华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程 004-7 细胞工程文本教案 教学目的与要求 细胞工程是现代生物技术的重要组成部分,同时也是现代生物学研究的重要技术工 具。要求学生通过本课程的学习掌握生物组织、器官及其细胞离体培养的原理与技术,为 从事生物学领域的相关研究及其与细胞工程有关的生物技术产业奠定良好的理论和技术 基础。 理论知识方面,重点掌握本学科的基本原理和基本技术即:细胞全能性学说在细胞 工程中的指导作用;培养条件下的细胞分化和器官发生的调控;离体培养条件下的遗传 与变异特点。掌握不同组织、器官的培养特点和控制方法。了解细胞工程的各类技术在现 代生物学与生物技术领域的应用途径与发展潜力。 实践技能方面,重点掌握细胞工程的基本操作技术一无菌操作;掌握外植体选择 愈伤组织和胚状体诱导、器官发生调控等基本技术;了解细胞大批量培养方法,原生质 体分离与体细胞杂交技术 课程学时及其分配 课程总学时60,其中课堂教授40学时,实验20学时 课堂讲授内容及学时分配表 章节 内容 学时 绪论 第一章实验室设置及技术原理 第二章细胞全能性与形态发生 第三章离体培养下的遗传与变异 第四章植物组织和器官培养 第五章植物细胞培养及次生代谢产物生产 第六章原生质体培养 第七章植物体细胞杂交 第八章人工种子 22645544224 第九章植物种质资源离体超低温保存 第十章动物细胞工程概述
华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 2004-7 主讲教师：柳俊博士、教授 细胞工程文本教案 教学目的与要求： 细胞工程是现代生物技术的重要组成部分，同时也是现代生物学研究的重要技术工 具。要求学生通过本课程的学习掌握生物组织、器官及其细胞离体培养的原理与技术，为 从事生物学领域的相关研究及其与细胞工程有关的生物技术产业奠定良好的理论和技术 基础。 理论知识方面，重点掌握本学科的基本原理和基本技术即：细胞全能性学说在细胞 工程中的指导作用；培养条件下的细胞分化和器官发生的调控；离体培养条件下的遗传 与变异特点。掌握不同组织、器官的培养特点和控制方法。了解细胞工程的各类技术在现 代生物学与生物技术领域的应用途径与发展潜力。 实践技能方面，重点掌握细胞工程的基本操作技术—无菌操作；掌握外植体选择、 愈伤组织和胚状体诱导、器官发生调控等基本技术；了解细胞大批量培养方法，原生质 体分离与体细胞杂交技术。 课程学时及其分配： 课程总学时 60，其中课堂教授 40 学时，实验 20 学时。 课堂讲授内容及学时分配表 章节 内 容 学时 绪论 2 第一章 实验室设置及技术原理 2 第二章 细胞全能性与形态发生 6 第三章 离体培养下的遗传与变异 4 第四章 植物组织和器官培养 5 第五章 植物细胞培养及次生代谢产物生产 5 第六章 原生质体培养 4 第七章 植物体细胞杂交 4 第八章 人工种子 2 第九章 植物种质资源离体超低温保存 2 第十章 动物细胞工程概述 4 1
华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程 004-7 绪论(2学时) 教学目的与要求 全面了解细胞工程与现代生物技术的关系;了解细胞工程的发展与相关学科的联系 了解细胞工程在现代世界经济中的潜力。 第一节细胞工程在生物技术领域中的地位 生物技术概述 生物技术是以生物科学为基础,利用生物个体或生物器官、组织、细胞的特性和功 能,设计构建具有预期性状的新物种或新品系(包括细胞系),以及与工程原理相结 合进行产品加工生产的综合性技术体系。 生物技术的内涵主要是 运用现代生物学理论与科学技术改造细胞的遗传物质,培育出人们需要的生物新品 种; 工业规模地利用现有生物体系,制备生物产品 模拟生物体系,以生物化学工程代替化学工程,制备工业产品 发展相应的科学理论与工程技术。 主要技术范畴包括:基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程以及生化工程。 现代生物技术特征:多学科性;商业性;规模化。 细胞工程的概念及研究范畴 细胞工程( cell engineering)是应用细胞生物学和分子生物学方法,借助工程学的 试验方法或技术,在细胞水平上研究改造生物遗传特性和生物学特性,以获得特定的细 胞、细胞产品或新生物体的有关理论和技术方法的学科 广义的细胞工程包括所有的生物组织、器官及细胞离体操作和培养技术,狭义的细 胞工程则是指细胞融合和细胞培养技术。 根据研究对象不同,细胞工程可分为动物细胞工程和植物细胞工程
