食品论坛 http://bbs.foodmate.net 第十二章 体外试验与生物新技术在毒理学中的应用 第一节 体外试验 毒性试验的目的在于获取一定的数据，为社会需要的外源化学物的安全使用做出判断。 过去利用整体实验动物模型或称体内试验(in vivo test)模型所提供的资料，判断外源化学物 及其制品和混合物等对人类健康是否具有损害作用。体外试验模型(in vitro test)在上述过程 中也起着重要的作用，尤其是机理研究方面。但是，在毒理学研究中整体试验研究的观点仍 占主导地位。目前，此种观点已发生变化，因为：①全世界每年约有千种以上的新化合物作 为商品进入人类的环境。而且在现有的化合物中，还有相当数量没有进行必要的毒理学评价。 在此种情况下，利用经典的整体动物试验取得完整的毒理学资料极为困难。解决此种问题的 重要方向是体外试验。②现有的整体动物毒性试验方法需消耗大量的时间和昂贵的经费，而 体外试验则可节省时间和经费。③动物保护主义运动的兴起，要求尽量减少动物的使用，而 且应当尽量减少痛苦地处理动物。④更重要的是由于生物技术的巨大进步，不仅表现在细胞 组织及器官培养领域，而且在生物分子技术方面，也为毒性试验和研究提供了新的方法和工 具。所以体外试验在毒理学研究中所占的地位日趋重要，甚至有占主导地位的趋势。但也需 指出，体外试验的发展，并不排斥体内试验本身的重要性，两者必须相互补充、相互验证才 能为毒理学研究提供坚实的科学基础。 一、概述 (一) 分类 毒性试验的目的是提供一些适当的资料，以便确定有关化学物的毒理学性质。在有些情 况下，是要决定一种化学物在所预期的条件下使用是否安全，如新药物开发即需要这一评价。 在有些情况下，例如新工业品或日用化学品的开发，必须决定一种新化学物的接触安全限量。 了解体外毒性试验在上述毒理学决策过程中有何意义，对于评价体外毒性试验在毒理学中的 地位极有帮助。可依据体外试验在决策过程中所起的作用将其分为 3 类：①筛选试验。它仅 提供决策过程的最初的资料，还需要进行更权威的试验，无论是整体还是体外试验。②附加 试验。它可为协作部门或法律部门的最终决策过程提供有用的资料，如机理的研究，但仅有 它是不够充分的。③替代试验。它是在大量实验的基础上，使体外毒性试验能替代整体动物 试验，以提供更多的信息。 (二) 基本原理 体外试验的基本原理是所观察到的毒理学效应均是毒物和／或反应活性代谢产物在敏 感性细胞上或敏感细胞内某一分子靶部位作用的结果。如将敏感细胞或某分子靶部位例如 酶，在体外条件下，维持其正常的生理功能，并观察外源化学物对其的影响，即将毒理学中 毒物中毒的启动阶段，在体外条件下，观察其对外源化合物的反应和外源化学物对它的作用。 基于上述原理，体外试验模型取材范围很宽，可取哺乳动物的离体脏器灌流、脏器切片温育、 细胞培养、亚细胞器组份以及提纯的某些酶分子或 DNA 分子等等。 (三) 体外试验的优缺点 体外毒性试验的优点可归纳在表 12—1。 表 12-1 体外毒性试验系统的优点 能控制环境因素 可排除相互作用的系统如免疫系统、神经内分泌系统的影响 每一剂量水平可利用大量的生物样品，如细胞，细胞器等 试验间的误差较少
