程—细胞工程学文本教案(第二章) 主讲教师:柳俊博士、教授 离体培养条件下,经过愈伤组织再分化器官一般要经过三个生长阶段。 第一阶段是外植体经过诱导形成愈伤组织。 阶段是“生长中心”形成。当把愈伤组织转移到有利于有序生长的条件下以后 首先在若干部位成丛出现类似形成层的细胞群,通常称之为“生长中心”,也称为拟分生 组织,它们是愈伤组织中形成器官的部位 第三阶段是器官原基及器官形成 在有些情况下,外植体不经过典型的愈伤组织即可形成器官原基。这一途径有两种情 况: 是外植体中已存在器官原基,进一步培养即形成相应的组织器官进而再生植株,如 茎尖、根尖分生组织培养; 另一种情况是外植体某些部位的细胞,在重新分裂后直接形成分生细胞团,然后由分 生细胞团形成器官原基。这种不经过愈伤组织直接发生器官的途径在以品种繁殖为目的的 离体培养中具有重要的实践意义。 研究表明,在叶肉细胞再生植株过程中,最初分裂细胞的第一次分裂轴向是十分重要 的。在不经过愈伤组织的器官分化中,这次平周分裂既是叶肉细胞的脱分化,同时也是该 细胞转变发育方式极性的确定。现在,有人把最先启动分裂的这些细胞称之为感受态细 、起始材料对器官分化的影响 1.母体植株的遗传基础 表1.1不同基因型器官分化能力的比较 植物种类 基因型 愈伤组织 (品种/自交诱导率 器官分化 及外植体类型 (%) 率(%)资料来源 大豆:上胚轴汾豆33 94 程林梅等,2001 晋豆19 28 晋遗21 晋豆11 93 汾豆38 93 23 汾豆17 23 汾豆51 晋早125 甘薯:叶片 济南红 100 22 张宝红,1993 宁-331 9 千系-682
华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 文本教案(第二章) 主讲教师：柳俊博士、教授 离体培养条件下，经过愈伤组织再分化器官一般要经过三个生长阶段。 第一阶段是外植体经过诱导形成愈伤组织。 第二阶段是“生长中心”形成。当把愈伤组织转移到有利于有序生长的条件下以后， 首先在若干部位成丛出现类似形成层的细胞群，通常称之为“生长中心”，也称为拟分生 组织，它们是愈伤组织中形成器官的部位。 第三阶段是器官原基及器官形成。 在有些情况下，外植体不经过典型的愈伤组织即可形成器官原基。这一途径有两种情 况： 一是外植体中已存在器官原基，进一步培养即形成相应的组织器官进而再生植株，如 茎尖、根尖分生组织培养； 另一种情况是外植体某些部位的细胞，在重新分裂后直接形成分生细胞团，然后由分 生细胞团形成器官原基。这种不经过愈伤组织直接发生器官的途径在以品种繁殖为目的的 离体培养中具有重要的实践意义。 研究表明，在叶肉细胞再生植株过程中，最初分裂细胞的第一次分裂轴向是十分重要 的。在不经过愈伤组织的器官分化中，这次平周分裂既是叶肉细胞的脱分化，同时也是该 细胞转变发育方式极性的确定。现在，有人把最先启动分裂的这些细胞称之为感受态细 胞。 三、起始材料对器官分化的影响 1．母体植株的遗传基础 表 1.1 不同基因型器官分化能力的比较 植物种类 及外植体类型 基因型 （品种/自交 系） 愈伤组织 诱导率 （％） 器官分化 率（％） 资料来源 大豆：上胚轴 汾豆 33 晋豆 19 晋遗 21 晋豆 11 汾豆 38 汾豆 17 汾豆 51 晋早 125 94 93 91 93 93 93 92 91 34 28 22 20 23 23 16 12 程林梅等，2001 甘薯：叶片 济南红 宁－331 千系－682 100 100 11 22 9 0 张宝红，1993
