第二十章高效液相色谱法 (High Performance Liquid Chromatography, HPLC) 20-1概述 效液相色谱法(HPLC是20世纪60年 代末70年代初发畏起来的一种新型分离分析技 术,随着不断改进与发畏,目前已成为盛用极 为广泛的化学分离分析的重要手段。它是在经 典液相色谱基础上,引入 相色谱的理论, 在技术上用了高压泵、高放固定相和高灵敏 度检测器,因而具备速度快、效率高、灵敏度 高,操作自动化的特点。为了更好地了解高效 液相色谱法优越性,现从两方面进行比较
第二十章 高效液相色谱法 (High Performance Liquid Chromatography，HPLC) 20-1概述 高效液相色谱法（HPLC）是20世纪60年 代末70年代初发展起来的一种新型分离分析技 术，随着不断改进与发展，目前已成为应用极 为广泛的化学分离分析的重要手段。它是在经 典液相色谱基础上，引入了气相色谱的理论， 在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏 度检测器，因而具备速度快、效率高、灵敏度 高、操作自动化的特点。为了更好地了解高效 液相色谱法优越性，现从两方面进行比较：
1.高效液相色谱法与经典液相色谱法 高效液相色谱法比起经典液相色谱法的最大优点 在于高速、高效、高灵敏度、高自动化。高速是指在 分析速度上比经典液相色谱法快数百倍。由于经典色 谱是重力加料,流出速度极慢;而高效液相色谱配备 了高压输液设备,流速最高可达103 cm min-1.例如分 离苯的羟基化合物,7个组分只需1min就可完成。对氨 基酸分离,用经典色谱法,柱长约170cm,柱径0.9cm, 流动相速度为30cm3h-,需用20多小时才能分离出20 种氨基酸;而用高效液相色谱法,只需1h之内即可完 成。又如用25cm×0.46cm的 Lichrosorb-ODS(5μ)的 柱,采用梯度洗脱,可在不到0.5h内分离出尿中104个 组分
1．高效液相色谱法与经典液相色谱法 高效液相色谱法比起经典液相色谱法的最大优点 在于高速、高效、高灵敏度、高自动化。高速是指在 分析速度上比经典液相色谱法快数百倍。由于经典色 谱是重力加料，流出速度极慢；而高效液相色谱配备 了高压输液设备，流速最高可达 103cm·min-1.例如分 离苯的羟基化合物，7个组分只需1min就可完成。对氨 基酸分离，用经典色谱法，柱长约170cm，柱径0.9cm， 流动相速度为30cm3·h -1，需用20多小时才能分离出20 种氨基酸；而用高效液相色谱法，只需lh之内即可完 成。又如用25cm×0.46cm的Lichrosorb－ODS(5μ)的 柱，采用梯度洗脱，可在不到0.5h内分离出尿中104个 组分
2.高效液相色谱法与气相色谱法 1)气相色谱法分析对象只限于分析气体和沸点 较低的化合物,它们仅占有机物总数的20%。对于占 有机物总数近80%的那些高沸点、热稳定性差、摩尔 质量大的物质,目前主要采用高效液相色谱法进行分 离和分析 2)气相色谱采用流动相是惰性气体,它对组分没 有亲和力,即不产生相互作用力,仅起运载作用。而 高效液相色谱法中流动相可选用不同极性的液体,选 择余地大,它对组分可产生一定亲和力,并参与固定 相对组分作用的剧烈竞争。因此,流动相对分离起很 大作用,相当于增加了一个控制和改进分离条件的参 数,这为选择最佳分离条件提供了极大方便
2．高效液相色谱法与气相色谱法 （l）气相色谱法分析对象只限于分析气体和沸点 较低的化合物，它们仅占有机物总数的20％。对于占 有机物总数近80％的那些高沸点、热稳定性差、摩尔 质量大的物质，目前主要采用高效液相色谱法进行分 离和分析。 (2)气相色谱采用流动相是惰性气体，它对组分没 有亲和力，即不产生相互作用力，仅起运载作用。而 高效液相色谱法中流动相可选用不同极性的液体，选 择余地大，它对组分可产生一定亲和力，并参与固定 相对组分作用的剧烈竞争。因此，流动相对分离起很 大作用，相当于增加了一个控制和改进分离条件的参 数，这为选择最佳分离条件提供了极大方便
3)气相色谱一般都在较高温度下进行的,而 高效液相色谱法则经常可在室温条件下工作。 总之,高效液相色谱法是吸取了气相色谱 与经典液相色谱优点,并用现代化手段加以改 进,因此得到迅猛的发展。目前高效液相色谱 法已被广泛应用于分析对生物学和医药上有重 大意义的大分子物质,例如蛋白质、核酸、氨 基酸、多糖类、植物色素、高聚物、染料及药 物等物质的分离和分析 高效液相色谱法的仪器设备费用 操作 严格,这是它的主要缺点
