华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 文本教案(第五章) 主讲教师:柳俊博士、教授 第5章植物细胞培养与次生产物生产 (5学时) 教学目的与要求 深入了解植物细胞在离体条件下的生长特性,掌握植物细胞悬浮系的建立以及种细胞的 筛选方法 第一节、悬浮培养( suspension culture) Plants Cell suspension Artificial seeds Isolation protoplasts Mutation select Secondary products 悬浮培养 悬浮培养是指将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基中进行培养增殖的技术 1.起始培养物的建立 选择适宜的外植体:幼胚、胚轴、子叶是最常使用的外植体 选择适宜的培养基:较高浓度激素浓度;必要的附加物质。 愈伤组织的要求:松散性好、增殖快、再生能力强 2.悬浮系的建立 3.悬浮细胞的生长与增殖 悬浮培养与固体培养比较有三个优点:一是增加培养细胞与培养液的接触面,改善营养 供应;二是在振荡条件下可避免细胞代谢产生的有害物质在局部积累而对细胞自身产生毒 害;三是振荡培养可以适当改善气体的交换
华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 文本教案(第五章) 主讲教师：柳俊博士、教授 第5章 植物细胞培养与次生产物生产 （5 学时） 教学目的与要求： 深入了解植物细胞在离体条件下的生长特性，掌握植物细胞悬浮系的建立以及种细胞的 筛选方法。 第一节、悬浮培养(suspension culture) 一、悬浮培养 悬浮培养是指将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基中进行培养增殖的技术。 1．起始培养物的建立 选择适宜的外植体：幼胚、胚轴、子叶是最常使用的外植体。 选择适宜的培养基：较高浓度激素浓度；必要的附加物质。 愈伤组织的要求：松散性好、增殖快、再生能力强 2．悬浮系的建立 3．悬浮细胞的生长与增殖 悬浮培养与固体培养比较有三个优点：一是增加培养细胞与培养液的接触面，改善营养 供应；二是在振荡条件下可避免细胞代谢产生的有害物质在局部积累而对细胞自身产生毒 害；三是振荡培养可以适当改善气体的交换。 Cell suspension Secondary products Isolation protoplasts Mutation select Plants Artificial seeds
华中农业大学创建国家精品课程—细胞工程学文本教案(第五章) 主讲教师:柳俊博士、教授 ↓s: uigur Hros"s5’♀ L:1051 curreri vl ie. J+γs 影响悬浮细胞生长的因素 起始愈伤组织的质量 接种细胞密度 培养条件:方式、温度、 继代周期 个成功的悬浮细胞培养体系必须满足三个条件 ●悬浮培养物分散性良好,细胞团较小,一般在30~50个细胞以下,在实际培养中 很少有完全由单细胞组成的植物细胞悬浮系。 ●均一性好,细胞形状和细胞团大小大致相同。悬浮系外观为大小均一的小颗粒 培养基清澈透亮,细胞色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色。 ●细胞生长迅速,悬浮细胞的生长量一般2~3天甚至更短时间便可增加一倍。 第三节、植物细胞大规模培养与次生代谢产物生产 概述 植物次生代谢产物是指植物中一大类并非植物生长发育所必需的小分子有机化和物,其 产生和分布通常有种属、器官组织和生长发育期的特异性。次生产物在植物中的合成与分解 过程称为次生代谢。 1.植物产生代谢产物的类型 植物次生产物种类繁多(据保守估计已超过2万种),根据分子结构不同大致分为 酚类化合物一黄酮类 单酚类 醌类(苯醌、萘醌、蒽醌)
华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 文本教案(第五章) 主讲教师：柳俊博士、教授 影响悬浮细胞生长的因素： 起始愈伤组织的质量 接种细胞密度 培养条件：方式、温度、 继代周期 一个成功的悬浮细胞培养体系必须满足三个条件： 悬浮培养物分散性良好，细胞团较小，一般在 30～50 个细胞以下，在实际培养中 很少有完全由单细胞组成的植物细胞悬浮系。 均一性好，细胞形状和细胞团大小大致相同。悬浮系外观为大小均一的小颗粒， 培养基清澈透亮，细胞色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色。 细胞生长迅速，悬浮细胞的生长量一般 2～3 天甚至更短时间便可增加一倍。 第三节、植物细胞大规模培养与次生代谢产物生产 一、概述 植物次生代谢产物是指植物中一大类并非植物生长发育所必需的小分子有机化和物，其 产生和分布通常有种属、器官组织和生长发育期的特异性。次生产物在植物中的合成与分解 过程称为次生代谢。 1． 植物产生代谢产物的类型 植物次生产物种类繁多（据保守估计已超过 2 万种），根据分子结构不同大致分为： 酚类化合物－黄酮类 单酚类 醌 类（苯醌、萘醌、蒽醌）