华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 2004-7 主讲教师：柳俊博士、教授 绪 论（2 学时） 教学目的与要求 全面了解细胞工程与现代生物技术的关系；了解细胞工程的发展与相关学科的联系； 了解细胞工程在现代世界经济中的潜力。 第一节 细胞工程在生物技术领域中的地位 一、生物技术概述 生物技术是以生物科学为基础，利用生物个体或生物器官、组织、细胞的特性和功 能，设计构建具有预期性状的新物种或新品系（包括细胞系），以及与工程原理相结 合进行产品加工生产的综合性技术体系。 生物技术的内涵主要是： 运用现代生物学理论与科学技术改造细胞的遗传物质，培育出人们需要的生物新品 种； 工业规模地利用现有生物体系，制备生物产品； 模拟生物体系，以生物化学工程代替化学工程，制备工业产品； 发展相应的科学理论与工程技术。 主要技术范畴包括：基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程以及生化工程。 现代生物技术特征：多学科性；商业性；规模化。 二、细胞工程的概念及研究范畴 细胞工程（cell engineering）是应用细胞生物学和分子生物学方法，借助工程学的 试验方法或技术，在细胞水平上研究改造生物遗传特性和生物学特性，以获得特定的细 胞、细胞产品或新生物体的有关理论和技术方法的学科。 广义的细胞工程包括所有的生物组织、器官及细胞离体操作和培养技术，狭义的细 胞工程则是指细胞融合和细胞培养技术。 根据研究对象不同，细胞工程可分为动物细胞工程和植物细胞工程。 2
华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程 004-7 动物细胞工程包括:细胞培养技术(包括组织培养、器官培养);细胞融合技术; 胚胎工程技术(核移植、胚胎分割等);克隆技术(单细胞系克隆、器官克隆、个体克 隆 植物细胞工程包括:植物组织、器官培养技术;细胞培养技术;原生质体融合与培 养技术;亚细胞水平的操作技术等。 、细胞工程与其它相关学科的关系 细胞工程学科的建立依赖于相关学科理论的发展 2.为生物学研究提供新的实验体系 细胞工程必须与其它生物技术相结合才能更好地发挥作用 四、细胞工程在现代生物技术中的地位及其实践意义 1.改善农业生产技术 2.保护自然资源,维护生态平衡 生物医药开发 第二节动物物细胞工程的发展 融合现象的发现 19世纪30年代, Muller, Schwann, Virchow等相继在肺结核、天花、水痘、麻疹等病理 组织中观察到多核细胞现象,但当时并没有引起人们的关注,认为这只是一种特殊现象。 1849年 Lobing在骨髓中也发现了多核现象的存在,1855年~1858年,科学家们在 肺组织和各种正常组织及发尖和坏死部位都发现了多核细胞。至此,自然界中广泛存在 着多核细胞的事实,才被生命科学工作者接受。 1859年,A. Barli在研究黏虫的生活史时发现,某些黏虫存在着由单个细胞核融合 形成多核的原生质团的情况。据此,他认为多核细胞是由单个细胞彼此融合而形成的 二.动物组织细胞培养技术的建立 1907年,美国胚胎学家R. Harrison将蛙的胚神经管区的一片组织移植到蛙的淋巴液 凝块中,这片组织在体外不但存活了若干星期,而且还从细胞中长出了轴突(神经纤维) 细胞,解决了当时关于轴突起源的争论,并表明了利用体外存活的组织进行实验研究的 可能性。他所采用的把培养物放在盖玻片上并置于凹玻片腔中培养的方法还一直沿用至
华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 2004-7 主讲教师：柳俊博士、教授 动物细胞工程包括：细胞培养技术（包括组织培养、器官培养）；细胞融合技术； 胚胎工程技术 （核移植、胚胎分割等）；克隆技术（单细胞系克隆、器官克隆、个体克 隆）。 植物细胞工程包括：植物组织、器官培养技术；细胞培养技术；原生质体融合与培 养技术；亚细胞水平的操作技术等。 三、细胞工程与其它相关学科的关系 1．细胞工程学科的建立依赖于相关学科理论的发展 2．为生物学研究提供新的实验体系 3．细胞工程必须与其它生物技术相结合才能更好地发挥作用 四、细胞工程在现代生物技术中的地位及其实践意义 1．改善农业生产技术 2．