华中农业大学创建国家精品课程—细胞工程学文本教案(第二章) 主讲教师:柳俊博士、教授 小麦:幼胚鄂麦1298 36 覃建兵和何光 鄂恩1号 源,2001 绵阳26 100 444 鄂55072 荆35 玉米:幼胚 340 38 杜娟等,2002 Mol 17 100 62 4112 8902 846 477 100 47 吉853 100 吉921 44 2.外植体的类型 外植体对诱导反应及其再生能力的影响体现在外植体的生理状态上。总体来讲,生理 状态年轻,来源于生长活跃或生长潜力大的组织和器官的细胞更有利于培养,但具体到不 同的植物类型则有较大差异。 外植体选取合理与否,不仅影响培养的难易,而且有时甚至影响分化的程度和器官类 型。1974年 Tran Thanh van等取烟草正在开花的植株的薄层表皮进行培养,结果不同部位 的表皮外植体所形成的芽的类型不同 四、激素对器官分化的调控 激素在细胞生长与个体发育中具有重要的调控作用。离体培养下的器官分化,在大多 数情况下是通过外源提供适宜的植物激素而实现的。在众多的植物激素中,生长素与细胞 分裂素是两类主要的植物激素,在离体器官分化调控中占有主导地位 离体培养中,外源激素在细胞内的吸收和代谢影响到激素的活性从而影响其培养效果。 表22外源生长素在胡萝卜上胚轴培养细胞中的总量和游离生长素含量* 外源生长素浓度(ng/gFW) 培养时间 生长素 游离形式 总浓度 2,4-D23,247.4±3,912.7 21,9794±2,526.3 NAA 99.3±97 1776.7±50.1 [H4]AA30.3±3.5 7,557.0±279.0 4周 2,4-D20,003.8±4,3659 33,1194±3,835.0 NAA 64.8±17.5 16370±509.8 [H4]AA34±14 763.5±420.0 *引自 Finicky等,1996
华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 文本教案(第二章) 主讲教师：柳俊博士、教授 小麦：幼胚 鄂麦 12 鄂恩 1 号 89－11 绵阳 26 鄂 55072 荆 35 98 96 10 100 100 100 36 32 4 4 4 12 覃建兵和何光 源，2001 玉米：幼胚 340 7922 Mol 17 4112 8902 846 477 吉 853 吉 921 444 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 78 86 62 53 57 38 47 11 32 0.4 杜娟等，2002 2．外植体的类型 外植体对诱导反应及其再生能力的影响体现在外植体的生理状态上。总体来讲，生理 状态年轻，来源于生长活跃或生长潜力大的组织和器官的细胞更有利于培养，但具体到不 同的植物类型则有较大差异。 外植体选取合理与否，不仅影响培养的难易，而且有时甚至影响分化的程度和器官类 型。1974 年 Tran Thanh Van 等取烟草正在开花的植株的薄层表皮进行培养，结果不同部位 的表皮外植体所形成的芽的类型不同。 四、激素对器官分化的调控 激素在细胞生长与个体发育中具有重要的调控作用。离体培养下的器官分化，在大多 数情况下是通过外源提供适宜的植物激素而实现的。在众多的植物激素中，生长素与细胞 分裂素是两类主要的植物激素，在离体器官分化调控中占有主导地位。 离体培养中，外源激素在细胞内的吸收和代谢影响到激素的活性从而影响其培养效果。 表 2.2 外源生长素在胡萝卜上胚轴培养细胞中的总量和游离生长素含量* 培养时间 外源生长素浓度（ng/g FW） 生长素 游离形式 总浓度 1 周 2，4－D 23,247.4±3,912.7 21,979.4±2,526.3 NAA 99.3±9.7 1,776.7±50.1 [ 2H4]IAA 30.3±3.5 7,557.0±279.0 4 周 2，4－D 20,003.8±4,365.9 33,119.4±3,835.0 NAA 64.8±17.5 1,637.0±509.8 [ 2H4]IAA 3.4±1.4 763.5±420.0 * 引自 Ribnicky 等，1996
