第五章 分子生物学基本研究法 1
1 第五章 分子生物学基本研究法
分子生物学基本研究法 ·5.1基因操作与功能研究 ·5.2蛋白质操作与功能研究 2
2 分子生物学基本研究法 • 5.1 基因操作与功能研究 • 5.2 蛋白质操作与功能研究
5.1基因操作与功能研究 5.1.1基因克隆技术 ·在多细胞的高等生物个体水平上，人们用克隆(clone)表 示由具有相同基因型的同一物种的两个或数个个体组成的群 体。从同一受精卵分裂而来的单卵双生子（monozygotic twins)便是属于同一克隆。 ·在细胞水平上，克隆一词是指由同一个祖细胞(progenitor cell)分裂而来的一群遗传上同一的子细胞群体。 ·在分子生物学上，人们把将外源DNA插入具有复制能力的 载体DA中，使之得以永久保存和复制这种过程称为克隆。 3
3 5.1.1 基因克隆技术 • 在多细胞的高等生物个体水平上，人们用克隆（clone）表 示由具有相同基因型的同一物种的两个或数个个体组成的群 体。从同一受精卵分裂而来的单卵双生子（monozygotic twins）便是属于同一克隆。 • 在细胞水平上，克隆一词是指由同一个祖细胞（progenitor cell）分裂而来的一群遗传上同一的子细胞群体。 • 在分子生物学上，人们把将外源DNA插入具有复制能力的 载体DNA中，使之得以永久保存和复制这种过程称为克隆。 5.1 基因操作与功能研究
l.RACE技术rapid amplification of cDNA ends ·是用于从已知cDNA片段扩增全长基因的方法，它根据已知 序列设计基因片段内部特异引物，由该片段向外侧进行PCR 扩增得到目的序列。用于扩增5端的方法称为5RACE,用 于扩增3端的称为3RACE。 . 已知cDNA序列可来自序列表达标签、减法cDNA库、差法 显示和基因文库筛选。 4
4 1. RACE技术 rapid amplification of cDNA ends • 是用于从已知cDNA片段扩增全长基因的方法，它根据已知 序列设计基因片段内部特异引物，由该片段向外侧进行PCR 扩增得到目的序列。用于扩增5’端的方法称为5’RACE，用 于扩增3’端的称为3’RACE。 • 已知cDNA序列可来自序列表达标签、减法cDNA库、差法 显示和基因文库筛选
mRNA 1.RACE技术 5 ·5RACE ↓ 5 在反转录酶的作用下，以已知基因 片段内部。特异性引物启始cDNA 第一条链的合成 15 。 RNase混合物降解模板mRNA,纯 化cDNA第一条链。 3CC.CC 用末端转移酶在cDNA链3端加入 Abridged Anchor Primer 连续的dCTP 5☐G1+1G◆ 3'CCCC UAP GSP2 以连有oligo(dG)的锚定引物和基 因片段内部特异的nested引物进行 AUAP 5☐G1+1G PCR扩增，以期得到目的片段，并 3☐CCCC 可用nest PCR进行检测。 )·,简画 nested GSP
5 1 . RACE技术 • 5 ’RACE • 在反转录酶的作用下 ，以已知基因 片段内部 。特异性引物启始cDNA 第一条链的合成 • RNase混合物降解模板mRNA ， 纯 化cDNA第一条链 。 • 用末端转移酶在cDNA 链 3 ‘端加入 连续的dCTP • 以连有oligo(dG) 的锚定引物和基 因片段内部特异的nested引物进行 PCR扩增 ，以期得到目的片段 ， 并 可用nest PCR进行检测
1.RACE技术 5 AP ·3RACE 是在反转录酶的作用下，以连有可 AP 以和polyA配对的oligo(dT)的锚定 引物启始cDNA第一条链的合成。 ·用RNaseH降解模板mRNA。 ·用通用锚定引物和基因片段内部特 异引物进行PCR扩增得到目的3' GSP1 片段，并可用nest PCR的方法继续 UAP 进行检测和扩增。 GSP2 UAP 6
