华中农业大学创建国家精品课程—细胞工程学文本教案(第一章) 主讲教师:柳俊博士、教授 第一章实验室设置及一般技术(2学时) 教学目的与要求 了解细胞工程的通用技术,初步掌握细胞工程实验技术中的培养基配制、灭菌以及无菌 操作的原理与操作方法。 第一节实验室设置 细胞工程实验室它必须满足三个基本的需要,即:实验准备,包括培养基配制,洗涤与 灭菌等:;无菌操作;控制培养。 实验室组成 基本实验室 准备室准备室的功能就是进行一切与实验有关的准备工作。要求宽敞明亮,通风条 件好 接种室接种室的功能是进行无菌操作。要求封闭性好,干燥清洁,能较长时间保持 无菌。房间一般不宜过大,其规模根据实验需要而定。接种室除了出入口和通气口外,应 行密闭。 培养室培养室的功能是对离体材料进行控制培养。其首要要求是要能控制光照和温 度,其次为防止微生物感染,培养室应保持干燥和清洁。 2.辅助实验室 细胞学实验室其功能是对培养材料进行细胞学鉴定和研究。要求清洁、明亮、干 燥,使各种光学仪器不受潮湿和灰尘污染。 摄影室及暗室其功能是进行培养材料的摄影记录和胶片冲印。在有条件的情况下可 建立此实验室。 生化分析室在以培养细胞产物为主要目的的实验室中,应建立相应的分析化验实验 室,以便于对培养物的有效成分随时进行取样检查。 细胞工程实验室布局的其基本要求是:便于隔离、便于操作、便于灭菌、便于观察。 .基本设备配制 基本设备冰箱、天平、酸度计、、纯水器、电炉、培养基分装器、搅拌器。 灭菌设备蒸汽压力灭菌锅、干热消毒柜、过滤灭菌装置、喷雾消毒器、紫外灯 无菌操作设备净化工作台、接种箱。 光温控制设备时间程序控制器、空调及温度感应器 细胞培养设备培养设备根据需要而定,包括培养架、培养箱、摇床、生物反应器 等 细胞学鉴定设备光学研究显微镜、实体显微镜、倒置显微镜。 除上述基本设备外,如果有条件和需要还可配制摄影设备、生化分析设备等 培养器皿及实验用具 玻璃器皿 新型材料器皿 金属材质用具
华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 文本教案(第一章) 主讲教师：柳俊博士、教授 第一章 实验室设置及一般技术（2 学时） 教学目的与要求： 了解细胞工程的通用技术，初步掌握细胞工程实验技术中的培养基配制、灭菌以及无菌 操作的原理与操作方法。 第一节 实验室设置 细胞工程实验室它必须满足三个基本的需要，即：实验准备，包括培养基配制，洗涤与 灭菌等；无菌操作；控制培养。 一．实验室组成 1．基本实验室 准备室 准备室的功能就是进行一切与实验有关的准备工作。要求宽敞明亮，通风条 件好。 接种室 接种室的功能是进行无菌操作。要求封闭性好，干燥清洁，能较长时间保持 无菌。房间一般不宜过大，其规模根据实验需要而定。接种室除了出入口和通气口外，应 行密闭。 培养室 培养室的功能是对离体材料进行控制培养。其首要要求是要能控制光照和温 度，其次为防止微生物感染，培养室应保持干燥和清洁。 2．辅助实验室 细胞学实验室 其功能是对培养材料进行细胞学鉴定和研究。要求清洁、明亮、干 燥，使各种光学仪器不受潮湿和灰尘污染。 摄影室及暗室 其功能是进行培养材料的摄影记录和胶片冲印。在有条件的情况下可 建立此实验室。 生化分析室 在以培养细胞产物为主要目的的实验室中，应建立相应的分析化验实验 室，以便于对培养物的有效成分随时进行取样检查。 