保护自然资源，维护生态平衡 3．生物医药开发 第二节 动物物细胞工程的发展 一．融合现象的发现 19 世纪 30 年代，Muller, Schwann, Virchow 等相继在肺结核、天花、水痘、麻疹等病理 组织中观察到多核细胞现象，但当时并没有引起人们的关注，认为这只是一种特殊现象。 1849 年 Lobing 在骨髓中也发现了多核现象的存在，1855 年～1858 年，科学家们在 肺组织和各种正常组织及发尖和坏死部位都发现了多核细胞。至此，自然界中广泛存在 着多核细胞的事实，才被生命科学工作者接受。 1859 年，A. Barli 在研究黏虫的生活史时发现，某些黏虫存在着由单个细胞核融合 形成多核的原生质团的情况。据此，他认为多核细胞是由单个细胞彼此融合而形成的。 二. 动物组织细胞培养技术的建立 1907 年，美国胚胎学家 R. Harrison 将蛙的胚神经管区的一片组织移植到蛙的淋巴液 凝块中，这片组织在体外不但存活了若干星期，而且还从细胞中长出了轴突(神经纤维) 细胞，解决了当时关于轴突起源的争论，并表明了利用体外存活的组织进行实验研究的 可能性。他所采用的把培养物放在盖玻片上并置于凹玻片腔中培养的方法还一直沿用至 3
华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程 004-7 Carrel(1911)发现了鸡胚浸出液对于某些细胞的生长具有很强的促进效应,还把无 菌技术引到了组织培养技术中。作为他的技术标志是,他在不含抗菌素的培养条件下使 鸡胚心脏细胞维持生存了34年,先后继代3400次,证明动物细胞有可能在体外无限地 生长。 1914年, Thomson创立了另一条完全不同的体外组织培养途径一器官培养法,以后 又被 Strangeways和Fe|所发展。 1940年, Earle建立了可以无限传代的一个CH小鼠的结缔组织细胞系一L系。二是 1951年,Gay建立了第一个人体细胞系一人体宫颈癌Hla细胞系 三.细胞融合技术的建立和杂交瘤技术的诞生 1958年, Okada发现紫外灭活的仙台病毒可引起艾氏腹水瘤细胞彼此融合。由于仙台 病毒能稳定地诱发细胞融合而引起了许多科学家的兴趣,60年代, Harris(1965)诱导不 同的动物体细胞融合获得成功并能存活下来。 Lifflefield(1964)根据亲本细胞的酶缺陷型, 利用HAT选择性培养基能使亲本细胞死亡而只留下异型融合细胞,并能不断地增殖, 从此形成了细胞融合到杂种细胞选择、培养的一整套技术。使这一技术在此后广泛地应用 于遗传学、病毒学、免疫学、细胞学等多种学科的研究工作中 1975年,免疫学家 Kohler和 Milstein利用仙台病毒诱导绵羊红细胞免疫的小鼠脾细 胞与小鼠骨髓瘤细胞融合,选择到能分泌单一抗体的杂种细胞。该杂种细胞具有在小鼠 体内和体外培养条件下大量繁殖的能力,并能长期地分泌单克隆抗体,从而建立了小鼠 淋巴细胞杂交瘤技术。这一技术的诞生把细胞融合技术从实验阶段推向了应用研究阶段 促进了动物细胞工程的蓬勃发展 四.动物克隆技术的建立 l891, Heape等人首次报道了家兔胚胎移植成功的结果,他们把安哥拉家兔胚胎移 植给比利时兔,得到了4只安哥拉家兔 本世纪30年代以后,先后在羊、猪、牛等动物的胚胎移植上获得成功。经过几十年的 不断完善和充实,已成为一项比较成熟的繁殖生物学技术。 首例克隆动物成功的报道是在1962年,英国学者 Grudon把非洲爪蟾小肠上皮细胞 的核注入同种或异种非洲爪蟾未受精卵(经紫外线照射杀死卵细胞核)中,约有1%的重 组卵发育成为成熟蛙 这一成功开创了由体细胞培育动物个体的新型实验途径,其贡献在于:实验证明了
华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 2004-7 主讲教师：柳俊博士、教授 今。 Carrel (1911)发现了鸡胚浸出液对于某些细胞的生长具有很强的促进效应，还把无 菌技术引到了组织培养技术中。作为他的技术标志是，他在不含抗菌素的培养条件下使 鸡胚心脏细胞维持生存了 34 年，先后继代 3400 次，证明动物细胞有可能在体外无限地 生长。 1914 年，Thomson 创立了另一条完全不同的体外组织培养途径－器官培养法，以后 又被 Strangeways 和 Fell 所发展。 1940 年，Earle 建立了可以无限传代的一个 C3H 小鼠的结缔组织细胞系－L 系。二是 1951 年，Gay 建立了第一个人体细胞系－人体宫颈癌 Hela 细胞系 三. 