食品论坛 http://bbs.foodmate.net 第十二章 体外试验与生物新技术在毒理学中的应用 第一节 体外试验 毒性试验的目的在于获取一定的数据，为社会需要的外源化学物的安全使用做出判断。 过去利用整体实验动物模型或称体内试验(in vivo test)模型所提供的资料，判断外源化学物 及其制品和混合物等对人类健康是否具有损害作用。体外试验模型(in vitro test)在上述过程 中也起着重要的作用，尤其是机理研究方面。但是，在毒理学研究中整体试验研究的观点仍 占主导地位。目前，此种观点已发生变化，因为：①全世界每年约有千种以上的新化合物作 为商品进入人类的环境。而且在现有的化合物中，还有相当数量没有进行必要的毒理学评价。 在此种情况下，利用经典的整体动物试验取得完整的毒理学资料极为困难。解决此种问题的 重要方向是体外试验。②现有的整体动物毒性试验方法需消耗大量的时间和昂贵的经费，而 体外试验则可节省时间和经费。③动物保护主义运动的兴起，要求尽量减少动物的使用，而 且应当尽量减少痛苦地处理动物。④更重要的是由于生物技术的巨大进步，不仅表现在细胞 组织及器官培养领域，而且在生物分子技术方面，也为毒性试验和研究提供了新的方法和工 具。所以体外试验在毒理学研究中所占的地位日趋重要，甚至有占主导地位的趋势。但也需 指出，体外试验的发展，并不排斥体内试验本身的重要性，两者必须相互补充、相互验证才 能为毒理学研究提供坚实的科学基础。 一、概述 (一) 分类 毒性试验的目的是提供一些适当的资料，以便确定有关化学物的毒理学性质。在有些情 况下，是要决定一种化学物在所预期的条件下使用是否安全，如新药物开发即需要这一评价。 在有些情况下，例如新工业品或日用化学品的开发，必须决定一种新化学物的接触安全限量。 了解体外毒性试验在上述毒理学决策过程中有何意义，对于评价体外毒性试验在毒理学中的 地位极有帮助。可依据体外试验在决策过程中所起的作用将其分为 3 类：①筛选试验。它仅 提供决策过程的最初的资料，还需要进行更权威的试验，无论是整体还是体外试验。②附加 试验。它可为协作部门或法律部门的最终决策过程提供有用的资料，如机理的研究，但仅有 它是不够充分的。③替代试验。它是在大量实验的基础上，使体外毒性试验能替代整体动物 试验，以提供更多的信息。 (二) 基本原理 体外试验的基本原理是所观察到的毒理学效应均是毒物和／或反应活性代谢产物在敏 感性细胞上或敏感细胞内某一分子靶部位作用的结果。如将敏感细胞或某分子靶部位例如 酶，在体外条件下，维持其正常的生理功能，并观察外源化学物对其的影响，即将毒理学中 毒物中毒的启动阶段，在体外条件下，观察其对外源化合物的反应和外源化学物对它的作用。 基于上述原理，体外试验模型取材范围很宽，可取哺乳动物的离体脏器灌流、脏器切片温育、 细胞培养、亚细胞器组份以及提纯的某些酶分子或 DNA 分子等等。 (三) 体外试验的优缺点 体外毒性试验的优点可归纳在表 12—1。 表 12-1 体外毒性试验系统的优点 能控制环境因素 可排除相互作用的系统如免疫系统、神经内分泌系统的影响 每一剂量水平可利用大量的生物样品，如细胞，细胞器等 试验间的误差较少