(3)气相色谱一般都在较高温度下进行的，而 高效液相色谱法则经常可在室温条件下工作。 总之，高效液相色谱法是吸取了气相色谱 与经典液相色谱优点，并用现代化手段加以改 进，因此得到迅猛的发展。目前高效液相色谱 法已被广泛应用于分析对生物学和医药上有重 大意义的大分子物质，例如蛋白质、核酸、氨 基酸、多糖类、植物色素、高聚物、染料及药 物等物质的分离和分析。 高效液相色谱法的仪器设备费用昂贵，操作 严格，这是它的主要缺点
20-2高效液相色谱仪 高效液相色谱仪的结构示意见图20-1, 般可分为4个主要部分:高压输液系统,进 样系统,分离系统和检测系统。此外还配有 辅助装置:如梯度淋洗,自动进样及数据处 理等。其工作过程如下:首先高压泵将贮液 器中流动相溶剂经过进样器送入色谱柱,然 后从控制器的出口流出。当注入欲分离的样 品时,流经进样器贮液器的流动相将样品同 时带入色谱柱进行分离,然后依先后顺序进 入检测器,记录仪将检测器送出的信号记录 下来,由此得到液相色谱图
20-2 高效液相色谱仪 高效液相色谱仪的结构示意见图20-1， 一般可分为4个主要部分：高压输液系统，进 样系统，分离系统和检测系统。此外还配有 辅助装置：如梯度淋洗，自动进样及数据处 理等。其工作过程如下：首先高压泵将贮液 器中流动相溶剂经过进样器送入色谱柱，然 后从控制器的出口流出。当注入欲分离的样 品时，流经进样器贮液器的流动相将样品同 时带入色谱柱进行分离，然后依先后顺序进 入检测器，记录仪将检测器送出的信号记录 下来，由此得到液相色谱图
hypode synnge precolumn ector pump mixing chamber fittings column solvents detector MA人 de ta
1.高压输液系统 由于高效液相色谱所用固定相颗粒极细,因此对流动相 阻力很大,为使流动相较快流动,必须配备有高压输液系统 它是高效液相色谱仪最重要的部件,一般由储液罐、高压输 液泵、过滤器、压力脉动阻力器等组成,其中高压输液泵是 核心部件。对于一个好的高压输液泵应符合密封性好,输出 流量恒定,压力平稳,可调范围宽,便于迅速更换溶剂及耐 腐蚀等要求。常用的输液泵分为恒流泵和恒压泵两种。恒流 泵特点是在一定操作条件下,输出流量保持恒定而与色谱柱 引起阻力变化无关;恒压泵是指能保持输出压力恒定,但其 流量则随色谱系统阻力而变化,故保留时间的重视性差,它 们各有优缺点。目前恒流泵正逐渐取代恒压泵。恒流泵又称 机械泵,它又分机械注射泵和机械往复泵两种,应用最多的 是机械往复泵
1．高压输液系统 由于高效液相色谱所用固定相颗粒极细，因此对流动相 阻力很大，为使流动相较快流动，必须配备有高压输液系统。 它是高效液相色谱仪最重要的部件，一般由储液罐、高压输 液泵、过滤器、压力脉动阻力器等组成，其中高压输液泵是 核心部件。对于一个好的高压输液泵应符合密封性好，输出 流量恒定，压力平稳，可调范围宽，便于迅速更换溶剂及耐 腐蚀等要求。常用的输液泵分为恒流泵和恒压泵两种。恒流 泵特点是在一定操作条件下，输出流量保持恒定而与色谱柱 引起阻力变化无关；恒压泵是指能保持输出压力恒定，但其 流量则随色谱系统阻力而变化，故保留时间的重视性差，它 们各有优缺点。目前恒流泵正逐渐取代恒压泵。恒流泵又称 机械泵，它又分机械注射泵和机械往复泵两种，应用最多的 是机械往复泵
OUTLET BALL VALVE PISTON INLET BALL VALVE FIGURE 21 17. Schematic diagram of a reciprocating pump Solvent flow is in an upward direction. Courtesy of varian Associates
2.进样系统 高效液相色谱柱比气相色谱柱短得 多(约5~30cm),所以柱外展宽(又 称柱外效应)较突出。柱外展宽是指色 谱柱外的因素所引起的峰展宽,主要包 括进样系统、连接管道及检测器中存在 死体积。柱外展宽可分柱前和柱后展宽 进样系统是引起往前展宽的主要因素, 因此高效液相色谱法中对进样技术要求 较严
2．进样系统 高效液相色谱柱比气相色谱柱短得 多（约5～30cm），所以柱外展宽（又 称柱外效应）较突出。柱外展宽是指色 谱柱外的因素所引起的峰展宽，主要包 括进样系统、连接管道及检测器中存在 死体积。柱外展宽可分柱前和柱后展宽。 进样系统是引起往前展宽的主要因素， 因此高效液相色谱法中对进样技术要求 较严
Pur P FIGURE 20-12 Six-port rotary sample- injection valve for HPLC. The arrows indicate tne path of solvent flow. Courtesy of varian Associates