细胞融合技术的建立和杂交瘤技术的诞生 1958 年, Okada 发现紫外灭活的仙台病毒可引起艾氏腹水瘤细胞彼此融合。由于仙台 病毒能稳定地诱发细胞融合而引起了许多科学家的兴趣，60 年代，Harris(1965)诱导不 同的动物体细胞融合获得成功并能存活下来。Lifflefield(1964)根据亲本细胞的酶缺陷型， 利用 HAT 选择性培养基能使亲本细胞死亡而只留下异型融合细胞，并能不断地增殖， 从此形成了细胞融合到杂种细胞选择、培养的一整套技术。使这一技术在此后广泛地应用 于遗传学、病毒学、免疫学、细胞学等多种学科的研究工作中。 1975 年，免疫学家 Kohler 和 Milstein 利用仙台病毒诱导绵羊红细胞免疫的小鼠脾细 胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，选择到能分泌单一抗体的杂种细胞。该杂种细胞具有在小鼠 体内和体外培养条件下大量繁殖的能力，并能长期地分泌单克隆抗体，从而建立了小鼠 淋巴细胞杂交瘤技术。这一技术的诞生把细胞融合技术从实验阶段推向了应用研究阶段， 促进了动物细胞工程的蓬勃发展。 四. 动物克隆技术的建立 1891，Heape 等人首次报道了家兔胚胎移植成功的结果，他们把安哥拉家兔胚胎移 植给比利时兔，得到了 4 只安哥拉家兔。 本世纪 30 年代以后，先后在羊、猪、牛等动物的胚胎移植上获得成功。经过几十年的 不断完善和充实，已成为一项比较成熟的繁殖生物学技术。 首例克隆动物成功的报道是在 1962 年，英国学者 Grudon 把非洲爪蟾小肠上皮细胞 的核注入同种或异种非洲爪蟾未受精卵(经紫外线照射杀死卵细胞核)中，约有 1％的重 组卵发育成为成熟蛙。 这一成功开创了由体细胞培育动物个体的新型实验途径，其贡献在于：实验证明了 4
华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程 004-7 完全分化的肠细胞仍然具有未分化细胞的全部遗传信息,并能在一定的条件下发育成 动物个体,从而证明了动物细胞仍然具有全能性;初步建立了体细胞核移植的实验体 系,证明在体细胞核转至胚胎发育方向的早期,卵细胞质对体细胞核的发育功能起着 关键性的调节作用,其作用因子可能是细胞质中的mRMA与有关的蛋白质。 1997年2月,英国科学家 Wilmut等在世界权威杂志《 Nature》上首例报道了世界第 只克隆羊的诞生。它的贡献在于:实验证明了哺乳动物高度分化的细胞同样含有全套 遗传信息,亦能在一定条件下发育成动物个体,进一步证明了动物细胞的全能性 **多利诞生的技术路线 取6岁供体羊乳腺细胞一血清饥饿培养使细胞处于Go期 经GnRH处理取卵细胞一移去卵细胞的细胞核 将培养的乳腺细胞的核移植到去核的卵细胞中 重组细胞植入第一受体羊输卵管中培养至胚泡期(桑椹胚) 桑椹胚再移植入第二受体羊子宫内发育至分娩 第三节植物细胞工程的发展 植物细胞工程是一门以植物组织和细胞的离体操作为基础的实验性学科。它是以植 物组织细胞为基本单位,在离体条件下进行培养、繁殖或人为的精细操作,使细胞的某 些生物学特性按人们的意愿发生改变,从而改良品种或创造新物种,或加速繁殖植物个 体,或获得有用物质的过程统称为植物细胞工程。植物细胞工程是在植物组织培养的基 础上发展起来的,因此,植物细胞工程亦是广义概念上的植物组织培养。 探索阶段 在这一阶段中,细胞学说的产生和细胞全能性学说的提出为组织培养技术的产生奠 定了理论基础。在这些理论的指导下所开展的有关试验,对组织培养技术的建立进行了 有益的探索。 细胞学说( cell theory)是 Schleiden和 Chant分别于1838年和l839年提出的, 其核心内容是,细胞是有机体,亦是生物体的基本结构单位,由它构成整个生物个体 同时,植物细胞又是在生理和发育上具有潜在全能性的功能单位。随后,Schwωm在 1839年更明确的指出:“如果具有与有机体内一样的条件时,每个细胞应该可以独立 生活和发展”。这一论点已成为组织培养研究的思想基础 细胞全能性学说是德国著名植物学家G. Haberlandt在细胞学说的基础上于1902年提出 的。他认为,高等植物的组织、器官可以不断分割,直到单个细胞。如果每个细胞都有植 物个体一样的性质和能力,那么,可以通过植物细胞培养使单个细胞发育成为一个新个
