华中农业大学创建国家精品课程—一细胞工程学 文本教案(第七章) 主讲教师:柳俊博士、教授 第七章体细胞杂交(4学时) 教学目的与要求 在进一步认识原生质膜性质的基础上,深入了解细胞融合的基本原理,掌握电融合和 PEG融合的基本方法 第一节、体细胞杂交的概念 体细胞杂交,即原生质体融合 植物细胞杂交的几个重要进展 1960年, Rocking用酶法制备高等植物原生质体首次获得成功 1970年, Power首次用硝酸钠进行为诱导剂进行了较大规模的原生质体诱导融合; 1971年, Takebe首次从离体烟草原生质体培养中获得再生完整植株 1972年, Carlson首次获得粉蓝烟草和郎氏烟草的细胞杂种,这也是第一个植物细胞杂种; 1974年,Kao将聚乙二醇诱导融合法应用于植物细胞融合并建立了相应的融合技术; 1978年, Melchers获得了第一个属间细胞杂种(番茄+马铃薯) 1981年, Zimmerman发明了电融合仪,并首次提出了电融合概念; 1987年, Schweiger建立了单对原生质体电融合技术程序。 根据融合时细胞的完整程度,原生质体融合可分为两大类: 对称融合( asymmetric fusion)一即两个完整的细胞原生质体融合 非对称融合( symmetric fusion)一利用物理或化学方法使某亲本的核或细胞质失活后再 进行融合,它可以分为几种 用于细胞核或细胞质失活的方法分为物理和化学两大类 物理方法常采用射线处理,如X射线、射线等,它们能使细胞核失活; 化学处理目前常用的试剂有,核失活一碘乙酰胺(IOA)、碘乙酸( (odoacetate);质失活 罗丹明(R-6-G,它是一种亲脂染料,能够抑制线粒体的氧化磷酸化过程而达到失 活作用 第二节、原生质体的融合 融合方法 PEG诱导融合法 PEG诱导融合的特点:其优点是融合成本低,勿需特殊设备;融合子产生的异核率较 高;融合过程不受物种限制。其缺点是融合过程繁琐,PEG可能对细胞有毒害。 PEG的作用机理:Kao等认为,由于PEG分子具有轻微的负极性,故可以与具有正极 性基团的水、蛋白质和碳水化合物等形成H键,从而在在原生质体之间形成分子桥,其
华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 文本教案(第七章) 主讲教师：柳俊博士、教授 第七章 体细胞杂交（4 学时） 教学目的与要求： 在进一步认识原生质膜性质的基础上，深入了解细胞融合的基本原理，掌握电融合和 PEG 融合的基本方法。 第一节、体细胞杂交的概念 体细胞杂交，即原生质体融合。 植物细胞杂交的几个重要进展 1960 年，Kocking 用酶法制备高等植物原生质体首次获得成功； 1970 年，Power 首次用硝酸钠进行为诱导剂进行了较大规模的原生质体诱导融合； 1971 年，Takebe 首次从离体烟草原生质体培养中获得再生完整植株； 1972 年，Carlson 首次获得粉蓝烟草和郎氏烟草的细胞杂种，这也是第一个植物细胞杂种； 1974 年，Kao 将聚乙二醇诱导融合法应用于植物细胞融合并建立了相应的融合技术； 1978 年，Melchers 获得了第一个属间细胞杂种（番茄＋马铃薯）； 1981 年，Zimmerman 发明了电融合仪，并首次提出了电融合概念； 1987 年，Schweiger 建立了单对原生质体电融合技术程序。 根据融合时细胞的完整程度，原生质体融合可分为两大类： 对称融合（asymmetric fusion）－即两个完整的细胞原生质体融合。 非对称融合（symmetric fusion）－利用物理或化学方法使某亲本的核或细胞质失活后再 进行融合，它可以分为几种： 用于细胞核或细胞质失活的方法分为物理和化学两大类： 物理方法常采用射线处理，如 X 射线、射线等，它们能使细胞核失活； 化学处理目前常用的试剂有，核失活－碘乙酰胺（IOA）、碘乙酸(Iodoacetate)；质失活 －罗丹明（R－6－G，它是一种亲脂染料，能够抑制线粒体的氧化磷酸化过程而达到失 活作用。 第二节、原生质体的融合 一、融合方法 1．PEG 诱导融合法 PEG 诱导融合的特点：其优点是融合成本低，勿需特殊设备；融合子产生的异核率较 高；融合过程不受物种限制。其缺点是融合过程繁琐，PEG 可能对细胞有毒害。 PEG 的作用机理： Kao 等认为，由于 PEG 分子具有轻微的负极性，故可以与具有正极 性基团的水、蛋白质和碳水化合物等形成 H 键，从而在在原生质体之间形成分子桥，其