细胞工程实验室布局的其基本要求是：便于隔离、便于操作、便于灭菌、便于观察。 二．基本设备配制 基本设备 冰箱、天平、酸度计、、纯水器、电炉、培养基分装器、搅拌器。 灭菌设备 蒸汽压力灭菌锅、干热消毒柜、过滤灭菌装置、喷雾消毒器、紫外灯。 无菌操作设备 净化工作台、接种箱。 光温控制设备 时间程序控制器、空调及温度感应器。 细胞培养设备 培养设备根据需要而定，包括培养架、培养箱、摇床、生物反应器 等。 细胞学鉴定设备 光学研究显微镜、实体显微镜、倒置显微镜。 除上述基本设备外，如果有条件和需要还可配制摄影设备、生化分析设备等。 三．培养器皿及实验用具 玻璃器皿 新型材料器皿 金属材质用具
华中农业大学创建国家精品课程—细胞工程学文本教案(第一章) 主讲教师:柳俊博士、教授 第二节基本技术 洗涤技术 洗涤液 铬酸洗涤液是用重铬酸钾(KCrO)与硫酸(HSO4)配制而成,可根据需要配制成弱 中、强三种。 弱用重铬酸钾50g加入蒸馏水I,加热溶化,冷却后再缓慢加入浓硫酸9om。 中用重铬酸钾50g加入蒸馏水l00m,加热溶化,冷却后再缓慢加入浓硫酸875ml。 强与浓硫酸加热的同时缓慢加入磨碎的重铬酸钾,直到重铬酸钾达到饱和为止。 般浓硫酸1L加入重铬酸钾50g 2.洗涤方法 玻璃器皿洗涤 塑料用品洗涤 金属用品洗涤 灭菌、消毒技术 理方法:物理灭菌干热、湿热、射线处理 物理除菌过滤、离心沉淀等 化学方法:消毒剂、抗菌素灭菌 1.培养基灭菌 2.玻璃器皿灭菌 3.金属用具灭菌 4.接种室灭菌 外植体灭菌 几种常用消毒剂的效果比较 消毒剂_使用浓度(%)消毒时间(分)效果残液去除难易 次氯酸钙 5~30 次氯酸钠 5~30 新洁尔灭 5~30 氯化汞 0.1~1 2~10 最难 过氧化氢 10~12 5~15 最易 抗菌素 4-50mgl 30~60 较难 第三节培养条件 光照 1.光照强度 2.光质 光照时间 温度
华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 文本教案(第一章) 主讲教师：柳俊博士、教授 第二节 基本技术 一．洗涤技术 1．洗涤液 铬酸洗涤液是用重铬酸钾(K2Cr2O7)与硫酸(H2SO4)配制而成，可根据需要配制成弱、 中、强三种。 弱 用重铬酸钾 50g 加入蒸馏水 1L，加热溶化，冷却后再缓慢加入浓硫酸 90ml。 中 用重铬酸钾 50g 加入蒸馏水 100ml，加热溶化，冷却后再缓慢加入浓硫酸 875ml。 强 与浓硫酸加热的同时缓慢加入磨碎的重铬酸钾，直到重铬酸钾达到饱和为止。一 般浓硫酸 1L 加入重铬酸钾 50g。 2．洗涤方法 玻璃器皿洗涤 塑料用品洗涤 金属用品洗涤 二．灭菌、消毒技术 理方法：物理灭菌 干热、湿热、射线处理 物理除菌 过滤、离心沉淀等 化学方法：消毒剂、抗菌素灭菌 1．培养基灭菌 2．玻璃器皿灭菌 3．金属用具灭菌 4．接种室灭菌 5．外植体灭菌 几种常用消毒剂的效果比较 消 毒 剂 使用浓度(％) 消毒时间(分) 效 果 残液去除难易 次氯酸钙 10 5～30 好 易 次氯酸钠 2～5 5～30 好 易 新洁尔灭 10～20 5～30 好 易 氯化汞 0.1～1 2～10 最好 最难 过氧化氢 10～12 5～15 较好 最易 抗菌素 4～50mgl -1 30～60 较好 较难 第三节 培养条件 一．光照 1．光照强度 2．光质 3．光照时间 二．温度