食品论坛 http://bbs.foodmate.net 可同时和／或反复多次取样 可做成复杂的互相作用的试验系统，如复合细胞培养等 较为快速和经济 需要较小量的受试化合物 产生较小量的有毒废物 可以利用人体细胞 减少整体动物的使用 其中特别值得一提的优点是体外试验的简便和易于利用人体细胞。体外毒性试验结果可 试验是 毒理学中研究外源化合物对肝脏损伤及代谢的常见方法。在灌流液中 体外灌流可以研究一些化合物的吸收及动力学过程。如 恒温灌流液中，在几小时之内可 部及心均可以制备切片。例如，脑片和心肌条等是将组织片置于恒温的 迅速得出，将减少了解新化学物毒理学资料所需的时间，最终可以缩短从新化学物的合成到 产品进人市场的时间过程。此外，对鉴定毒理学资料有问题的新化学物，可及时终止开发， 减少由资源到产品的投入。在毒理学整体试验中禁止直接进行人体试验。但毒理学试验的目 的是关心人类健康，目前主要是将动物试验结果外推至人类，物种间差异为其不确定因素之 一。在体外试验中，利用人体细胞组织进行试验，可较好地解决物种差异的问题。 体外毒性试验系统的利用在目前尚有不足之处：①体外到体内外推的问题。体外 依据毒性作用的始发阶段及继续发生的分子与细胞反应，其与整体系统有差异，如何将产生 体外毒性的体外浓度与相应体内剂量联系的问题是最终未解决的难题。它需要更好的工具— —预测性毒物代谢动力学来解决，其关键在于发展有生理学基础的毒物代谢动力学模型。另 一方面，体外毒性试验中缺乏毒理学反应的调控因素，如细胞与组织的修复过程和免疫系统 的不同类型细胞间的相互影响等。假如有了更全面的毒理学过程的基础知识，可设计更符合 整体动物模型的体外系统。但现阶段毒理学作为一个学科的发展尚缺少许多重要的资料。② 体外毒性试验难以预测慢性毒性。因为，慢性毒性病理过程的机理所知甚少，缺乏发展体外 试验的理论依据，再者，某些体外系统仍难以达到长期维持生理状态的要求。 二、体外试验系统 (一) 脏器灌流 1. 肝脏灌流 是 加入外源化学物，此外要维持灌流液的pH值、氧含量，还要控制适宜的灌流液流速。一般 是以下腔静脉和门静脉为插管灌流通路，为此应结扎肝动脉、上腔静脉，在恒温条件下灌流。 有报道用肝灌流方法研究四氯化碳及其氢取代衍生物三氯甲烷与二氯甲烷对肝脏毒性，结果 发现随着灌流时间延长(在 4h之内)，灌流液的上清液中K+ 、谷丙转氨酶(SCPT)、山梨醇脱 氢酶(SDH)、谷氨酸脱氢酶(GDH)增加，说明三种化合物对肝细胞均有损伤，而以四氯化碳 为最，且依氯原子被氢取代肝毒减低。需指出肝灌流时间不能过久，以 4h之内为宜，否则 肝细胞的功能与生存不能维持。 2. 肠灌流 利用某一部分小肠 用大鼠，则在麻醉下切腹分离一段小肠，在保持原有血液循环体系下，将肠两端插管，清洗 净肠中内容物，在恒温环境中灌入灌流液。例如有人研究锌的吸收及其影响因素，以大鼠回 肠段为标本，证实锌吸收呈二室模型(肠腔为Ⅰ室、肠粘膜为Ⅱ室)，苯丙氨酸能增加肠腔与 肠粘膜之间锌的交换，且加速向血流的清除过程。 3. 膈肌-膈神经标本 取完整的大鼠膈肌-膈神经置于 维持基本正常的神经肌肉传导。这种标本可用在研究神经毒物对神经传导功能的损伤及强度。 (二) 脏器切片 肝脏、肾脏、脑 孵育液中进行有关试验研究，但需注意切片中的细胞需保持完好的细胞基质和细胞之间的交 流。切片厚度一般在 250μm。不同研究期间有别，如肝切片研究 CytP-450 不应超过 8h， 脑切片一般在 6h 左右。此系统的优点是保持了细胞之间的结构，其操作也比脏器灌流容易