华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 2004-7 主讲教师：柳俊博士、教授 完全分化的肠细胞仍然具有未分化细胞的全部遗传信息，并能在一定的条件下发育成 动物个体，从而证明了动物细胞仍然具有全能性；初步建立了体细胞核移植的实验体 系，证明在体细胞核转至胚胎发育方向的早期，卵细胞质对体细胞核的发育功能起着 关键性的调节作用，其作用因子可能是细胞质中的 mRNA 与有关的蛋白质。 1997 年 2 月，英国科学家 Wilmut 等在世界权威杂志《Nature》上首例报道了世界第 一只克隆羊的诞生。它的贡献在于：实验证明了哺乳动物高度分化的细胞同样含有全套 遗传信息，亦能在一定条件下发育成动物个体，进一步证明了动物细胞的全能性。 **多利诞生的技术路线： 取 6 岁供体羊乳腺细胞 — 血清饥饿培养使细胞处于 G0期 经 GnRH 处理取卵细胞 — 移去卵细胞的细胞核 将培养的乳腺细胞的核移植到去核的卵细胞中 重组细胞植入第一受体羊输卵管中培养至胚泡期(桑椹胚) 桑椹胚再移植入第二受体羊子宫内发育至分娩 第三节 植物细胞工程的发展 植物细胞工程是一门以植物组织和细胞的离体操作为基础的实验性学科。它是以植 物组织细胞为基本单位，在离体条件下进行培养、繁殖或人为的精细操作，使细胞的某 些生物学特性按人们的意愿发生改变，从而改良品种或创造新物种，或加速繁殖植物个 体，或获得有用物质的过程统称为植物细胞工程。植物细胞工程是在植物组织培养的基 础上发展起来的，因此，植物细胞工程亦是广义概念上的植物组织培养。 一．探索阶段 在这一阶段中，细胞学说的产生和细胞全能性学说的提出为组织培养技术的产生奠 定了理论基础。在这些理论的指导下所开展的有关试验，对组织培养技术的建立进行了 有益的探索。 细胞学说（cell theory）是 Schleiden 和 Schwann 分别于 1838 年和 1839 年提出的， 其核心内容是，细胞是有机体，亦是生物体的基本结构单位，由它构成整个生物个体。 同时，植物细胞又是在生理和发育上具有潜在全能性的功能单位。随后，Schwann 在 1839 年更明确的指出：“如果具有与有机体内一样的条件时，每个细胞应该可以独立 生活和发展”。这一论点已成为组织培养研究的思想基础。 细胞全能性学说是德国著名植物学家 G. Haberlandt 在细胞学说的基础上于 1902 年提出 的。他认为，高等植物的组织、器官可以不断分割，直到单个细胞。如果每个细胞都有植 物个体一样的性质和能力，那么，可以通过植物细胞培养使单个细胞发育成为一个新个 体。 5
华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程 004-7 培养技术建立阶段 作为一门技术,它必须具有一定的程序性。也就是说,它应该具有一定的技术模式。 在这一阶段,植物组织培养建立了两个与培养技术有关的重要模式,一是培养基模式, 二是激素调控模式。 应用研究阶段 其一,组织培养领域的研究迅速在世界各国的有关实验室广泛展开 其二,技术体系更加完善。这一阶段的技术体系包括:根据不同的培养目的外植体 的取材和灭菌方法,不同外植体及其培养产物的培养程序,适合于不同植物种类和外植 体类型的培养基等。 其三,形成了较为完整的理论体系。在植物组织培养硏究的基础上,植物细胞工程 现已形成了以细胞全能性为基本理论基础,以细胞脱分化和再分化调控为中心的理论体 系。 其四,研究目的性更加明确,并已广泛应用到生物科学研究的各个领域,以细胞工 程为基础的新型生物技术产业正在兴起 四.植物细胞工程应用 在植物育种上的应用 将常规植物育种技术与植物组织培养技术相结合,可以获得常规技术难以或无法获 得的种质材料,缩短育种周期,提高育种效率。 快速获得特殊倍性材料;克服远缘杂交不亲和;克服杂种胚早期夭折;导入外源基 因;突变体筛选;种质资源保存 种苗脱病毒与快速繁殖 细胞培养生产有用次生产物 在细胞生物学和发育生物学研究中的应用 在植物遗传、生理生化以及植物病理等基础研究中的应用 思考题 1.细胞工程的概念、研究范畴、在生命科学中与其它学科的关系。 2.动物细胞工程发展的主要标志性阶段 3.植物细胞工程技术的发展阶段与标志性成就。 4.植物细胞工程的作用与应用领域