华中农业大学创建国家精品课程—细胞工程学文本教案(第一章) 主讲教师:柳俊博士、教授 表1.2温度对菊芋愈伤组织细胞生长的影响 培养温度()接种时单个细胞平均鲜重(微到指数生长期末单个细胞重(微克 100 0.44 0.20 150 0.42 0,12 0.44 300 0.06 32.0 0.03 三.湿度 组织培养中湿度的影响有两个方面,一是培养容器内的湿度条件,一是环境的湿度条 件。容器内的湿度几乎是100%的相对湿度,二是环境的相对湿度一般要求70~80% 四.pH值 通常使用的pH值范围是5.5~6.5。pH在40以下或70以上培养物就不能正常生长。 五.渗透压 六.通气条件 第四节离体培养的营养需求 总体来讲用于植物离体培养的培养基至少包括无机盐;有机化合物;生长调节剂三大 基本组成以及根据不同需要的其它附加成分。 无机盐类 必需元素在体内的生理作用主要包括四个方面 是组成各种化合物,参与机体的建造,成为结构物质 是构成一些特殊的生理活性物质,如植物激素、酶以及酶的活化剂,参与植物的代 谢活动; 三是这些元素之间相互协调,以维持离子浓度平衡、胶体稳定、电荷平衡等生物电化 学方面的作用 四是在发育过程中,影响组织器官的建成 二.有机化合物 糖类既可作为C源,又可维持培养基的渗透压。植物组织培养中常使用蔗糖,在某 些特殊培养类型中,亦使用麦芽糖、葡萄糖、果糖、纤维二糖、甘露糖等 维生素为了使培养物生长得更好,根据培养目的不同常在培养基中添加一种或多种 维生素。常用的维生素包括ⅤB1(盐酸硫胺素)、VB6(盐酸吡哆醇)、Vp(烟酸)、VH (生物素)、VBc(叶酸)、VBs(泛酸钙)等。 肌醇化学名称环己六醇。肌醇本身并没有促进生长的作用,但它在糖类的相互转 化、维生素、激素的利用相应具有重要的促进作用,所以它能使培养物快速生长,对胚状 体和芽的形成有良好的影响。 腺嘌呤腺嘌呤是合成各种细胞分裂素的前体之一,外源添加腺嘌呤有利于细胞协调 自身合成细胞分裂素,有利于细胞的分裂和分化,促进芽的形成和生长
华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 文本教案(第一章) 主讲教师：柳俊博士、教授 表 1.2 温度对菊芋愈伤组织细胞生长的影响 培养温度( ) 接种时单个细胞平均鲜重(微 克) 到指数生长期末单个细胞重(微克) 10.0 0.44 0.20 15.0 0.42 0,12 25.0 0.44 0.07 30.0 0.42 0.06 32.0 0.52 0.03 三．湿度 组织培养中湿度的影响有两个方面，一是培养容器内的湿度条件，一是环境的湿度条 件。容器内的湿度几乎是 100%的相对湿度，二是环境的相对湿度一般要求 70～80%。 四．pH 值 通常使用的 pH 值范围是 5.5～6.5。pH 在 4.0 以下或 7.0 以上培养物就不能正常生长。 五．渗透压 六．通气条件 第四节 离体培养的营养需求 总体来讲用于植物离体培养的培养基至少包括无机盐；有机化合物；生长调节剂三大 基本组成以及根据不同需要的其它附加成分。 一．