华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 文本教案(第六章) 主讲教师:柳俊博士、教授 第六章原生质体培养(4学时) 教学目的与要求 深入了解植物细胞结构功能与细胞全能性表达的关系,掌握原生质体的分离以及培养过 程中渗透压和激素的调控原理与技术。 第一节、原生质体研究概况 原生质体的概念 原生质体( protoplast):指除去细胞壁的细胞或是说一个被质膜所包围的裸露细胞 亚原生质体( subprotoplast):在原生质体分离过程中,有时会引起细胞内含物的断裂而形 成一些较小的原生质体就叫做亚原生质体。它可以具有细胞核或没有细胞核。 核质体( nuclearplast):由原生质膜和薄层细胞质包围细胞核形成的小原生质体。也称为 微小原生质体 miniprotoplast) 胞质体( cytoplast):不含细胞核而仅含有部分细胞质的原生质体。 、原生质体研究进展 植物原生质体培养研究中几个值得提出重要成就 l880年, Hanstein首次起用原生质体( protoplast词 1960年, Cocking首次应用酶法制备番茄根原生质体获得成功 1971年, Takebe et al.首次得到烟草叶肉原生质体培养的再生植株 1985年, Fujimura et al.第一例禾谷类作物一水稻原生质体培养再生植株。 1986年, Spangenberg et al单个原生质体培养再生植株在甘蓝型油菜上获得成功。 据统计,目前已有49个科,146个属的320多种植物经原生质体培养得到了再生植株 (1993)。其趋势仍以农作物和经济作物为主,但从一年生向多年生、草本向木本、高等植 物向低等植物扩展。 、原生质体研究的意义
华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 文本教案(第六章) 主讲教师：柳俊博士、教授 第六章 原生质体培养（4 学时） 教学目的与要求： 深入了解植物细胞结构功能与细胞全能性表达的关系，掌握原生质体的分离以及培养过 程中渗透压和激素的调控原理与技术。 第一节、原生质体研究概况 一、原生质体的概念 原生质体(protoplast)：指除去细胞壁的细胞或是说一个被质膜所包围的裸露细胞。 亚原生质体(subprotoplast)：在原生质体分离过程中，有时会引起细胞内含物的断裂而形 成一些较小的原生质体就叫做亚原生质体。它可以具有细胞核或没有细胞核。 核质体(nuclearplast)：由原生质膜和薄层细胞质包围细胞核形成的小原生质体。也称为 微小原生质体(miniprotoplast)。 胞质体（cytoplast）：不含细胞核而仅含有部分细胞质的原生质体。 二、原生质体研究进展 植物原生质体培养研究中几个值得提出重要成就： 1880 年，Hanstein 首次起用原生质体(protoplast)一词。 1960 年，Cocking 首次应用酶法制备番茄根原生质体获得成功。 1971 年，Takebe et al.首次得到烟草叶肉原生质体培养的再生植株。 1985 年，Fujimura et al.第一例禾谷类作物－水稻原生质体培养再生植株。 1986 年，Spangenberg et al.单个原生质体培养再生植株在甘蓝型油菜上获得成功。 据统计，目前已有 49 个科，146 个属的 320 多种植物经原生质体培养得到了再生植株 （1993）。其趋势仍以农作物和经济作物为主，但从一年生向多年生、草本向木本、高等植 物向低等植物扩展。 三、原生质体研究的意义
华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 文本教案(第六章) 主讲教师:柳俊博士、教授 Regenerative ability Cell differentiation x Ontogenic processes Organogenesis Somatic genetics Protoplast system Cell physiology Cell fusion Organella, Cell cloning DNA uptake A scheme of plant protoplast Tuber plants Suspension cells epicotyl Pre-treatment lysis Purification Vigor test Cuture and regeneration