食品论坛 http://bbs.foodmate.net 可同时和／或反复多次取样 可做成复杂的互相作用的试验系统，如复合细胞培养等 较为快速和经济 需要较小量的受试化合物 产生较小量的有毒废物 可以利用人体细胞 减少整体动物的使用 其中特别值得一提的优点是体外试验的简便和易于利用人体细胞。体外毒性试验结果可 试验是 毒理学中研究外源化合物对肝脏损伤及代谢的常见方法。在灌流液中 体外灌流可以研究一些化合物的吸收及动力学过程。如 恒温灌流液中，在几小时之内可 部及心均可以制备切片。例如，脑片和心肌条等是将组织片置于恒温的 迅速得出，将减少了解新化学物毒理学资料所需的时间，最终可以缩短从新化学物的合成到 产品进人市场的时间过程。此外，对鉴定毒理学资料有问题的新化学物，可及时终止开发， 减少由资源到产品的投入。在毒理学整体试验中禁止直接进行人体试验。但毒理学试验的目 的是关心人类健康，目前主要是将动物试验结果外推至人类，物种间差异为其不确定因素之 一。在体外试验中，利用人体细胞组织进行试验，可较好地解决物种差异的问题。 体外毒性试验系统的利用在目前尚有不足之处：①体外到体内外推的问题。体外 依据毒性作用的始发阶段及继续发生的分子与细胞反应，其与整体系统有差异，如何将产生 体外毒性的体外浓度与相应体内剂量联系的问题是最终未解决的难题。它需要更好的工具— —预测性毒物代谢动力学来解决，其关键在于发展有生理学基础的毒物代谢动力学模型。另 一方面，体外毒性试验中缺乏毒理学反应的调控因素，如细胞与组织的修复过程和免疫系统 的不同类型细胞间的相互影响等。假如有了更全面的毒理学过程的基础知识，可设计更符合 整体动物模型的体外系统。但现阶段毒理学作为一个学科的发展尚缺少许多重要的资料。② 体外毒性试验难以预测慢性毒性。因为，慢性毒性病理过程的机理所知甚少，缺乏发展体外 试验的理论依据，再者，某些体外系统仍难以达到长期维持生理状态的要求。 二、体外试验系统 (一) 脏器灌流 1. 肝脏灌流 是 加入外源化学物，此外要维持灌流液的pH值、氧含量，还要控制适宜的灌流液流速。一般 是以下腔静脉和门静脉为插管灌流通路，为此应结扎肝动脉、上腔静脉，在恒温条件下灌流。 有报道用肝灌流方法研究四氯化碳及其氢取代衍生物三氯甲烷与二氯甲烷对肝脏毒性，结果 发现随着灌流时间延长(在 4h之内)，灌流液的上清液中K+ 、谷丙转氨酶(SCPT)、山梨醇脱 氢酶(SDH)、谷氨酸脱氢酶(GDH)增加，说明三种化合物对肝细胞均有损伤，而以四氯化碳 为最，且依氯原子被氢取代肝毒减低。需指出肝灌流时间不能过久，以 4h之内为宜，否则 肝细胞的功能与生存不能维持。 2. 肠灌流 利用某一部分小肠 用大鼠，则在麻醉下切腹分离一段小肠，在保持原有血液循环体系下，将肠两端插管，清洗 净肠中内容物，在恒温环境中灌入灌流液。例如有人研究锌的吸收及其影响因素，以大鼠回 肠段为标本，证实锌吸收呈二室模型(肠腔为Ⅰ室、肠粘膜为Ⅱ室)，苯丙氨酸能增加肠腔与 肠粘膜之间锌的交换，且加速向血流的清除过程。 3. 膈肌-膈神经标本 取完整的大鼠膈肌-膈神经置于 维持基本正常的神经肌肉传导。这种标本可用在研究神经毒物对神经传导功能的损伤及强度。 (二) 脏器切片 肝脏、肾脏、脑 孵育液中进行有关试验研究，但需注意切片中的细胞需保持完好的细胞基质和细胞之间的交 流。切片厚度一般在 250μm。不同研究期间有别，如肝切片研究 CytP-450 不应超过 8h， 脑切片一般在 6h 左右。此系统的优点是保持了细胞之间的结构，其操作也比脏器灌流容易