无机盐类 必需元素在体内的生理作用主要包括四个方面： 一是组成各种化合物，参与机体的建造，成为结构物质； 二是构成一些特殊的生理活性物质，如植物激素、酶以及酶的活化剂，参与植物的代 谢活动； 三是这些元素之间相互协调，以维持离子浓度平衡、胶体稳定、电荷平衡等生物电化 学方面的作用； 四是在发育过程中，影响组织器官的建成。 二．有机化合物 糖类 既可作为 C 源，又可维持培养基的渗透压。植物组织培养中常使用蔗糖，在某 些特殊培养类型中，亦使用麦芽糖、葡萄糖、果糖、纤维二糖、甘露糖等。 维生素 为了使培养物生长得更好，根据培养目的不同常在培养基中添加一种或多种 维生素。常用的维生素包括 VB1（盐酸硫胺素）、VB6（盐酸吡哆醇）、Vpp(烟酸)、VH (生物素)、VBc（叶酸）、VB5（泛酸钙）等。 肌醇 化学名称环己六醇。肌醇本身并没有促进生长的作用，但它在糖类的相互转 化、维生素、激素的利用相应具有重要的促进作用，所以它能使培养物快速生长，对胚状 体和芽的形成有良好的影响。 腺嘌呤 腺嘌呤是合成各种细胞分裂素的前体之一，外源添加腺嘌呤有利于细胞协调 自身合成细胞分裂素，有利于细胞的分裂和分化，促进芽的形成和生长
华中农业大学创建国家精品课程—细胞工程学文本教案(第一章) 主讲教师:柳俊博士、教授 氨基酸氨基酸是蛋白质的组成成分。常用的氨基酸为甘氨酸及多种氨基酸的混合物 如水解酪蛋白、水解乳蛋白等 植物激素 生长素类常用的生长素有IAA(吲哆乙酸)、NAA(奈乙酸)、2,4-D(二氯苯氧乙酸)和 IBA(吲哆丁酸)等。 细胞分裂素类常用的细胞分裂素有KT(激动素)、BA(6-卞基腺嘌呤)、2ip(异戊烯氨 基嘌呤)玉米素等。近年来TDZ(苯基噻二唑基脲)亦作为一种新的细胞分裂素在许多离体 培养研究中使用 赤霉素类 此外,根据不同培养目的,ABA(脱落酸)、乙烯、B、CCC(矮壮素)等生长抑制物质 有时也被用于调节培养物的生长发育过程,如诱导某些变态器官的发生等。 四.其它 天然提取物如椰乳、番茄汁、YE(酵母提取物) 琼脂 活性炭 思考题 1.植物细胞工程实验室的基本组成与要求 2.培养基的组成成分有哪几类,在离体培养中的功能是什么? 3.植物离体培养的环境条件及对培养的影响
华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 文本教案(第一章) 主讲教师：柳俊博士、教授 氨基酸 氨基酸是蛋白质的组成成分。常用的氨基酸为甘氨酸及多种氨基酸的混合物 如水解酪蛋白、水解乳蛋白等。 三．植物激素 生长素类 常用的生长素有 IAA(吲哆乙酸)、NAA (奈乙酸 )、2,4-D(二氯苯氧乙酸)和 IBA(吲哆丁酸)等。 细胞分裂素类 常用的细胞分裂素有 KT (激动素)、BA(6-卞基腺嘌呤)、2-ip(异戊烯氨 基嘌呤)玉米素等。近年来 TDZ（苯基噻二唑基脲）亦作为一种新的细胞分裂素在许多离体 培养研究中使用。 赤霉素类 此外，根据不同培养目的， ABA(脱落酸)、乙烯、B9、CCC(矮壮素)等生长抑制物质 有时也被用于调节培养物的生长发育过程，如诱导某些变态器官的发生等。 四．其它 天然提取物 如椰乳、番茄汁、YE(酵母提取物) 琼脂 活性炭 思考题 1．植物细胞工程实验室的基本组成与要求。 2．培养基的组成成分有哪几类，在离体培养中的功能是什么？ 3．植物离体培养的环境条件及对培养的影响