华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 文本教案(第六章) 主讲教师：柳俊博士、教授 A scheme of plant protoplast Protoplast system Cell differentiation Ontogenic processes Organogenesis Regenerative ability Somatic genetics Cell physioloy Cell fusion Organella, DNA uptake Cell cloning Tuber plants Suspension cells Epicoty Pre-treatment enzymolysis Purification Vigour test Cuture and regeneration
华中农业大学创建国家精品课程—细胞工程学文本教案(第六章) 主讲教师:柳俊博士、教授 第二节、原生质体的制备 用于分离原生质体的材料准备 无菌试管苗叶片 上胚轴和子叶 培养细胞 酶处理 原生质体分离常用的商品酶 生产厂家 纤维素酶类 onozuka r-10绿色木霉 Yakult Honsha Co. Ltd, Tokyo, Japa Cellulysin 绿色木霉 Calbiochem. San Diego. CA 92037. USA Driselase Irpex lutens Kayowa Hakko Kogyo Co., Tokyo, Japar 果胶酶类 Macerozyme r-10根霉 Yakylt Honsha Co Ltd, Tokyo, Japan Pectinase 黑曲霉 Sigma Chemical Co. St Lout. Mo 63178.USA Pectolyase Y-23黑曲霉 Seishin Pharm. Co. Ltd, Tokyo, Japan 半纤维素酶 Rhozyme HP-150黑曲酶 Rohm and Hass Co, Philadelphia, PA19105,USA Hemicellulase黑曲霉 Sigma Chemical Co St Louis, MO 63178,USA 酶溶剂及其渗透压 酶溶剂:原生质体培养基或特殊配制。 渗透压调节剂:葡萄糖、甘露醇、山梨醇等。酶解时间 酶浓度及酶解时间 酶浓度 酶解温度 3、原生质体的收集和纯化 飘浮法:常用的飘浮剂有蔗糖、 Percoll、 Ficoll 沉淀法:常用甘露醇作为滲透压调节剂,先将酶液洗出干净,再用 Perce飘浮 次
华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 文本教案(第六章) 主讲教师：柳俊博士、教授 第二节、原生质体的制备 1、 用于分离原生质体的材料准备 无菌试管苗叶片 上胚轴和子叶 培养细胞 2、 酶处理 原生质体分离常用的商品酶 酶 来 源 生产厂家 纤维素酶类 onozuka R–10 绿色木霉 Yakult Honsha Co. Ltd., Tokyo, Japan Cellulysin 绿色木霉 Calbiochem., San Diego, CA 92037, USA Driselase Irpex lutens Kayowa Hakko Kogyo Co., Tokyo, Japan 果胶酶类 Macerozyme R-10 根霉 Yakylt Honsha Co. Ltd.,Tokyo, Japan Pectinase 黑曲霉 Sigma Chemical Co., St. Louit, MO 63178,USA Pectolyase Y-23 黑曲霉 Seishin Pharm. Co. Ltd., Tokyo, Japan 半纤维素酶 Rhozyme HP-150 黑曲酶 Rohm and Hass Co., Philadelphia, PA 19105, USA Hemicellulase 黑曲霉 Sigma Chemical Co.,St. Louis, MO 63178,USA 酶溶剂及其渗透压 酶溶剂：原生质体培养基或特殊配制。 渗透压调节剂：葡萄糖、甘露醇、山梨醇等。 酶浓度及酶解时间 3、 原生质体的收集和纯化 飘浮法：常用的飘浮剂有蔗糖、Percoll、Ficoll。 沉淀法：常用甘露醇作为渗透压调节剂，先将酶液洗出干净，再用 Percoll 飘浮 一次。 酶 解 时 间 酶 浓 度 酶 解 温 度