6 1. RACE技术 • 3’RACE • 是在反转录酶的作用下，以连有可 以和polyA配对的oligo(dT)的锚定 引物启始cDNA第一条链的合成。 • 用RNaseH 降解模板mRNA。 • 用通用锚定引物和基因片段内部特 异引物进行PCR扩增得到目的3’ 片段，并可用nest PCR的方法继续 进行检测和扩增
5.1.2基因扩增 1.聚合酶链式反应 ·聚合酶链式反应，即PCR技术，是一种在体外快速 扩增特定基因或DNA序列的方法。它可以快速将极 微量的目的基因或某一特定的DNA片段扩增数十万 乃至千百万倍
7 5.1.2 基因扩增 1. 聚合酶链式反应 • 聚合酶链式反应，即PCR技术，是一种在体外快速 扩增特定基因或DNA序列的方法。它可以快速将极 微量的目的基因或某一特定的DNA片段扩增数十万 乃至千百万倍
5.1.2基因扩增 1.聚合酶链式反应 ·基本原理： ·首先将双链DNA分子在临近沸点的温度下加热分离成两条单链 DNA分子，DNA聚合酶以单链DNA为模板并利用反应混合物 中的四种脱氧核苷三磷酸合成新生的DNA互补链。新合成的 DNA链的起点，由加入到反应混合物中的一对寡核苷酸引物在 模板DNA链两端的退火决定的。DNA解链（变性）、引物与模板 DNA相结合（退火）、DNA合成（延伸）三步，被不断重复。多次 循环之后，反应混合物中所含有的双链DNA数，即两条引物位 点之间的DNA区段的拷贝数，理论上的最高值是2”。 8
8 5.1.2基因扩增 1. 聚合酶链式反应 • 基本原理： • 首先将双链DNA分子在临近沸点的温度下加热分离成两条单链 DNA分子，DNA聚合酶以单链DNA为模板并利用反应混合物 中的四种脱氧核苷三磷酸合成新生的DNA互补链。新合成的 DNA链的起点，由加入到反应混合物中的一对寡核苷酸引物在 模板DNA链两端的退火决定的。DNA解链(变性)、引物与模板 DNA相结合(退火)、DNA合成(延伸)三步，被不断重复。多次 循环之后，反应混合物中所含有的双链DNA数，即两条引物位 点之间的DNA区段的拷贝数，理论上的最高值是2 n
1.聚合酶链式反应 。 具体过程： -首先将含有待扩增DNA样品的反应混合物放置在高温（约 94℃)环境下加热1min,使双链DNA变性，形成单链模板 DNA; -然后降低反应温度（约56℃）冷却1min,使引物与两条单 链模板DNA发生退火作用并结合在靶DNA区段两端互补序 列位置上； -最后，72℃左右保温1至数分钟，在DNA聚合酶的作用下， 从引物的3’-端加入脱氧核苷三磷酸，并沿着模板按5’→3 方向延伸，合成新生DNA互补链。以上循环在同一个PCR 管中进行。反应物加完后，温度由PC℉仪调整，程序完成后 可以拿到产物。 9
9 1. 聚合酶链式反应 • 具体过程： – 首先将含有待扩增DNA样品的反应混合物放置在高温（约 94℃）环境下加热1min，使双链DNA变性，形成单链模板 DNA； – 然后降低反应温度（约56℃）冷却1min，使引物与两条单 链模板DNA发生退火作用并结合在靶DNA区段两端互补序 列位置上； – 最后，72℃左右保温1至数分钟，在DNA聚合酶的作用下， 从引物的3’-端加入脱氧核苷三磷酸，并沿着模板按5’→ 3’ 方向延伸，合成新生DNA互补链。以上循环在同一个PCR 管中进行。反应物加完后，温度由PCR仪调整，程序完成后 可以拿到产物
4th cycle wanted gene 3th cycle Exponential amplification 2nd cycle Ist cycle -35th cycle template DNA 22= 23 4 copics 8 copies 16 copies 32 copies 26-68 billion copies (Andy Vierstracte 1999) 多次循环之后，反应混合物中所含有的双链DNA数 即两条引物位点之间的DNA区段的拷贝数，理论上的最高 值是2”。 10
10 多次循环之后，反应混合物中所含有的双链DNA数， 即两条引物位点之间的DNA区段的拷贝数，理论上的最高 值是2 n