华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 文本教案(第二章) 主讲教师:柳俊博士、教授 五、光照对器官分化的影响 光照时间、强度以及光质对器官分化均有影响。 由于培养条件下光合作用能力较低,因此光照的作用更大程度上是调节细胞的分化状 态,而不是合成光合产物 光照对器官发生的调节可能与其对培养物内源激素平衡的调节有关。 六.器官分化的基因调控 同源框( homebox)基因 KnI (KNOTTEDI) STM(Shootmeristemless cdc2 bZIP (PKSF1) SRDⅠ、SRD2和SRD3 第三节体细胞胚胎发生 离体培养下没有经过受精过程,但经过了胚胎发育过程所形成的胚的类似物(不管培 养的细胞是体细胞还是生殖细胞),统称为体细胞胚或胚状体。 这一定义有以下几方面的界定: 其一,体细胞胚是离体培养的产物,只限于在离体培养范围使用,以区别于无融合生 殖胚 其二,体细胞胚起源于非合子细胞,以区别于合子胚 其三,体细胞经过了胚胎发育过程,以区别与离体培中器官发生形成个体的途径(崔 凯荣和戴若兰,2000)。 体细胞胚的形成 体细胞胚从外植体上直接发生 在以叶片为外植体的培养中,体细胞胚的直接形成可分为两个阶段: 个阶段为诱导期。在此阶段中,叶片表皮细胞或亚表皮细胞感受培养刺激,进入 分裂状态。 第二个阶段是胚胎发育期。在这一阶段,形成的瘤状物继续发育,经过球形胚、心形胚等 发育过程,最后形成体细胞胚 2.经过愈伤组织的体细胞胚发生 经过愈伤组织的胚胎发生需要三个培养阶段 第一阶段是诱导外植体形成愈伤组织 第二阶段是诱导愈伤组织胚性化; 第三阶段是体细胞胚形成。 在以幼胚、胚以及子叶为外植体时,通常可以直接诱导胚性愈伤组织产生,进而发生 体细胞胚。因此,经过愈伤组织的体细胞胚胎发生,胚性愈伤组织的形成是培养的关键。 进而发生原胚,经过不同时期完成体细胞胚胎发育(图1.12)。 图1.12蝴蝶兰茎段外植体经过愈伤组织的体细胞胚发生(引自Lin等,20000 3.细胞悬浮培养的体细胞胚胎发生 在胡萝卜细胞悬浮培养中,体细胞胚胎形成的细胞学观察表明,其培养物中存在两种
华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 文本教案(第二章) 主讲教师：柳俊博士、教授 五、光照对器官分化的影响 光照时间、强度以及光质对器官分化均有影响。 由于培养条件下光合作用能力较低，因此光照的作用更大程度上是调节细胞的分化状 态，而不是合成光合产物。 光照对器官发生的调节可能与其对培养物内源激素平衡的调节有关。 六．器官分化的基因调控 同源框（homebox）基因： Kn1（KNOTTED1） STM（Shootmeristemless） cdc2 ESR1 bZIP（PKSF1） SRD1、SRD2 和 SRD3 第三节 体细胞胚胎发生 离体培养下没有经过受精过程，但经过了胚胎发育过程所形成的胚的类似物（不管培 养的细胞是体细胞还是生殖细胞），统称为体细胞胚或胚状体。 这一定义有以下几方面的界定： 其一，体细胞胚是离体培养的产物，只限于在离体培养范围使用，以区别于无融合生 殖胚； 其二，体细胞胚起源于非合子细胞，以区别于合子胚； 其三，体细胞经过了胚胎发育过程，以区别与离体培中器官发生形成个体的途径（崔 凯荣和戴若兰，2000）。 