华中农业大学创建国家精品课程—细胞工程学文本教案(第六章) 主讲教师:柳俊博士、教授 4、原生质体活力检测 目测法:在显微镜下观察,根据细胞形态、流动性确定原生质体活力。 FDA法:FDA(二乙酸荧光素)是一种非极性物质,能自由地穿越细胞质膜,在活细胞 内,FDA被酯酶裂解即发荧光(荧光素),由于荧光素不能自由通过质膜,因而可以在 荧光显微镜下通过具荧光的细胞的观察确定细胞活性 ●伊凡蓝法:伊凡蓝不能穿过质膜,只有质膜受到严重损坏使,细胞才能被染色,因而可 以通过细胞被染色与否确定活性 影响原生质体活力的因素 分离材料的生理状态 酶解条件:酶质量、浓度、酶解温度、酶解时间、酶溶液的渗透压 分离条件:离心次数、离心速度、纯化方法、分离持续时间 环境条件:操作环境的温度、分离用具的影响 第三节、原生质体培养 培养基 1.渗透压 常用的渗透压调节剂:甘露醇、山梨醇、蔗糖和葡萄糖等 原生质体的渗透压原则:培养基渗透压与细胞渗透压等渗。 2.无机盐 大量元素浓度; NO3和NH的比例; Ca浓度 3.有机成分 维生素、氨基酸、糖及糖醇等,酵母提取物、水解酪蛋白。 4.激素 常用的激素:NAA、IAA、BA与24D H值 四、原生质体培养方法 ●液体浅层培养
华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 文本教案(第六章) 主讲教师：柳俊博士、教授 4、 原生质体活力检测 目测法：在显微镜下观察，根据细胞形态、流动性确定原生质体活力。 FDA 法：FDA（二乙酸荧光素）是一种非极性物质，能自由地穿越细胞质膜，在活细胞 内，FDA 被酯酶裂解即发荧光（荧光素），由于荧光素不能自由通过质膜，因而可以在 荧光显微镜下通过具荧光的细胞的观察确定细胞活性。 伊凡蓝法：伊凡蓝不能穿过质膜，只有质膜受到严重损坏使，细胞才能被染色，因而可 以通过细胞被染色与否确定活性。 5、 影响原生质体活力的因素 分离材料的生理状态 酶解条件：酶质量、浓度、酶解温度、酶解时间、酶溶液的渗透压 分离条件：离心次数、离心速度、纯化方法、分离持续时间 环境条件：操作环境的温度、分离用具的影响 第三节、原生质体培养 一、培养基 1．渗透压 常用的渗透压调节剂：甘露醇、山梨醇、蔗糖和葡萄糖等。 原生质体的渗透压原则：培养基渗透压与细胞渗透压等渗。 2．无机盐 大量元素浓度； NO3 －和 NH4 +的比例； Ca2+浓度 3．有机成分 维生素、氨基酸、糖及糖醇等，酵母提取物、水解酪蛋白。 4．激素 常用的激素：NAA、IAA、BA 与 2,4-D 5．pH 值 四、 原生质体培养方法 液体浅层培养
华中农业大学创建国家精品课程—细胞工程学文本教案(第六章) 主讲教师:柳俊博士、教授 固体培养 液体一固体双层培养 琼脂糖珠培养 五、愈伤组织形成和植株再生 细胞分裂与细胞壁再生 愈伤组织形成 愈伤组织分化 植株再生 第四节、影响原生质体培养的主要因素 基因型 较早的试验曾证明矮牵牛叶肉原生质体的不同生长发育时期是受不同基因所控制的。 通过番茄与秘鲁番茄有性杂交后对性状分离的遗传分析,证明其愈伤组织的再生能力是 2个显性基因所决定的( Koornneef m et al,1987)。 Cheng和 Veilleux(1991)对芙薯(S. Phureja)原生质体的培养能力也做过遗传分析,并证明从原生质体培养到形成愈伤组织是 受2个独立位点的显性基因所控制 Cheng et al,1991) Dudits等(1991)用苜宿( Medicago sativa)不同基因型做了较深入的研究,认为有某个基 因型在离体培养时难以形成细胞胚。但是,如果将对激素调节有作用的发根农杆菌的 rolB和roC基因引入并表达,就可能促使其体细胞胚形成。 、原生质体的来源 供体材料体类型 供体细胞的分化程度 供体细胞的生长同步性 、起始培养密度与培养基 基本起始密度 培养基激素水平 密度与培养基营养成分完全性 四、原生质体培养中的一些生理问题 1.逆境反应 细胞壁降解酶是一种逆境诱导剂,因此可以产生活化氧引起脂类过氧化,减少细胞流度 同时伴随着细胞膜的渗漏( (shii H,1988)。 细胞的逆境反应一般是快速地产生涉及诱发不同代谢途径(例如苯基丙烷途径 phenyl propanoid route)的酶系统,结果形成了植物抗毒素( phyto- -alexins)和如木质素一类的结 构多聚物
华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 文本教案(第六章) 主讲教师：柳俊博士、教授 固体培养 液体－固体双层培养 琼脂糖珠培养 五、 愈伤组织形成和植株再生 细胞分裂与细胞壁再生 愈伤组织形成 愈伤组织分化 植株再生 第四节、影响原生质体培养的主要因素 一、基因型 较早的试验曾证明矮牵牛叶肉原生质体的不同生长发育时期是受不同基因所控制的。 通过番茄与秘鲁番茄有性杂交后对性状分离的遗传分析，证明其愈伤组织的再生能力是 2 个显性基因所决定的(Koornneef M et al.,1987).。Cheng 和 Veilleux(1991)对芙薯(S. Phureja)原生质体的培养能力也做过遗传分析，并证明从原生质体培养到形成愈伤组织是 受 2 个独立位点的显性基因所控制(Cheng et al., 1991)。 