华中农业大学创建国家精品课程—细胞工程学文本教案(第七章) 主讲教师:柳俊博士、教授 结果是使原生质体发生粘连进而促使原生质体的融合;另外,PEG能增加类脂膜的流动 性,也使原生质体的核、细胞器发生融合成为可能 ●融合技术要点 融合液 y混合静止1mi 选择 P 加入PEG 融合 培养 加入稀释液 稀释 加入培养基↓|洗涤 融合液:CaCl2·2H2O8~10mmol KH2PO4 0.7mmol 甘露醇或山梨醇0.5~1.0mol pH5.6 诱导液:融合液+PEG20~45% 稀释液:A液(g/100ml)pH6.0B液(g100m)pH10.5 葡萄糖721 甘氨酸0.375 CaCl22H200.79 Naoh 0.169 DMSO 10m 电融合法 ●与PEG融合比较起来,电融合有三大优点:一是不存在对细胞的毒害问题;二是融合效 率高;三是融合技术操作简便 电融合仪的结构特点:一是交变电场部分;一是高频直流电击部分 ●电融合的基本过程: 细胞膜的接触:当原生质体置于电导率很低的溶液中时,电场通电后,电流即通过原生 质体而不是通过溶液,其结果是原生质体在电场作用下极化而产生偶极子,从而使原生质体 紧密接触排列成串;
华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 文本教案(第七章) 主讲教师：柳俊博士、教授 结果是使原生质体发生粘连进而促使原生质体的融合；另外，PEG 能增加类脂膜的流动 性，也使原生质体的核、细胞器发生融合成为可能。 融合技术要点： 融合液：CaCl2·2H2O 8~10mmol KH2PO4 0.7mmol 甘露醇或山梨醇 0.5~1.0mol pH 5.6 诱导液：融合液＋PEG 20～45％ 稀释液：A 液（g/100ml）pH6.0 B 液（g/100ml）pH10.5 葡萄糖 7.21 甘氨酸 0.375 CaCl2·2H2O 0.79 NaOH 0.169 DMSO 10ml 2．电融合法 与 PEG 融合比较起来，电融合有三大优点：一是不存在对细胞的毒害问题；二是融合效 率高；三是融合技术操作简便。 电融合仪的结构特点：一是交变电场部分；一是高频直流电击部分。 电融合的基本过程： 细胞膜的接触：当原生质体置于电导率很低的溶液中时，电场通电后，电流即通过原生 质体而不是通过溶液，其结果是原生质体在电场作用下极化而产生偶极子，从而使原生质体 紧密接触排列成串； P 1 P 2 P 1 P 2 混合静止 1min. 融 合 融合液 加入 PEG 稀 释 洗 涤 加入稀释液 加入培养基 培 养 选 择
华中农业大学创建国家精品课程—细胞工程学文本教案(第七章) 主讲教师:柳俊博士、教授 膜的击穿:原生质体成串排列后,立即给予高频直流脉冲就可以使原生质膜击穿,从而 导致两个紧密接触的细胞融合在一起。 关于融合参数:电融合中的主要参数包括交流电压、交变电场的振幅频率、交变电场的 处理时间;直流高频电压、脉冲宽度、脉冲次数等 二、原生质体的融合过程 三、影响原生质体融合的因素 首先,原生质体质量对细胞的融合起着至关重要的作用,高质量的原生质体是细胞融合 的首要条件。 其次,融合方法 其三是融合参数,包括各种融合液都应选择适当。 第三节、杂种细胞的发育动态及体细胞杂种鉴定 杂种细胞的发育动态 核质重组 细胞器重组 部分核物质或细胞器丢失 核分裂的非同步性 、体细胞杂种的特点 形态上的趋中性 变异幅度大 非整倍性 双亲性状的共显性 偏亲现象 杂种细胞的选择系统与杂种植株的鉴定 1.杂种细胞的选择系统
华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 文本教案(第七章) 主讲教师：柳俊博士、教授 膜的击穿：原生质体成串排列后，立即给予高频直流脉冲就可以使原生质膜击穿，从而 导致两个紧密接触的细胞融合在一起。 关于融合参数：电融合中的主要参数包括交流电压、交变电场的振幅频率、交变电场的 处理时间；直流高频电压、脉冲宽度、脉冲次数等。 二、原生质体的融合过程 三、影响原生质体融合的因素 首先，原生质体质量对细胞的融合起着至关重要的作用，高质量的原生质体是细胞融合 的首要条件。 其次，融合方法 其三是融合参数，包括各种融合液都应选择适当。 第三节、杂种细胞的发育动态及体细胞杂种鉴定 一、杂种细胞的发育动态 核质重组 细胞器重组 部分核物质或细胞器丢失 核分裂的非同步性 二、体细胞杂种的特点 形态上的趋中性 变异幅度大 非整倍性 双亲性状的共显性 偏亲现象 三、杂种细胞的选择系统与杂种植株的鉴定 1．杂种细胞的选择系统