一、体细胞胚的形成 1．体细胞胚从外植体上直接发生 在以叶片为外植体的培养中，体细胞胚的直接形成可分为两个阶段： 第一个阶段为诱导期。在此阶段中，叶片表皮细胞或亚表皮细胞感受培养刺激，进入 分裂状态。 第二个阶段是胚胎发育期。在这一阶段，形成的瘤状物继续发育，经过球形胚、心形胚等 发育过程，最后形成体细胞胚。 2．经过愈伤组织的体细胞胚发生 经过愈伤组织的胚胎发生需要三个培养阶段： 第一阶段是诱导外植体形成愈伤组织； 第二阶段是诱导愈伤组织胚性化； 第三阶段是体细胞胚形成。 在以幼胚、胚以及子叶为外植体时，通常可以直接诱导胚性愈伤组织产生，进而发生 体细胞胚。因此，经过愈伤组织的体细胞胚胎发生，胚性愈伤组织的形成是培养的关键。 进而发生原胚，经过不同时期完成体细胞胚胎发育（图 1.12）。 图 1.12 蝴蝶兰茎段外植体经过愈伤组织的体细胞胚发生（引自 Lin 等，2000） 3．细胞悬浮培养的体细胞胚胎发生 在胡萝卜细胞悬浮培养中，体细胞胚胎形成的细胞学观察表明，其培养物中存在两种
华中农业大学创建国家精品课程—细胞工程学文本教案(第二章) 主讲教师:柳俊博士、教授 类型的细胞:一是自由分散在培养基中的大而高度液泡化的细胞,这类细胞一般不具备胚 胎发生潜力;二是成簇成团的体积小而细胞质致密的细胞,这类细胞具有成胚能力,因 而,把这类细胞团又称为胚性细胞团 胚性细胞团转移到适宜的胚胎发生培养基上以后,其外围的许多细胞开始第一次不均 等分裂,靠近细胞团方向的一个细胞较大,以后发育成类似胚柄的结构。另一个细胞则继 续分裂形成类似原胚的结构,以后经过类似于体内的发育过程,经球形期、心形期等发育 阶段形成完整的体细胞胚(李浚明,1991)。 通过悬浮细胞系再生体细胞胚,由于胚性细胞可以继代增殖,因此可以提高胚胎的生 产效率 、体细胞胚的结构与发育特点 与器官发生形成个体的途径相比: 体细胞胚发育再生植株有两个明显的特点。一是体细胞胚具有双极性( double polarit!y),二是体细胞胚形成后与母体的维管束系统连系较少,即出现所谓的生理隔离 ( physiological isolation)现象 由于大多数体细胞胚起源于单细胞,因此对于单个植株来讲,通过体细胞胚形成的再 生植株,其遗传特性相对稳定。 与合子胚相比: 合子胚在发育初期具有明显的胚柄,而体细胞胚一般没有真正的胚柄只有类似胚柄的 结构。特别是那些发育初期类似于动物胚胎发育途径的体细胞胚,这一点更为明显。 合子胚的子叶是相当规范的,可以作为分类的依据,而体细胞胚的子叶常不规范,有 时具有两片以上的子叶。 与相同植物比较,体细胞胚的体积明显小于合子胚 体细胞胚没有休眠而体细胞胚则直接形成植株。合子胚在胚胎发育完全进入子叶期以 后,经过一系列的物质积累和脱水就进入休眠 、影响体细胞胚发生的因素 外源激素对体细胞胚胎发生的调控 2,4-D是应用最为广泛的生长素 2,4一D的应用有着规律性的变化。首先是在较高浓度下诱导胚性细胞的形成,然后 在降低2,4-D的浓度下产生早期胚胎,一般在球形胚形成后,除去生长素则有利于体细 胞胚的继续发育。 2.培养基及培养条件对体细胞胚形成的影响 体细胞胚的产生要求培养基中含有一定浓度的还原态氮 球形胚形成后,如果降低培养基的无机盐浓度,可以显著促进体细胞胚的进一步发 育。 在一些试验中还发现,体细胞胚发育后期降低蔗糖浓度,也有利于胚的继续发育和提 高体细胞胚的成苗率。 3.不同基因型间体细胞胚形成能力的差异 体细胞胚的产生在不同类型的植物间具有明显差异 在已成功获得体细胞胚的植物中,以自然条件下容易产生无融合生殖胚的植物为多,且 培养条件相对较为简单,如咖啡属植物、芸香科植物等 即使是同类植物的不同基因型,在体细胞胚诱导的难易、形成时间以及单个外植体产生