华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 2004-7 主讲教师：柳俊博士、教授 二．培养技术建立阶段 作为一门技术，它必须具有一定的程序性。也就是说，它应该具有一定的技术模式。 在这一阶段，植物组织培养建立了两个与培养技术有关的重要模式，一是培养基模式， 二是激素调控模式。 三．应用研究阶段 其一，组织培养领域的研究迅速在世界各国的有关实验室广泛展开。 其二，技术体系更加完善。这一阶段的技术体系包括：根据不同的培养目的外植体 的取材和灭菌方法，不同外植体及其培养产物的培养程序，适合于不同植物种类和外植 体类型的培养基等。 其三，形成了较为完整的理论体系。在植物组织培养研究的基础上，植物细胞工程 现已形成了以细胞全能性为基本理论基础，以细胞脱分化和再分化调控为中心的理论体 系。 其四，研究目的性更加明确，并已广泛应用到生物科学研究的各个领域，以细胞工 程为基础的新型生物技术产业正在兴起。 四．植物细胞工程应用 在植物育种上的应用 将常规植物育种技术与植物组织培养技术相结合，可以获得常规技术难以或无法获 得的种质材料，缩短育种周期，提高育种效率。 快速获得特殊倍性材料；克服远缘杂交不亲和；克服杂种胚早期夭折；导入外源基 因；突变体筛选；种质资源保存 种苗脱病毒与快速繁殖 细胞培养生产有用次生产物 在细胞生物学和发育生物学研究中的应用 在植物遗传、生理生化以及植物病理等基础研究中的应用 思考题 1．细胞工程的概念、研究范畴、在生命科学中与其它学科的关系。 2．动物细胞工程发展的主要标志性阶段。 3．植物细胞工程技术的发展阶段与标志性成就。 4．植物细胞工程的作用与应用领域。 6
华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程 004-7 主讲教师:柳俊博士、教授 第一章实验室设置及一般技术(2学时) 教学目的与要求 了解细胞工程的通用技术,初步掌握细胞工程实验技术中的培养基配制、灭菌以及 无菌操作的原理与操作方法 第一节实验室设置 细胞工程实验室它必须满足三个基本的需要,即:实验准备,包括培养基配制,洗 涤与灭菌等:无菌操作;控制培养 实验室组成 1.基本实验室 准备室准备室的功能就是进行一切与实验有关的准备工作。要求宽敞明亮,通风 条件好。 接种室接种室的功能是进行无菌操作。要求封闭性好,干燥清洁,能较长时间保 持无菌。房间一般不宜过大,其规模根据实验需要而定。接种室除了出入口和通气口外 应行密闭。 培养室培养室的功能是对离体材料进行控制培养。其首要要求是要能控制光照和 温度,其次为防止微生物感染,培养室应保持干燥和清洁 2.辅助实验室 细胞学实验室其功能是对培养材料进行细胞学鉴定和研究。要求清洁、明亮、干燥, 使各种光学仪器不受潮湿和灰尘污染 摄影室及暗室其功能是进行培养材料的摄影记录和胶片冲印。在有条件的情况下 可建立此实验室。 生化分析室在以培养细胞产物为主要目的的实验室中,应建立相应的分析化验 实验室,以便于对培养物的有效成分随时进行取样检査 细胞工程实验室布局的其基本要求是:便于隔离、便于操作、便于灭菌、便于观察。 基本设备配制 基本设备冰箱、天平、酸度计、、纯水器、电炉、培养基分装器、搅拌器 灭菌设备蒸汽压力灭菌锅、干热消毒柜、过滤灭菌装置、喷雾消毒器、紫外灯 无菌操作设备净化工作台、接种箱
华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 2004-7 主讲教师：柳俊博士、教授 第一章 实验室设置及一般技术（2 学时） 教学目的与要求： 了解细胞工程的通用技术，初步掌握细胞工程实验技术中的培养基配制、灭菌以及 无菌操作的原理与操作方法。 第一节 实验室设置 细胞工程实验室它必须满足三个基本的需要，即：实验准备，包括培养基配制，洗 涤与灭菌等；无菌操作；控制培养。 一．实验室组成 1．基本实验室 准备室 准备室的功能就是进行一切与实验有关的准备工作。要求宽敞明亮，通风 条件好。 接种室 接种室的功能是进行无菌操作。要求封闭性好，干燥清洁，能较长时间保 持无菌。房间一般不宜过大，其规模根据实验需要而定。接种室除了出入口和通气口外， 应行密闭。 培养室 培养室的功能是对离体材料进行控制培养。其首要要求是要能控制光照和 温度，其次为防止微生物感染，培养室应保持干燥和清洁。 2．辅助实验室 细胞学实验室 其功能是对培养材料进行细胞学鉴定和研究。要求清洁、明亮、干燥， 使各种光学仪器不受潮湿和灰尘污染。 摄影室及暗室 其功能是进行培养材料的摄影记录和胶片冲印。在有条件的情况下 可建立此实验室。 生化分析室 在以培养细胞产物为主要目的的实验室中，应建立相应的分析化验 实验室，以便于对培养物的有效成分随时进行取样检查。 细胞工程实验室布局的其基本要求是：便于隔离、便于操作、便于灭菌、便于观察。 二．基本设备配制 基本设备 冰箱、天平、酸度计、、纯水器、电炉、培养基分装器、搅拌器。 灭菌设备 蒸汽压力灭菌锅、干热消毒柜、过滤灭菌装置、喷雾消毒器、紫外灯。 无菌操作设备 净化工作台、接种箱。 7
