Chapter 2基因工程制药
Chapter 2 基因工程制药
概述·生物技术的核心就是基因工程，20世纪70年代基因工程诞生，最先应用在医药科学领域·传统生物药物由于来源及制备上的困难、价格等因素的影响，此外在制备过程可能受到的病毒、衣原体、支原体等的感染等问题，促使人们寻求安全实用、疗效可靠的新方法来制备生物药物（如：生长激素抑制素1mg传统法：10万只羊的下丘脑，现：10L大肠杆菌培养液，0.3美元/mg尿激酶从男性尿中提取；胎盘丙种球蛋白从胎盘中提取
概 述 • 生物技术的核心就是基因工程，20世纪70年代基因 工程诞生,最先应用在医药科学领域。 • 传统生物药物由于来源及制备上的困难、价格等因 素的影响，此外在制备过程可能受到的病毒、衣原 体、支原体等的感染等问题，促使人们寻求安全、 实用、疗效可靠的新方法来制备生物药物。 • （如：生长激素抑制素 1 mg 传统法：10万只羊的下丘脑，现：10 L大肠杆菌 培养液，0.3美元/mg；尿激酶从男性尿中提取；胎盘丙种球蛋白从胎盘中提取
利用基因工程技术生产药品的优点：（1）可以大量生产过去难以获得的生理活性蛋白和多肽（如胰岛素、干扰素、细胞因子等），为临床使用提供有效的保障；挖掘更多的内源性生理活性（2）利用基因工程技术可以发现、物质；（3）可通过基因工程和蛋白质工程进行改造内源性生理活性物质。如白细胞介素-2的半胱氨酸改为丝氨酸或丙氨酸，白细胞介素-2的活性以及热稳定性均有提高；，（4）利用基因工程技术可获得新型化合物，扩大药物筛选来源
利用基因工程技术生产药品的优点： • （1）可以大量生产过去难以获得的生理活性蛋白和多肽（如胰 岛素、干扰素、细胞因子等），为临床使用提供有效的保障； • （2）利用基因工程技术可以发现、挖掘更多的内源性生理活性 物质； • （3）可通过基因工程和蛋白质工程进行改造内源性生理活性物 质。如白细胞介素-2的半胱氨酸改为丝氨酸或丙氨酸，白细胞介 素-2的活性以及热稳定性均有提高； • （4）利用基因工程技术可获得新型化合物，扩大药物筛选来源
基因工程药物生产的过程基因工程技术是将所要重组对象的目的基因插入载体、拼接、转入新的宿主细胞，构建成工程菌（或细胞），实现遗传物质的重新组合，并使自的基因在工程菌（或细胞），内进行复制和表达的技术
基因工程药物生产的过程 基因工程技术是将所要重组对象的目的基 因插入载体、拼接、转入新的宿主细胞，构建成 工程菌(或细胞），实现遗传物质的重新组合，并 使目的基因在工程菌(或细胞），内进行复制和表 达的技术
基因工程药物制备的一般过程构建基因工程获得目的基因一组建重组质粒菌或细胞培养工程菌产物分离纯化除菌过滤、成品检定半成品检定包装
获得目的基因 组建重组质粒 培养工程菌 构建基因工程 菌或细胞 产物分离纯化 除菌过滤 半成品检定 包装 成品检定 基因工程药物制备的一般过程
基因工程基本过程海切位点酶切位点抗生素抗性苯内限制性内切酶限制性核酸内切酶)A且的基因片段退火工具：酶限制性内切酶连接酶DNA连接酶逆转录酶DNA聚合酶将重组载体导入细菌细胞核酸酶C...了代细胞基因工程基本过程示意图
基因工程基本过程 • 工具：酶 • 限制性内切酶 • 连接酶 • 逆转录酶 • DNA聚合酶 • 核酸酶
基因克隆一、常用方法：逆转录法和化学合成法一、逆转录法逆转录法就是先分离纯化目的基因的mRNA再反转录成cDNA，然后进行cDNA的克隆表达。·cDNA与模板mRNA序列严格互补，而不含内含子
一、基因克隆 常用方法：逆转录法和化学合成法。 一、逆转录法 • 逆转录法就是先分离纯化目的基因的mRNA， 再反转录成 cDNA，然后进行 cDNA 的克隆表 达。 • cDNA与模板mRNA序列严格互补，而不含内 含子
·逆转录法的步骤、1、mRNA的纯化2、cDNA第一链的合成3、cDNA第二链的合成4、cDNA克隆5、将重组体导入宿主细胞6、cDNA文库的鉴定，7、目的cDNA克隆的分离和鉴定
• 逆转录法的步骤 • 1、mRNA的纯化 • 2、cDNA第一链的合成 • 3、cDNA第二链的合成 • 4、cDNA克隆 • 5、将重组体导入宿主细胞 • 6、cDNA文库的鉴定 • 7、目的cDNA克隆的分离和鉴定
cDNA克隆示意图分离纯化mRNA逆转录酶SS-cDNADNA聚合酶ds-cDNART-PCR
cDNA克隆示意图 mRNA 逆转录酶 ss-cDNA DNA聚合酶 ds-cDNA 分离纯化 RT-PCR
CDNA克隆用于cDNA克隆的载体：细菌质粒（如pBR322、pUC等）插入片段10kb人工染色体本大片段动植物病毒根据重组后插入的cDNA能否表达非表达型载体（pBR322及入gt10）表达型载体（pUC及入gt11）有利于目的基因的筛选
cDNA克隆 • 用于cDNA克隆的载体： 细菌质粒（如pBR322、 pUC等）插入片段10kb 人工染色体 大片段 动植物病毒 • 根据重组后插入的cDNA能否表达 非表达型载体（pBR322及gt10 ） 表达型载体（pUC及gt11 ）有利于目的基因的筛选