华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 文本教案(第二章) 主讲教师：柳俊博士、教授 类型的细胞：一是自由分散在培养基中的大而高度液泡化的细胞，这类细胞一般不具备胚 胎发生潜力；二是成簇成团的体积小而细胞质致密的细胞，这类细胞具有成胚能力，因 而，把这类细胞团又称为胚性细胞团。 胚性细胞团转移到适宜的胚胎发生培养基上以后，其外围的许多细胞开始第一次不均 等分裂，靠近细胞团方向的一个细胞较大，以后发育成类似胚柄的结构。另一个细胞则继 续分裂形成类似原胚的结构，以后经过类似于体内的发育过程，经球形期、心形期等发育 阶段形成完整的体细胞胚（李浚明，1991）。 通过悬浮细胞系再生体细胞胚，由于胚性细胞可以继代增殖，因此可以提高胚胎的生 产效率。 二、体细胞胚的结构与发育特点 与器官发生形成个体的途径相比： 体细胞胚发育再生植株有两个明显的特点。一是体细胞胚具有双极性（double polarity），二是体细胞胚形成后与母体的维管束系统连系较少，即出现所谓的生理隔离 （physiological isolation）现象。 由于大多数体细胞胚起源于单细胞，因此对于单个植株来讲，通过体细胞胚形成的再 生植株，其遗传特性相对稳定。 与合子胚相比： 合子胚在发育初期具有明显的胚柄，而体细胞胚一般没有真正的胚柄只有类似胚柄的 结构。特别是那些发育初期类似于动物胚胎发育途径的体细胞胚，这一点更为明显。 合子胚的子叶是相当规范的，可以作为分类的依据，而体细胞胚的子叶常不规范，有 时具有两片以上的子叶。 与相同植物比较，体细胞胚的体积明显小于合子胚。 体细胞胚没有休眠而体细胞胚则直接形成植株。合子胚在胚胎发育完全进入子叶期以 后，经过一系列的物质积累和脱水就进入休眠。 三、影响体细胞胚发生的因素 1．外源激素对体细胞胚胎发生的调控 2，4－D 是应用最为广泛的生长素。 2，4－D 的应用有着规律性的变化。首先是在较高浓度下诱导胚性细胞的形成，然后 在降低 2，4－D 的浓度下产生早期胚胎，一般在球形胚形成后，除去生长素则有利于体细 胞胚的继续发育。 2．培养基及培养条件对体细胞胚形成的影响 体细胞胚的产生要求培养基中含有一定浓度的还原态氮。 球形胚形成后，如果降低培养基的无机盐浓度，可以显著促进体细胞胚的进一步发 育。 在一些试验中还发现，体细胞胚发育后期降低蔗糖浓度，也有利于胚的继续发育和提 高体细胞胚的成苗率。 3．不同基因型间体细胞胚形成能力的差异 体细胞胚的产生在不同类型的植物间具有明显差异。 在已成功获得体细胞胚的植物中，以自然条件下容易产生无融合生殖胚的植物为多，且 培养条件相对较为简单，如咖啡属植物、芸香科植物等。 即使是同类植物的不同基因型，在体细胞胚诱导的难易、形成时间以及单个外植体产生
华中农业大学创建国家精品课程—细胞工程学文本教案(第二章) 主讲教师:柳俊博士、教授 体细胞胚的数量上也存在明显差异。马铃薯18个不同基因型品种的体细胞胚形成能力的比 较研究显示,以接种外植体与体细胞胚能否形成的资料统计,有7个品种的体细胞胚发生率 为100%,而频率最低则只有10%。 四、体细胞胚胎发生的生化与分子基础 1.体细胞胚形成过程中内源生长素的变化 体细胞胚胎发育研究表明,外源生长素对体细胞胚产生和发育的调控是通过调节内源激 素的合成、代谢、极性运输和平衡而起作用的。 体细胞胚胎发生中,外源生长素的使用模式或者说规律,在大多数植物中是相似的,如 诱导胚性细胞产生,或诱导愈伤组织转化为胚性愈伤组织,均需要高浓度的生长素。