华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程 004-7 光温控制设备时间程序控制器、空调及温度感应器。 细胞培养设备培养设备根据需要而定,包括培养架、培养箱、摇床、生物反应器等。 细胞学鉴定设备光学研究显微镜、实体显微镜、倒置显微镜 除上述基本设备外,如果有条件和需要还可配制摄影设备、生化分析设备等。 三.培养器皿及实验用具 玻璃器皿 新型材料器皿 金属材质用具 第二节基本技术 洗涤技术 1.洗涤液 铬酸洗涤液是用重铬酸钾( K2 Cr2O7)与硫酸(HSO4)配制而成,可根据需要配制成弱 中、强三种。 弱用重铬酸钾50g加入蒸馏水1L,加热溶化,冷却后再缓慢加入浓硫酸9ml。 中用重铬酸钾50g加入蒸馏水l00m,加热溶化,冷却后再缓慢加入浓硫酸 875ml 强与浓硫酸加热的同时缓慢加入磨碎的重铬酸钾,直到重铬酸钾达到饱和为止。 一般浓硫酸LL加入重铬酸钾50g。 2.洗涤方法 玻璃器皿洗涤 塑料用品洗涤 金属用品洗涤 灭菌、消毒技术 理方法:物理灭菌干热、湿热、射线处理 物理除菌过滤、离心沉淀等 化学方法:消毒剂、抗菌素灭菌 1.培养基灭菌 2.玻璃器皿灭菌 3.金属用具灭菌
华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 2004-7 主讲教师：柳俊博士、教授 光温控制设备 时间程序控制器、空调及温度感应器。 细胞培养设备 培养设备根据需要而定，包括培养架、培养箱、摇床、生物反应器等。 细胞学鉴定设备 光学研究显微镜、实体显微镜、倒置显微镜。 除上述基本设备外，如果有条件和需要还可配制摄影设备、生化分析设备等。 三．培养器皿及实验用具 玻璃器皿 新型材料器皿 金属材质用具 第二节 基本技术 一．洗涤技术 1．洗涤液 铬酸洗涤液是用重铬酸钾(K2Cr2O7)与硫酸(H2SO4)配制而成，可根据需要配制成弱、 中、强三种。 弱 用重铬酸钾 50g 加入蒸馏水 1L，加热溶化，冷却后再缓慢加入浓硫酸 90ml。 中 用重铬酸钾 50g 加入蒸馏水 100ml，加热溶化，冷却后再缓慢加入浓硫酸 875ml。 强 与浓硫酸加热的同时缓慢加入磨碎的重铬酸钾，直到重铬酸钾达到饱和为止。 一般浓硫酸 1L 加入重铬酸钾 50g。 2．洗涤方法 玻璃器皿洗涤 塑料用品洗涤 金属用品洗涤 二．灭菌、消毒技术 理方法：物理灭菌 干热、湿热、射线处理 物理除菌 过滤、离心沉淀等 化学方法：消毒剂、抗菌素灭菌 1．培养基灭菌 2．玻璃器皿灭菌 3．金属用具灭菌 8
华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程 004-7 4.接种室灭菌 5.外植体灭菌 几种常用消毒剂的效果比较 消毒剂使用浓度(%)消毒时间(分)效果残液去除难易 次氯酸钙 10 次氯酸钠 30 新洁尔灭 30 好好好 易易易 氯化汞 0.1 2~10 最好 最难 过氧化氢 15 较好 最易 抗菌素 4-50mgl-l 30~60 较好 较难 第三节培养条件 光照 1.光照强度 2.光质 3.光照时间 温度 表1.2温度对菊芋愈伤组织细胞生长的影响 培养温度()接种时单个细胞平均鲜重(微到指数生长期末单个细胞重微克 克) 10.0 0.44 0.20 0 250 300 0.42 0.06 32.0 0.03 湿度 组织培养中湿度的影响有两个方面,一是培养容器内的湿度条件,一是环境的湿 度条件。容器内的湿度几乎是100%的相对湿度,二是环境的相对湿度一般要求70~ 四.pH值 通常使用的pH值范围是55~65。pH在40以下或70以上培养物就不能正常生长
