第五章 分子生物学基本研究法 1
1 第五章 分子生物学基本研究法
分子生物学基本研究法 ·5.1基因操作与功能研究 ·5.2蛋白质操作与功能研究 2
2 分子生物学基本研究法 • 5.1 基因操作与功能研究 • 5.2 蛋白质操作与功能研究
5.2蛋白质及RNA相互作用技术 3
3 5.2 蛋白质及RNA相互作用技术
蛋白质相互作用的网络图谱 www.ebiotrade.com 02 3N2 C153
4 蛋白质相互作用的网络图谱
细胞或组织的蛋白质不是杂乱无章的混合物 蛋白质间的相互作用、相互协调是细胞进行 一切代谢活动的基础。蛋白质间的相互作用 及作用方式同样也是蛋白质组研究所面临的 问题。研究蛋白质间的相互作用有多种方法： 常用的如酵母双杂交系统、亲和层析、免疫 沉淀等。 5
5 细胞或组织的蛋白质不是杂乱无章的混合物, 蛋白质间的相互作用、相互协调是细胞进行 一切代谢活动的基础。蛋白质间的相互作用 及作用方式同样也是蛋白质组研究所面临的 问题。研究蛋白质间的相互作用有多种方法, 常用的如酵母双杂交系统、亲和层析、免疫 沉淀等
蛋白质相互作用的重要意义 ·200种蛋白质及2000种组合结构进行解 析后，发现其中三分之一的蛋白质相互组合会 导致疾病，容易导致疾病的蛋白质和其它蛋白 质结合以后也将变得十分活跃，致使发病和病 情恶化 。 绝大多数疾病都是由10万种以上的特定蛋白 质相互作用所致 。 蛋白质一蛋白质相互作用和识别在诸如生物催 化、转运、信号传导、免疫、细胞调控等多种 生命过程起着重要的作用。 6
6 蛋白质相互作用的重要意义 • ２００种蛋白质及２０００种组合结构进行解 析后，发现其中三分之一的蛋白质相互组合会 导致疾病，容易导致疾病的蛋白质和其它蛋白 质结合以后也将变得十分活跃，致使发病和病 情恶化 • 绝大多数疾病都是由１０万种以上的特定蛋白 质相互作用所致 • 蛋白质－蛋白质相互作用和识别在诸如生物催 化、转运、信号传导、免疫、细胞调控等多种 生命过程起着重要的作用
可能参与蛋白质蛋白质间相互作用的结构域 结构域 相关特点 代表蛋白质 Set结 是一种介导蛋白质-蛋白质间相互作用的结构域， 构域 已证明它可以与一种类似双重特异磷酸酶蛋白家族 Rb结合锌指蛋白 作用 Sam结 是进化上保守的蛋白质结合结构域，参与调节各种 构域 真核细胞的发育过程，可凭借SAM结构域为基础形 丝氨酸/酪氨酸蛋白激酶 成同二聚体，或异源二聚体 Tpr结 由34个氨基酸残基构成，分布广泛，常构成脚手架 分裂后期启动复合体亚单 构域 样结构，介导蛋白质作用，且常形成较大的复合体 位(cdc16,cdc23和cdc27) 在高等真核细胞G蛋白B亚单位中有8个随机重复序 WD40结 列，每个由40个氨基酸残基构成，而每一个都含有 凋亡蛋白酶活化因子1 构域 中央的Trp-Asp模块，因而称为WD40,该结构域可 (Apaf) 以介导蛋白质相互作用 SRCR结 多见于细胞表面分子和一些分泌蛋白，功能是参与 构域 配体介导结合 Mac2结合蛋白 由大约100个左右氨基酸构成，含有SH2结构域的蛋 SH2结 白质可以利用SH2结构域与其靶肽上磷酸化的酪氨 构域 基酸残基的高特异性的结合为调节细胞信号转导链， STAT蛋白 这种作用是序列特异的，且是磷酸化依赖的
7 结构域 相关特点 代表蛋白质 Set结 构域 是一种介导蛋白质-蛋白质间相互作用的结构域， 已证明它可以与一种类似双重特异磷酸酶蛋白家族 作用 Rb结合锌指蛋白 Sam结 构域 是进化上保守的蛋白质结合结构域，参与调节各种 真核细胞的发育过程，可凭借SAM结构域为基础形 成同二聚体，或异源二聚体 丝氨酸/酪氨酸蛋白激酶 Tpr结 构域 由34个氨基酸残基构成，分布广泛，常构成脚手架 样结构，介导蛋白质作用，且常形成较大的复合体 分裂后期启动复合体亚单 位（cdc16,cdc23和cdc27） WD40结 构域 在高等真核细胞G蛋白β亚单位中有8个随机重复序 列，每个由40个氨基酸残基构成，而每一个都含有 中央的Trp-Asp模块，因而称为WD40，该结构域可 以介导蛋白质相互作用 凋亡蛋白酶活化因子1 （Apaf） SRCR结 构域 多见于细胞表面分子和一些分泌蛋白，功能是参与 配体介导结合 Mac2结合蛋白 SH2结 构域 由大约100个左右氨基酸构成，含有SH2结构域的蛋 白质可以利用SH2结构域与其靶肽上磷酸化的酪氨 基酸残基的高特异性的结合为调节细胞信号转导链， 这种作用是序列特异的，且是磷酸化依赖的 STAT蛋白 可能参与蛋白质-蛋白质间相互作用的结构域
蛋白质研究技术 ·蛋白质组学 。酵母双杂交 ·蛋白质印记 ·GST pull down ·凝胶阻滞 8
8 蛋白质研究技术 • 蛋白质组学 • 酵母双杂交 • 蛋白质印记 • GST pull down • 凝胶阻滞
5.2.1蛋白质组和蛋白质组学 ·蛋白质组(Proteome)的概念： 1994年Wilkins组合了Protein和genome首次提出了 蛋白质组(Proteome)的概念：一个细胞或一个组 织基因组表达所有蛋白质。 ·蛋白质组学(Proteomics)的概念： ·在大规模水平上研究蛋白质的特征，包括蛋白质的 表达水平，翻译后的修饰，蛋白与蛋白相互作用等， 由此获得蛋白质水平上的关于疾病发生，细胞代谢 等过程的整体而全面的认识
9 5. 2. 1蛋白质组和蛋白质组学 • 蛋白质组（Proteome）的概念： • 1994 年Wilkins 组合了Protein和genome首次提出了 蛋白质组（Proteome）的概念：一个细胞或一个组 织基因组表达所有蛋白质。 • 蛋白质组学（Proteomics）的概念： • 在大规模水平上研究蛋白质的特征，包括蛋白质的 表达水平，翻译后的修饰，蛋白与蛋白相互作用等， 由此获得蛋白质水平上的关于疾病发生，细胞代谢 等过程的整体而全面的认识
1.蛋白质组与基因组的区别 ·是静态的概念。 一个生物体只有一个确定的基因组，即组成该生 物体的所有细胞共享同一个基因组。 ·是动态的概念。 不同组织和不同细胞内的蛋白质组不同 不同发育时期的蛋白质组不同 不同生理状态下的蛋白质组不同 不同环境下的蛋白质组不同 10
10 1. 蛋白质组与基因组的区别 • 基因组 • 是静态的概念。 一个生物体只有一个确定的基因组，即组成该生 物体的所有细胞共享同一个基因组。 • 蛋白质组 • 是动态的概念。 不同组织和不同细胞内的蛋白质组不同 不同发育时期的蛋白质组不同 不同生理状态下的蛋白质组不同 不同环境下的蛋白质组不同