Dudits 等（1991）用苜宿(Medicago sativa)不同基因型做了较深入的研究，认为有某个基 因型在离体培养时难以形成细胞胚。但是，如果将对激素调节有作用的发根农杆菌的 rolB 和 rolC 基因引入并表达，就可能促使其体细胞胚形成。 二、原生质体的来源 供体材料体类型 供体细胞的分化程度 供体细胞的生长同步性 三、起始培养密度与培养基 基本起始密度 培养基激素水平 密度与培养基营养成分完全性 四、原生质体培养中的一些生理问题 1．逆境反应 细胞壁降解酶是一种逆境诱导剂，因此可以产生活化氧引起脂类过氧化，减少细胞流度 同时伴随着细胞膜的渗漏(Ishii H.,1988)。 细胞的逆境反应一般是快速地产生涉及诱发不同代谢途径（例如苯基丙烷途径 phenylpropanoid route）的酶系统，结果形成了植物抗毒素(phyto-alexins)和如木质素一类的结 构多聚物
华中农业大学创建国家精品课程—细胞工程学文本教案(第六章) 主讲教师:柳俊博士、教授 有些逆境反应对原生质体制备和培养是不利的,例如在甜菜原生质体制备时由于某些酶 的活性增强使得形成类脂过氧化物( (lipid peroxides),结果引起原生质膜的氧化损伤。而 对马铃薯原生质体活力的损伤乃是由于乙烯产生所致( Perl aet al,191)。 2.修复机理 原生质体分离时会丢失一些不同的细胞结构。使原生质体中细胞骨架的组分、结构、方 向发生变化,最常见的是引起细胞极性的改变( Simmond h,1991),同时也会干扰质膜 的蛋白质系统。 原生质体修复其质膜及其中的蛋白质组分的能力,细胞壁再生的能力及细胞骨架的修复 修复和调整能力都对它们能否进一步发育有很大影响。 3.细胞脱分化与细胞分裂 ●分离的原生质体原来的细胞状态常常会影响脱分化的进行 细胞在培养初期的一些变化,如液泡消失、细胞体积增加、细胞质变浓,核蛋白体增加 等,与此同时DNA开始复制,随后染色质变浓,原生质体脱分化成为类似分生组织状 态的细胞。 原生质体培养初期的细胞分裂至少涉及到以下多个因子:细胞壁的再生、细胞骨架的修 复与调整、原生质体分离时细胞所处的周期(G2期细胞具有较高的分裂频率)。另 外,细胞壁的再生与DNA的合成协调与否也会影响细胞分裂。 五、原生质体研究的趋势 低密度和单个原生质体培养; 原生质体衍生系统如微小原生质体、胞质体、核质体的利用 单倍配子体如花粉原生质体培养; 计算机控制系统、流式细胞光度计等技术的应用。 思考题 1.原生质体、亚原生质体、微小原生质体和原生质球的概念 2.为什么原生质体要培养在等渗培养基中? 3.影响原生质体培养的主要因素 4.原生质体的培养方法有哪些?各有何优缺点。 5.性细胞原生质体的种类、分化途径及应用领域。 6.为什么说原生质体培养系统是现代生物技术的载体?
华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 文本教案(第六章) 主讲教师：柳俊博士、教授 有些逆境反应对原生质体制备和培养是不利的，例如在甜菜原生质体制备时由于某些酶 的活性增强使得形成类脂过氧化物(lipid peroxides)，结果引起原生质膜的氧化损伤。而 对马铃薯原生质体活力的损伤乃是由于乙烯产生所致(Perl Aet al.,1991)。 2．修复机理 原生质体分离时会丢失一些不同的细胞结构。使原生质体中细胞骨架的组分、结构、方 向发生变化，最常见的是引起细胞极性的改变(Simmond D H., 1991)，同时也会干扰质膜 的蛋白质系统。 原生质体修复其质膜及其中的蛋白质组分的能力，细胞壁再生的能力及细胞骨架的修复 修复和调整能力都对它们能否进一步发育有很大影响。 3．细胞脱分化与细胞分裂 分离的原生质体原来的细胞状态常常会影响脱分化的进行。 细胞在培养初期的一些变化，如液泡消失、细胞体积增加、细胞质变浓，核蛋白体增加 等，与此同时 DNA 开始复制，随后染色质变浓，原生质体脱分化成为类似分生组织状 态的细胞。 原生质体培养初期的细胞分裂至少涉及到以下多个因子：细胞壁的再生、细胞骨架的修 复与调整、原生质体分离时细胞所处的周期（G2 期细胞具有较高的分裂频率）。另 外，细胞壁的再生与 DNA 的合成协调与否也会影响细胞分裂。 五、原生质体研究的趋势 低密度和单个原生质体培养； 原生质体衍生系统如微小原生质体、胞质体、核质体的利 用； 单倍配子体如花粉原生质体培养； 计算机控制系统、流式细胞光度计等技术的应用。 思考题 1．原生质体、亚原生质体、微小原生质体和原生质球的概念。 2．为什么原生质体要培养在等渗培养基中？ 3．影响原生质体培养的主要因素。 4．原生质体的培养方法有哪些？各有何优缺点。 5．性细胞原生质体的种类、分化途径及应用领域。 6．为什么说原生质体培养系统是现代生物技术的载体？