食品论坛 http://bbs.foodmate.net 不足之处是切片内的细胞易于缺氧，且受试物也不易均匀到达细胞内。 (三) 原代细胞培养 1. 肝细胞原代培养 肝细胞尚未建成传代的细胞株系，多用原代培养。肝细胞原代培 养期 理学研究。如研究化学物的肝脏毒性，一般认为， 或进一步分离 T、B 淋巴细胞进行免疫毒理 细胞有助于研究外源化学物对神经系统损伤的评价与探讨其 电极插入脑细 日龄大鼠心室 压钳法，描记 立了传代培养技术，建成有稳定遗传特征的细胞株系。有的利用细胞培 是肾近曲管是肾脏重要的功能单位，目前已经建立了几 l 细胞系对铅的肾毒进行了研究，包括铅对细 间细胞不分裂、不增殖，但发现基因转录是存在的(培养初期 24h 在 1％或以上)。细胞 原代培养维持生存期 1～2 周，但是 CytP-450 却在 24～28h 活性减少 50％左右。据报道人 肝细胞中 CytP-450 活性稳定性比大鼠强。 利用原代培养的肝细胞可以进行多种毒 用原代肝细胞培养筛检与鉴定是否化学物具有肝脏毒性较为可靠，与体内试验相符合。有报 道以肝细胞损伤后某些酶释放为指征，研究 30 个化学物，结果除少数化学物在肝细胞培养 中表现毒性比体内试验低之外，多数化学物内外毒性符合一致。在体外试验表现毒性较低的 化学物有环已酰胺(cycloheximiole)、溴苯(bromobenzene)和长春新碱(vincristine)等。 2. 巨噬细胞 豚鼠或大鼠都可以肺灌洗方法获取肺巨噬细胞，小鼠可用腹腔灌洗获得 腹腔巨噬细胞，甚至人也可通过肺灌洗得到。巨噬细胞可以用于多种体外试验，例如利用巨 噬细胞的免疫功能检测外源化学物的免疫毒性，又如利用巨噬细胞检测以肺脏为毒理学终点 的外源化学物的中毒毒性和机理。关于后者，有人利用豚鼠肺巨噬细胞原代培养纯化后，研 究二氧化硅(silica，SiO2)致矽肺的机理。 3. 淋巴细胞 多用小动脉脾脏分离淋巴细胞 研究。例如研究镉的免疫毒性，证明镉可以抑制淋巴细胞转化和抑制白细胞介素-2 的产生， 且在一定条件下使淋巴细胞内游离钙浓度增加及钙调素(CaM)活性降低，此为镉的免疫毒性 机理研究提供了线索。 4. 脑细胞 分离的新鲜脑 机理如用小鼠大脑皮质分离、温育后，研究二价阳离子钙、镁、锌、镉等对皮层神经细胞的 损伤，发现这些离子随着浓度的增加，脑神经细胞的电泳迁移率逐渐减慢。 随着脑细胞技术的发展，还可在温育体系中存在外源化学物情况下，用微 胞，通过电信号的变化，更深入地研究外源化学物对神经细胞的功能损伤。 5. 心肌细胞 心肌细胞用于毒理学研究的报道目前还较少。用新生 1～2 肌分离心肌细胞，原代培养 4 天后，将微电极(直径<0.5um)插入细胞内，研究镉对心肌的影 响。经记录、分析各心肌细胞动作电位参数，结果镉在 5～20μmol／L 浓度下，可使心肌 细胞动作电位及最大除极速率显著降低，表明镉对心肌有直接的毒性效应。 此外，将分离的心肌细胞于培养的 24~48h期间，利用膜片钳的连细胞电 心肌细胞上的B型、L型及T型 3 种Ca2＋ 通道的单通道活动。当在培养液中加入 10μmol／L氯化 镉之后，B型通道开放时间缩短 1／3、关闭时间延长 45.1％、通道开放概率下降 55％，L型 通道开放时间缩短 40.7％、关闭时间延长 23.1％、通道开放概率下降 50％，而对T型通道无 影响。进一步证实镉对心肌有毒性效应。 (四) 细胞培养 有些脏器细胞建 养技术建立了特殊的试验方法。 1. 肾细胞 由于肾小管，尤其 种肾近曲管细胞株系用于毒理学研究。