当球形 胚形成后,则需要降低生长素水平才能完成体细胞胚的继续发育 研究显示,生长素的这一应用规律与胚胎发育过程中内源激素的变化是一致的。 2.体细胞胚发生过程中的特异蛋白质 有关体细胞胚形成中蛋白质含量和组分的变化,尽管不同研究在绝对含量上不尽相同, 但总体趋势均表现出,体细胞胚形成过程中水溶性蛋白明显增加。 表24水稻不同愈伤组织(干重)可溶性蛋白质含量(μgmg1)* 可溶性蛋白 质 胚性愈伤组织非胚性愈伤组织继代10次的愈伤组 水溶性蛋白 质 盐溶性蛋白1363 30.0 24.5 醇溶性蛋白10.6 144 10.9 质 13.6 碱溶性蛋白 *引自李中奎等,1993 阿拉伯半乳糖蛋白(AGPs) 某些病程相关蛋白可能也与体细胞胚的形成有关 3.体细胞胚形成的基因表达调控 通过基因表达的差异显示和胚胎发育突变体等技术,已分离出几十个与体细胞胚发育相 关的基因。除了一些典型的激素调控基因外,还有其它类型的基因。 表25胡萝卜体细胞胚形成相关的部分基因 基因表达产物表达时期资料来源 DC8 LEA(Grp3)心形胚 Borrkird等,1986; franz等, 1989: Halzopoulos ,1990 DC59 Oleosin 心形胚 Choi, 1987; Hatzopoulos 等,1990 DC3LEA(Grp3)原胚、球形胚、wlde等,1988 心形胚
华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 文本教案(第二章) 主讲教师：柳俊博士、教授 体细胞胚的数量上也存在明显差异。马铃薯 18 个不同基因型品种的体细胞胚形成能力的比 较研究显示，以接种外植体与体细胞胚能否形成的资料统计，有 7 个品种的体细胞胚发生率 为 100％，而频率最低则只有 10％。 四、体细胞胚胎发生的生化与分子基础 1．体细胞胚形成过程中内源生长素的变化 体细胞胚胎发育研究表明，外源生长素对体细胞胚产生和发育的调控是通过调节内源激 素的合成、代谢、极性运输和平衡而起作用的。 体细胞胚胎发生中，外源生长素的使用模式或者说规律，在大多数植物中是相似的，如 诱导胚性细胞产生，或诱导愈伤组织转化为胚性愈伤组织，均需要高浓度的生长素。当球形 胚形成后，则需要降低生长素水平才能完成体细胞胚的继续发育。 研究显示，生长素的这一应用规律与胚胎发育过程中内源激素的变化是一致的。 2．体细胞胚发生过程中的特异蛋白质 有关体细胞胚形成中蛋白质含量和组分的变化，尽管不同研究在绝对含量上不尽相同， 但总体趋势均表现出，体细胞胚形成过程中水溶性蛋白明显增加。 表 2.4 水稻不同愈伤组织（干重）可溶性蛋白质含量（μgmg -1）* 可溶性蛋白 质 胚性愈伤组织 非胚性愈伤组织 继代 10 次的愈伤组 织 水溶性蛋白 质 盐溶性蛋白 质 醇溶性蛋白 质 碱溶性蛋白 质 136.3 30.0 10.6 13.2 94.5 17.6 14.4 14.4 115.3 24.5 10.9 13.6 *引自李中奎等，1993。 阿拉伯半乳糖蛋白（AGPs） 某些病程相关蛋白可能也与体细胞胚的形成有关。 3．体细胞胚形成的基因表达调控 通过基因表达的差异显示和胚胎发育突变体等技术，已分离出几十个与体细胞胚发育相 关的基因。除了一些典型的激素调控基因外，还有其它类型的基因。 表 2.5 胡萝卜体细胞胚形成相关的部分基因 基 因 表达产物 表 达 时 期 资 料 来 源 DC8 LEA（Grp3） 心形胚 Borrkird 等，1986；Franz 等， 1989；Halzopoulos 等，1990 DC59 Oleosin 心形胚 Choi 等，1987；Hatzopoulos 等，1990 DC3 LEA（Grp3） 原胚、球形胚、 心形胚 Wilde 等，1988