华中农业大学创建国家精品课程—细胞工程学文本教案(第五章) 主讲教师:柳俊博士、教授 萜类化合物一三萜皂甙 甾体皂甙 单萜、倍半萜、二萜 含氮化合物一生物碱(真生物碱、伪生物碱、原生物碱) 胺类(伯、仲、叔、季胺) 非蛋白质氨基酸 生氰甙 多炔类、有机酸等 2.植物次生代谢产物在医药、食品、轻化工业等领域具有重要意义 李时珍(1593)在《本草纲目》中所开列的1892种药物绝大多数是植物药物,目前仍 有约25%的法定药品来自植物。其药物的有效成分均为次生产物。 许多植物次生代谢产物是优良的食品添加剂和名贵化妆品原料。有些是生物毒素的主 要来源,可以用于杀虫、杀菌,而对环境和人畜无害,是理想的环保产品。 3.规模化细胞培养是生产植物次生产物的理想途径 保护生态环境 提高生产效率 发展新型生物技术产业 来自于植物体和细胞培养的紫草宁含量比较 生产方式 生产周期 紫草宁含量(%千重) 完整植株 2~3年 植物细胞培养 3周 14 Examples of enhancement in natural product yield in selected cell lines compare with parent plant material. (After Fowler, 1983) Chemical plant Cell vield Whole plant Ratio cell yield product ( DW) yield ( DW) whole plant Glutathione tabacum Nicotine tabacum Anthraquinones M.citrifolia180 22 Rosmarinic acid blumei 27.0 3.0 amalie SErpentine C. roseus Diosgenin D deltoidea 3.5 2.0 植物次生代谢产品的市场潜能 产品成分 用途 年销售额(亿美元) 长春花碱 治疗白血病 18~20(美国) 阿吗灵 循环系统障碍药 5~25(全世界)
华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 文本教案(第五章) 主讲教师：柳俊博士、教授 萜类化合物－三萜皂甙 甾体皂甙 单萜、倍半萜、二萜 含氮化合物－生物碱（真生物碱、伪生物碱、原生物碱） 胺类（伯、仲、叔、季胺） 非蛋白质氨基酸 生氰甙 多炔类、有机酸等 2．植物次生代谢产物在医药、食品、轻化工业等领域具有重要意义。 李时珍（1593）在《本草纲目》中所开列的 1892 种药物绝大多数是植物药物，目前仍 有约 25％的法定药品来自植物。其药物的有效成分均为次生产物。 许多植物次生代谢产物是优良的食品添加剂和名贵化妆品原料。有些是生物毒素的主 要来源，可以用于杀虫、杀菌，而对环境和人畜无害，是理想的环保产品。 3．规模化细胞培养是生产植物次生产物的理想途径 保护生态环境 提高生产效率 发展新型生物技术产业 来自于植物体和细胞培养的紫草宁含量比较 生产方式 生产周期 紫草宁含量（％干重） 完整植株 2～3 年 1～2 植物细胞培养 3 周 14 Examples of enhancement in natural product yield in selected cell lines compare with parent plant material. (After Fowler, 1983) Chemical product plant Cell yield (% DW) Whole plant yield (% DW) Ratio cell yield / whole plant Glutathione N. tabacum 1.0 0.1 10 Nicotine N. tabacum 5.0 2.1 2 Anthraquinones M.citrifolia 18.0 2.2 8 Rosmarinic acid C. blumei 27.0 3.0 9 Ajmalicine C.roseus 2.2 0.3 7 SErpentine C. roseus 1.8 0.5 3 Diosgenin D.deltoidea 3.5 2.0 2 植物次生代谢产品的市场潜能 产品成分 用途 年销售额（亿美元） 长春花碱 治疗白血病 18～20（美国） 阿吗灵 循环系统障碍药 5～25（全世界）