华中农业大学创建国家精品课程—细胞工程学文本教案(第七章) 主讲教师:柳俊博士、教授 外观选择 互补选择 ●荧光标记选择 2.体细胞杂种的鉴定 形态鉴定:根据双亲的形态学性状观察进行鉴定。 细胞学鉴定:细胞器鉴定、染色体鉴定 生化鉴定:同功酶鉴定。 ●分子鉴定:RFLP鉴定、RAPD标记鉴定。 、体细胞杂种的遗传特性 细胞分裂与染色体丢失 如果细胞分裂而核不发生融合,在以后的发育过程中就会有两种结果,一是细胞分裂 几次以后即停止生长从而导致死亡;二是在发育过程中某一亲本的细胞核部分或全部丢失 如果这样就会产生几种情况:A细胞+B细胞质;A细胞+B细胞质和部分染色体或基因。 基因转移与性状表达 由于染色体的部分丢失,常常使某个亲本的部分或个别基因与另一亲本的染色体发生 整合,其结果是实现了亲本间的基因转移。基因转移通常是在后代中某些性状得以表达,有 时由于基因的重组也可能产生双亲均没有的新性状。 3.体细胞杂种遗传上的不稳定性 体细胞杂种后代在遗传上常常不稳定,这可能涉及到多方面的因素,如亲缘关系的远 近、培养过程中的染色体变异、细胞核、细胞质遗传物质的重组等。 第四节、体细胞杂种的应用 体细胞杂种的应用潜力 1、植物育种中的核质替换 2、细胞质杂种的获得 3、远缘杂交创造新物种 4、细胞器的互作研究 二、体细胞杂交面临的困难 1、融合特性的高效性 2、杂种细胞的培养和选择
华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 文本教案(第七章) 主讲教师：柳俊博士、教授 外观选择 互补选择 荧光标记选择 2．体细胞杂种的鉴定 形态鉴定：根据双亲的形态学性状观察进行鉴定。 细胞学鉴定：细胞器鉴定、染色体鉴定。 生化鉴定：同功酶鉴定。 分子鉴定：RFLP 鉴定、RAPD 标记鉴定。 二、体细胞杂种的遗传特性 1．细胞分裂与染色体丢失 如果细胞分裂而核不发生融合，在以后的发育过程中就会有两种结果，一是细胞分裂 几次以后即停止生长从而导致死亡；二是在发育过程中某一亲本的细胞核部分或全部丢失。 如果这样就会产生几种情况：A 细胞＋B 细胞质；A 细胞＋B 细胞质和部分染色体或基因。 2．基因转移与性状表达 由于染色体的部分丢失，常常使某个亲本的部分或个别基因与另一亲本的染色体发生 整合，其结果是实现了亲本间的基因转移。基因转移通常是在后代中某些性状得以表达，有 时由于基因的重组也可能产生双亲均没有的新性状。 3．体细胞杂种遗传上的不稳定性 体细胞杂种后代在遗传上常常不稳定，这可能涉及到多方面的因素，如亲缘关系的远 近、培养过程中的染色体变异、细胞核、细胞质遗传物质的重组等。 第四节、体细胞杂种的应用 一、体细胞杂种的应用潜力 1、 植物育种中的核质替换 2、 细胞质杂种的获得 3、 远缘杂交创造新物种 4、 细胞器的互作研究 二、体细胞杂交面临的困难 1、 融合特性的高效性 2、 杂种细胞的培养和选择
华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 文本教案(第七章) 主讲教师:柳俊博士、教授 杂种的遗传稳定性控制 体细胞杂交研究的发展趋势 诱导融合及杂种细胞的各种生理、生化、遗传机理的研究 2、电融合的程序化控制研究 3、各种类型原生质体(胞质体、核质体、细胞器)的制备技术研究 杂种细胞培养技术的程序化研究 思考题 1.植物体细胞杂交的概念和类型。 2.对称融合和非对称融合的概念及非对称融合的作用。 3.PEG融合与电融合的原理及影响因素。 4.杂种细胞的选择方法 5.如何用分子生物学方法鉴定杂种植株? 6.通过哪些途径可以进行原生质体的遗传饰变? 7.体细胞杂交技术的应用及还需要进一步研究解决的问题
华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 文本教案(第七章) 主讲教师：柳俊博士、教授 3、 杂种的遗传稳定性控制 三、体细胞杂交研究的发展趋势 1、 诱导融合及杂种细胞的各种生理、生化、遗传机理的研 究 2、 电融合的程序化控制研究 3、 各种类型原生质体（胞质体、核质体、细胞器）的制备技术研究 4、 杂种细胞培养技术的程序化研究 思考题 1．植物体细胞杂交的概念和类型。 2．对称融合和非对称融合的概念及非对称融合的作用。 3．PEG 融合与电融合的原理及影响因素。 4．杂种细胞的选择方法。 5．如何用分子生物学方法鉴定杂种植株？ 6．通过哪些途径可以进行原生质体的遗传饰变？ 7．体细胞杂交技术的应用及还需要进一步研究解决的问题