华中农业大学创建国家精品课程—细胞工程学文本教案(第二章) 主讲教师:柳俊博士、教授 EMB-lLEA(Grp1)球形胚、心形胚 Ulrich等,1990; Wurtele等, 1993 ECP3lLEA(Grp4)原胚 Kiyosue等,1992,1993 ECP40LEA(Grp2)原胚 EP2 Lipid transfer原胚 De vries等,1988; Sterk等, 1991 EP3 Chintinase 原胚 De jong等,1992 DC2. Pro-rich 球形胚、心形 Aleith和 Richter,1990 protein 胚、鱼雷胚 DC7I Gly-rich 球形胚、心形胚 DC9. 1 Gly-rich 胚性细胞、原胚 protein EFI-a Elongation球形胚 puya和 Zimmerman,1992 factor CEMⅠEF1-a 原胚、球形胚、 Kawahara等,1992 心 形胚、鱼雷胚 Geal4 Lipid transfer胚性细胞、球形Liu等,1996 胚、心形胚 Gea3lPR- protein胚性细胞、球形 胚、心形胚、鱼 雷胚、小植株 Gea4 I Heat- shock球形胚、心形胚 思考题 细胞学说与细胞全能性的概念。 2.细胞分化的阶段及细胞结构的变化 3.真核生物细胞周期调控的分子机理 4.为什么说 luxury gene是细胞功能分化的调控基因? 5.离体条件下生长素与细胞分裂素在细胞分化中的作用。 6.器官发生的影响因素及调控机理。 7.体细胞胚与合子胚在形成途径和结构上的异同 8.影响体细胞胚形成的因素及调控。 9.根据体细胞胚形成的生化和分子基础,思考如何深入进行体细胞胚形成的理论与技术研 究
华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 文本教案(第二章) 主讲教师：柳俊博士、教授 EMB-1 LEA（Grp1） 球形胚、心形胚 Ulrich 等，1990；Wurtele 等， 1993 ECP31 LEA（Grp4） 原胚 ECP40 LEA（Grp2） 原胚 Kiyosue 等，1992，1993 EP2 Lipid transfer 原胚 De Vries 等，1988；Sterk 等， 1991 EP3 Chintinase 原胚 De Jong 等，1992 DC2.1 Pro-rich protein 球形胚、心形 胚、鱼雷胚 DC7.1 Gly-rich protein 球形胚、心形胚 DC9.1 Gly-rich protein 胚性细胞、原胚 Aleith 和 Richter，1990 EF1-a Elongation factor 球形胚 Apuya 和 Zimmerman，1992 CEM1 EF1-a 原胚、球形胚、 心形胚、鱼雷胚 Kawahara 等，1992 Gea14 Lipid transfer 胚性细胞、球形 胚、心形胚 Gea 31 PR-protein 胚性细胞、球形 胚、心形胚、鱼 雷胚、小植株 Gea41 Heat-shock 球形胚、心形胚 Liu 等，1996 思考题 1．细胞学说与细胞全能性的概念。 2．细胞分化的阶段及细胞结构的变化。 3．真核生物细胞周期调控的分子机理。 4．为什么说 luxury gene是细胞功能分化的调控基因？ 5．离体条件下生长素与细胞分裂素在细胞分化中的作用。 6．器官发生的影响因素及调控机理。 7．体细胞胚与合子胚在形成途径和结构上的异同。 8．影响体细胞胚形成的因素及调控。 9．根据体细胞胚形成的生化和分子基础，思考如何深入进行体细胞胚形成的理论与技术研 究