华中农业大学创建国家精品课程—细胞工程学文本教案(第五章) 主讲教师:柳俊博士、教授 奎宁 治疗疟疾 5~10(美国) 致热素 杀虫剂 20(全世界) 毛地黄 心脏病药 20~55(美国) Stages in the development and operation of a plant cell biotechnology process Upsteam Development Production phase Downstream Processing Single stage Biomass nd/o Two-stage medium Callus Bioactor Or Suspension‘eed Product Culture stablished Product purification Immobi lized reactor system 植物细胞大规模培养的技术要求: 从工程的角度讲必须要进一步研究和开发适宜于植物细胞生长和生产的生物反应器,建 立最佳的控制和调节系统 从培养技术方面讲必须满足以下三个条件:培养的细胞在遗传上应是稳定的,以得到产 量恒定的产物;细胞生长及生物合成的速度快,在较短的时间内能得到较高产量的终产物; 代谢产物要在细胞中积累而不被迅速分解,最好能将其释放到培养基中 培养系统
华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 文本教案(第五章) 主讲教师：柳俊博士、教授 奎宁 治疗疟疾 5～10（美国） 致热素 杀虫剂 20（全世界） 毛地黄 心脏病药 20～55（美国） Stages in the development and operation of a plant cell biotechnology process 植物细胞大规模培养的技术要求： 从工程的角度讲必须要进一步研究和开发适宜于植物细胞生长和生产的生物反应器，建 立最佳的控制和调节系统； 从培养技术方面讲必须满足以下三个条件：培养的细胞在遗传上应是稳定的，以得到产 量恒定的产物；细胞生长及生物合成的速度快，在较短的时间内能得到较高产量的终产物； 代谢产物要在细胞中积累而不被迅速分解，最好能将其释放到培养基中。 二、培养系统 Source Plant Single stage Upsteam Development Production Phase Downstream Processing Biomass and/or medium Product extraction Product purification Two-stage Immobilized reactor system Callus Or Suspension Culture established Bioactor For ‘seed’ culture
华中农业大学创建国家精品课程 胞工程学 文本教案(第五章) 主讲教师:柳俊博士、教授 1、悬浮培养系统 液体悬浮培养系统基本原理与上述实验室悬浮培养方法一致,但大规模培养所采用的设 备及控制技术比实验室小规模培养要复杂的多 ●机械搅拌式培养系统 机械搅拌式生物反应器通常是在微生物发酵罐的基础上改进设计的,根据植物细胞的特 性,其设备要求在微生物发酵罐的基础上作如下改进:搅拌装置要减少剪切,一般改叶轮式 为螺旋式;因为植物细胞生长周期长,需要随时补充水分和营养,因此必须设计加液装置; 由于植物细胞的生理活动需要新鲜空气,且细胞代谢也可能产生有害气体,所以必须设计通 气装置;为便于取样观察,一般还设计有取样口 ●气压搅拌式培养系统 考虑到机械搅拌式反应器的剪切作用难以避免,同时搅拌器转动的中轴往往是容易使培 养物污染的部位,因此,发展出空气提升式生物反应器,但其缺点是搅拌不均匀。 ●旋转式培养系统 般用于产品中试或某些必需裂解细胞才能获得目的产物的培养,其优点是控制精确, 处理灵活,缺点是培养体积较小 2、固定化培养系统 这一技术的优点在于 可以较容易地控制培养系统的理化环境,从而可以研究特定的代谢途径,并便于调节 细胞位置的固定使其所处的环境类似于在植物体中所处的状态,相互间接触密切,可以 形成一定的理化梯度,有利于次生产物的合成; 由于细胞固定在支持物上,培养基可以不断更换,可以从培养基中提取产物,免除了培 养基中因含有过多的初生产物对细胞代谢的反馈抑制,也由于细胞留在反应器中,新的 培养基可以再次利用这些细胞生产初生产物,从而节省了生产细胞所付出的时间和费 用 正是由于细胞固定在一定的介质中,并可以从培养基中不断提取产物,因此,它可以进 行连续生产。 细胞固定化培养技术按照其支持物不同可以分为两大类: 包埋式固定化培养系统:支持物多采用琼脂、琼脂糖、藻酸盐、聚丙烯酰胺等; 附着式固定化培养系统:支持物采用尼龙网、聚氨酯泡沫、中空纤维等材料 、植物细胞规模培养技术要点 1、细胞系的建立和选择 2、优良细胞系的增殖培养 3、大规模培养体系的建立 培养方式的选择: ●间歇培养一流加间歇培养