例如 1926 年 Hull 等人选育传代培养的 LLC-PK1 细 胞是来源于Hampshire 猪。据报道此株系细胞的各种生物学特征已进行了相当深入的研究(包 括激素应答反应、物质转运特征、细胞的代谢功能和标志等)。此后又建立了从鼬(opossum) 获得的 OK 株系、从兔获得的 RC-SVI 株系。 近年国内利用 300 次传代培养的 LLC—PK 胞的损伤、对细胞膜脂流动性的影响、对细胞膜相变温度的影响、脂质过氧化效应、胞内钙
食品论坛 http://bbs.foodmate.net 不足之处是切片内的细胞易于缺氧，且受试物也不易均匀到达细胞内。 (三) 原代细胞培养 1. 肝细胞原代培养 肝细胞尚未建成传代的细胞株系，多用原代培养。肝细胞原代培 养期 理学研究。如研究化学物的肝脏毒性，一般认为， 或进一步分离 T、B 淋巴细胞进行免疫毒理 细胞有助于研究外源化学物对神经系统损伤的评价与探讨其 电极插入脑细 日龄大鼠心室 压钳法，描记 立了传代培养技术，建成有稳定遗传特征的细胞株系。有的利用细胞培 是肾近曲管是肾脏重要的功能单位，目前已经建立了几 l 细胞系对铅的肾毒进行了研究，包括铅对细 间细胞不分裂、不增殖，但发现基因转录是存在的(培养初期 24h 在 1％或以上)。细胞 原代培养维持生存期 1～2 周，但是 CytP-450 却在 24～28h 活性减少 50％左右。据报道人 肝细胞中 CytP-450 活性稳定性比大鼠强。 利用原代培养的肝细胞可以进行多种毒 用原代肝细胞培养筛检与鉴定是否化学物具有肝脏毒性较为可靠，与体内试验相符合。有报 道以肝细胞损伤后某些酶释放为指征，研究 30 个化学物，结果除少数化学物在肝细胞培养 中表现毒性比体内试验低之外，多数化学物内外毒性符合一致。在体外试验表现毒性较低的 化学物有环已酰胺(cycloheximiole)、溴苯(bromobenzene)和长春新碱(vincristine)等。 2. 巨噬细胞 豚鼠或大鼠都可以肺灌洗方法获取肺巨噬细胞，小鼠可用腹腔灌洗获得 腹腔巨噬细胞，甚至人也可通过肺灌洗得到。巨噬细胞可以用于多种体外试验，例如利用巨 噬细胞的免疫功能检测外源化学物的免疫毒性，又如利用巨噬细胞检测以肺脏为毒理学终点 的外源化学物的中毒毒性和机理。关于后者，有人利用豚鼠肺巨噬细胞原代培养纯化后，研 究二氧化硅(silica，SiO2)致矽肺的机理。 3. 淋巴细胞 多用小动脉脾脏分离淋巴细胞 研究。例如研究镉的免疫毒性，证明镉可以抑制淋巴细胞转化和抑制白细胞介素-2 的产生， 且在一定条件下使淋巴细胞内游离钙浓度增加及钙调素(CaM)活性降低，此为镉的免疫毒性 机理研究提供了线索。 4. 脑细胞 分离的新鲜脑 机理如用小鼠大脑皮质分离、温育后，研究二价阳离子钙、镁、锌、镉等对皮层神经细胞的 损伤，发现这些离子随着浓度的增加，脑神经细胞的电泳迁移率逐渐减慢。 随着脑细胞技术的发展，还可在温育体系中存在外源化学物情况下，用微 胞，通过电信号的变化，更深入地研究外源化学物对神经细胞的功能损伤。 5. 心肌细胞 心肌细胞用于毒理学研究的报道目前还较少。用新生 1～2 肌分离心肌细胞，原代培养 4 天后，将微电极(直径<0.5um)插入细胞内，研究镉对心肌的影 响。经记录、分析各心肌细胞动作电位参数，结果镉在 5～20μmol／L 浓度下，可使心肌 细胞动作电位及最大除极速率显著降低，表明镉对心肌有直接的毒性效应。 