华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 2004-7 主讲教师：柳俊博士、教授 4．接种室灭菌 5．外植体灭菌 几种常用消毒剂的效果比较 消 毒 剂 使用浓度(％) 消毒时间(分) 效 果 残液去除难易 次氯酸钙 10 5～30 好 易 次氯酸钠 2～5 5～30 好 易 新洁尔灭 10～20 5～30 好 易 氯化汞 0.1～1 2～10 最好 最难 过氧化氢 10～12 5～15 较好 最易 抗菌素 4～50mgl -1 30～60 较好 较难 第三节 培养条件 一．光照 1．光照强度 2．光质 3．光照时间 二．温度 表 1.2 温度对菊芋愈伤组织细胞生长的影响 培养温度( ) 接种时单个细胞平均鲜重(微 克) 到指数生长期末单个细胞重(微克) 10.0 0.44 0.20 15.0 0.42 0,12 25.0 0.44 0.07 30.0 0.42 0.06 32.0 0.52 0.03 三．湿度 组织培养中湿度的影响有两个方面，一是培养容器内的湿度条件，一是环境的湿 度条件。容器内的湿度几乎是 100%的相对湿度，二是环境的相对湿度一般要求 70～ 80%。 四．pH 值 通常使用的 pH 值范围是 5.5～6.5。pH 在 4.0 以下或 7.0 以上培养物就不能正常生长。 9
华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程 004-7 五.渗透压 通气条件 第四节离体培养的营养需求 总体来讲用于植物离体培养的培养基至少包括无机盐;有机化合物;生长调节剂 三大基本组成以及根据不同需要的其它附加成分。 无机盐类 必需元素在体内的生理作用主要包括四个方面: 是组成各种化合物,参与机体的建造,成为结构物质; 二是构成一些特殊的生理活性物质,如植物激素、酶以及酶的活化剂,参与植物的 代谢活动 三是这些元素之间相互协调,以维持离子浓度平衡、胶体稳定、电荷平衡等生物电化 学方面的作用 四是在发育过程中,影响组织器官的建成。 有机化合物 糖类既可作为C源,又可维持培养基的渗透压。植物组织培养中常使用蔗糖,在 某些特殊培养类型中,亦使用麦芽糖、葡萄糖、果糖、纤维二糖、甘露糖等。 维生素为了使培养物生长得更好,根据培养目的不同常在培养基中添加一种或 多种维生素。常用的维生素包括VB1(盐酸硫胺素)、VB6(盐酸吡哆醇)、Vpp(烟酸) VH(生物素)、ⅤBc(叶酸)、VB3(泛酸钙)等 肌醇化学名称环己六醇。肌醇本身并没有促进生长的作用,但它在糖类的相互转 化、维生素、激素的利用相应具有重要的促进作用,所以它能使培养物快速生长,对胚 状体和芽的形成有良好的影响。 腺嘌呤腺嘌呤是合成各种细胞分裂素的前体之一,外源添加腺嘌呤有利于细胞 协调自身合成细胞分裂素,有利于细胞的分裂和分化,促进芽的形成和生长 氨基酸氨基酸是蛋白质的组成成分。常用的氨基酸为甘氨酸及多种氨基酸的混合 物如水解酪蛋白、水解乳蛋白等。 植物激素 生长素类常用的生长素有IAA(吲哆乙酸)、NAA(奈乙酸)、2,4-D(二氯苯氧乙酸)
华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 2004-7 主讲教师：柳俊博士、教授 五．渗透压 六．通气条件 第四节 离体培养的营养需求 总体来讲用于植物离体培养的培养基至少包括无机盐；有机化合物；生长调节剂 三大基本组成以及根据不同需要的其它附加成分。 一．无机盐类 必需元素在体内的生理作用主要包括四个方面： 一是组成各种化合物，参与机体的建造，成为结构物质； 二是构成一些特殊的生理活性物质，如植物激素、酶以及酶的活化剂，参与植物的 代谢活动； 三是这些元素之间相互协调，以维持离子浓度平衡、胶体稳定、电荷平衡等生物电化 学方面的作用； 四是在发育过程中，影响组织器官的建成。 二．有机化合物 糖类 既可作为 C 源，又可维持培养基的渗透压。植物组织培养中常使用蔗糖，在 某些特殊培养类型中，亦使用麦芽糖、葡萄糖、果糖、纤维二糖、甘露糖等。 维生素 为了使培养物生长得更好，根据培养目的不同常在培养基中添加一种或 多种维生素。常用的维生素包括 VB1（盐酸硫胺素）、VB6（盐酸吡哆醇）、Vpp(烟酸)、 VH (生物素)、VBc（叶酸）、VB5（泛酸钙）等。 肌醇 化学名称环己六醇。肌醇本身并没有促进生长的作用，但它在糖类的相互转 化、维生素、激素的利用相应具有重要的促进作用，所以它能使培养物快速生长，对胚 状体和芽的形成有良好的影响。 腺嘌呤 腺嘌呤是合成各种细胞分裂素的前体之一，外源添加腺嘌呤有利于细胞 协调自身合成细胞分裂素，有利于细胞的分裂和分化，促进芽的形成和生长。 氨基酸 氨基酸是蛋白质的组成成分。常用的氨基酸为甘氨酸及多种氨基酸的混合 物如水解酪蛋白、水解乳蛋白等。 三．植物激素 生长素类 常用的生长素有 IAA(吲哆乙酸)、NAA (奈乙酸 )、2,4-D(二氯苯氧乙酸) 10