华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 文本教案(第五章) 主讲教师：柳俊博士、教授 1、悬浮培养系统 液体悬浮培养系统基本原理与上述实验室悬浮培养方法一致，但大规模培养所采用的设 备及控制技术比实验室小规模培养要复杂的多。 机械搅拌式培养系统 机械搅拌式生物反应器通常是在微生物发酵罐的基础上改进设计的，根据植物细胞的特 性，其设备要求在微生物发酵罐的基础上作如下改进：搅拌装置要减少剪切，一般改叶轮式 为螺旋式；因为植物细胞生长周期长，需要随时补充水分和营养，因此必须设计加液装置； 由于植物细胞的生理活动需要新鲜空气，且细胞代谢也可能产生有害气体，所以必须设计通 气装置； 为便于取样观察，一般还设计有取样口。 气压搅拌式培养系统 考虑到机械搅拌式反应器的剪切作用难以避免，同时搅拌器转动的中轴往往是容易使培 养物污染的部位，因此，发展出空气提升式生物反应器，但其缺点是搅拌不均匀。 旋转式培养系统 一般用于产品中试或某些必需裂解细胞才能获得目的产物的培养，其优点是控制精确， 处理灵活，缺点是培养体积较小。 2、固定化培养系统 这一技术的优点在于： 可以较容易地控制培养系统的理化环境，从而可以研究特定的代谢途径，并便于调节； 细胞位置的固定使其所处的环境类似于在植物体中所处的状态，相互间接触密切，可以 形成一定的理化梯度，有利于次生产物的合成； 由于细胞固定在支持物上，培养基可以不断更换，可以从培养基中提取产物，免除了培 养基中因含有过多的初生产物对细胞代谢的反馈抑制，也由于细胞留在反应器中，新的 培养基可以再次利用这些细胞生产初生产物，从而节省了生产细胞所付出的时间和费 用； 正是由于细胞固定在一定的介质中，并可以从培养基中不断提取产物，因此，它可以进 行连续生产。 细胞固定化培养技术按照其支持物不同可以分为两大类： 包埋式固定化培养系统：支持物多采用琼脂、琼脂糖、藻酸盐、聚丙烯酰胺等； 附着式固定化培养系统：支持物采用尼龙网、聚氨酯泡沫、中空纤维等材料。 三、植物细胞规模培养技术要点 1、细胞系的建立和选择 2、优良细胞系的增殖培养 3、大规模培养体系的建立 培养方式的选择： 间歇培养－流加间歇培养
华中农业大学创建国家精品课程—细胞工程学文本教案(第五章) 主讲教师:柳俊博士、教授 两级或多级间歇培养 ●连续培养一单级连续培养 多级连续培养 回流式连续培养 固定化细胞培养 四、影响植物细胞培养及次生产物合成的因素 1.植物细胞生长与产物合成的关系 生长偶联型产物合成与细胞生长成正比 中间型产物仅在细胞生长下降时合成,细胞处于指数生长期或停止生长产物都 不合成。 ●非生长偶联型产物合成在细胞生长停止以后。 2.影响因素 内因细胞的遗传特性 母细胞外植体的生理状态 外因温度 营养状况 通气状况 生长调节因子:激素、前体物质 第三节、单细胞培养技术 细胞平板培养 主要技术要点是 单细胞的分离 单细胞悬浮液的制备; 植板 ●植板率评估:这是平板培养中常用的一个术语,用来反应植板效率的高低。它以能 长出细胞团的单细胞在接种单细胞中所占的比例来表示。 植板率(%)=(形成的细胞团数接种的细胞数)×100% 看护培养 B D
华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 文本教案(第五章) 主讲教师：柳俊博士、教授 两级或多级间歇培养 连续培养－单级连续培养 多级连续培养 回流式连续培养 固定化细胞培养 四、影响植物细胞培养及次生产物合成的因素 1．植物细胞生长与产物合成的关系 生长偶联型 产物合成与细胞生长成正比。 中间型 产物仅在细胞生长下降时合成，细胞处于指数生长期或停止生长产物都 不合成。 非生长偶联型 产物合成在细胞生长停止以后。 2．影响因素 内因 细胞的遗传特性 母细胞外植体的生理状态 外因 温度 pH 营养状况 通气状况 生长调节因子：激素、前体物质 第三节、单细胞培养技术 一、细胞平板培养 主要技术要点是： 单细胞的分离； 单细胞悬浮液的制备； 植板 植板率评估：这是平板培养中常用的一个术语，用来反应植板效率的高低。它以能 长出细胞团的单细胞在接种单细胞中所占的比例来表示。 植板率(％)＝(形成的细胞团数/接种的细胞数)×100％ 二、看护培养
华中农业大学创建国家精品课程—细胞工程学文本教案(第五章) 主讲教师:柳俊博士、教授 、微室培养 大E一b亡 tINeS 思考题 1.一个好的悬浮细胞系有哪些特征?用于建立悬浮细胞系的愈伤组织有何要求? 2.建立悬浮细胞系的关键技术有哪些? 3.悬浮细胞系在继代培养中其群体生长规律。 4.细胞大规模培养有哪些培养系统? 5.植物细胞规模培养与次生产物生产前景及需要硏究解决的问题
华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 文本教案(第五章) 主讲教师：柳俊博士、教授 三、微室培养 思考题 1．一个好的悬浮细胞系有哪些特征？用于建立悬浮细胞系的愈伤组织有何要求？ 2．建立悬浮细胞系的关键技术有哪些？ 3．悬浮细胞系在继代培养中其群体生长规律。 4．细胞大规模培养有哪些培养系统？ 5．植物细胞规模培养与次生产物生产前景及需要研究解决的问题