此外，将分离的心肌细胞于培养的 24~48h期间，利用膜片钳的连细胞电 心肌细胞上的B型、L型及T型 3 种Ca2＋ 通道的单通道活动。当在培养液中加入 10μmol／L氯化 镉之后，B型通道开放时间缩短 1／3、关闭时间延长 45.1％、通道开放概率下降 55％，L型 通道开放时间缩短 40.7％、关闭时间延长 23.1％、通道开放概率下降 50％，而对T型通道无 影响。进一步证实镉对心肌有毒性效应。 (四) 细胞培养 有些脏器细胞建 养技术建立了特殊的试验方法。 1. 肾细胞 由于肾小管，尤其 种肾近曲管细胞株系用于毒理学研究。例如 1926 年 Hull 等人选育传代培养的 LLC-PK1 细 胞是来源于Hampshire 猪。据报道此株系细胞的各种生物学特征已进行了相当深入的研究(包 括激素应答反应、物质转运特征、细胞的代谢功能和标志等)。此后又建立了从鼬(opossum) 获得的 OK 株系、从兔获得的 RC-SVI 株系。 近年国内利用 300 次传代培养的 LLC—PK 胞的损伤、对细胞膜脂流动性的影响、对细胞膜相变温度的影响、脂质过氧化效应、胞内钙
食品论坛 http://bbs.foodmate.net 浓度变化及形态学改变等，这对铅的肾脏毒性机理提供了依据。 2. 胚胎细胞 利用胚胎细胞体外培养，筛检和研究外源化学物的毒性效应。例如我国 理。 -implantatation 备组织匀浆，是用物理学方法使细胞壁破坏，细胞组成成分与细胞间质 Ache 抑制的强度及特征，大量工作是通过以脑匀浆为 分离和纯化，对于深入研究外源化学物的靶位点、探讨化学物毒 低温离心可制得红细胞膜(或称血 .1mmol／L 铅作用仅 5min，红细胞膜远紫外色 完整细胞的功能，除可利用突触体作 机理，已将人工膜 me) 尤其是肝细胞制备的微粒体常作为毒理学研究的标本，这是由 离 用人胚肺纤维母细胞传代培养人胚肺二倍体细胞，已建立了以 2BS为代表的株系。此株系在 用于筛检致癌物方面做了一些工作。如人胚肺二倍体细胞在 10-7～10-8mol／L苯并(a)芘长达 28～38 代传代培养下，电镜镜检发现细胞核外形不规则、核膜深陷、出现细桥(tiny bridge) 伴分叶核形成、核内胞浆包涵体、核仁巨大或多核等细胞癌变特征。 此外，人胚主动脉平滑肌细胞也可作为标本传代培养研究金属的毒 近十年来，毒理学相继引入啮齿类动物的着床前全胚胎培养技术(pre whole embryo culture)、着床后全胚胎培养技术(post-implantation whole embryo culture)，以及 器官培养如腭板培养、胚胎枝芽体外培养等筛检致畸化学物均取得一些成果。 (五) 组织匀浆 取脏器除血污制 混合形成混悬液。利用匀浆为标本主要是研究外源化学物对细胞酶系统的毒理作用。最常使 用的是脑匀浆、肝匀浆，虽然肺、肾、肠等脏器也可制备匀浆，但是因纤维结缔组织或肌细 胞不易破碎影响匀浆的质量。 文献中有机磷化合物对神经系统 标本，主要是以哺乳动物、啮齿类和昆虫的脑完成的。不少外源化学物的代谢和以肝脏为靶 器官的外源化学物的毒性效应特征与机理是通过肝匀浆进行的。现虽然不少工作已为其它技 术所取代，但是应用匀浆作为过筛与初步研究还是有用的，主要因其制备方法简单、制备周 期很短，且不需复杂的设备。 (六) 亚细胞组分 将细胞中各亚细胞组分 性效应的机理均十分重要。它较组织匀浆优越，排除了匀浆中其它因素的影响。现代毒理学 中使用最多的亚细胞组分是细胞膜、微粒体及线粒体。 1. 细胞膜 人与动物红细胞分离后低渗溶血，高速 影，ghost)。血影为常用的细胞膜标本。此外肺巨噬细胞、肺细胞、突触小体等均可制备膜 标本(先将细胞匀浆破膜，低温差速离心、梯度离心制备)。使用细胞膜可以进行很多的毒理 试验，尤其是在探讨化学物中毒机理方面。 以红细胞膜为例，用人工细胞为标本与 0 谱就出现改变，表明膜蛋白的构象发生了变化。 神经末梢断裂脱落的突触体(synaptosome)具有类似 为标本外，还可进一步制备突触体膜(synaptosome membrane)。实验表明对硫磷在 5×10-9mol ／L水平即可抑制突触体的摄钙功能，并引起突触体膜脂流动性下降。 近年来为纯化实验条件，以利于从分子水平研究外源化学物的毒效应 引入毒理学研究。所谓人工膜，即是以正常细胞膜的膜脂组分，人工合成后用之在—定介质 中形成人工膜。 2. 微粒体(microso 于肝脏代谢酶系主要存在于肝细胞内质网，即肝细胞的亚细胞组分分离后的微粒体中。 有报道TNT在无氧而加人NADPH环境下与微粒体温育，用ESR波谱仪检测出硝基阴 子自由基(Ar-NO2 ￣ )；而在有氧环境中能迅速与分子氧反应生成硝基化合物与超氧阴离子(O2 )。 3. 线粒体(mitochondria) 它是细胞中进行呼吸作用的主要场所。据报道溴氰菊酯 (decamethin)在体外试验中，对线粒体呼吸功能有明显抑制作用。又据报道镉对大鼠肝细胞 线粒体Ca2+-ATPase有抑制作用，且使线粒体膜脂流动性下降。 (七) 酶
食品论坛 http://bbs.foodmate.net 浓度变化及形态学改变等，这对铅的肾脏毒性机理提供了依据。 2. 胚胎细胞 利用胚胎细胞体外培养，筛检和研究外源化学物的毒性效应。例如我国 理。 -implantatation 备组织匀浆，是用物理学方法使细胞壁破坏，细胞组成成分与细胞间质 Ache 抑制的强度及特征，大量工作是通过以脑匀浆为 分离和纯化，对于深入研究外源化学物的靶位点、探讨化学物毒 低温离心可制得红细胞膜(或称血 .1mmol／L 铅作用仅 5min，红细胞膜远紫外色 完整细胞的功能，除可利用突触体作 机理，已将人工膜 me) 尤其是肝细胞制备的微粒体常作为毒理学研究的标本，这是由 离 用人胚肺纤维母细胞传代培养人胚肺二倍体细胞，已建立了以 2BS为代表的株系。此株系在 用于筛检致癌物方面做了一些工作。如人胚肺二倍体细胞在 10-7～10-8mol／L苯并(a)芘长达 28～38 代传代培养下，电镜镜检发现细胞核外形不规则、核膜深陷、出现细桥(tiny bridge) 伴分叶核形成、核内胞浆包涵体、核仁巨大或多核等细胞癌变特征。 此外，人胚主动脉平滑肌细胞也可作为标本传代培养研究金属的毒 近十年来，毒理学相继引入啮齿类动物的着床前全胚胎培养技术(pre whole embryo culture)、着床后全胚胎培养技术(post-implantation whole embryo culture)，以及 器官培养如腭板培养、胚胎枝芽体外培养等筛检致畸化学物均取得一些成果。 (五) 组织匀浆 取脏器除血污制 混合形成混悬液。利用匀浆为标本主要是研究外源化学物对细胞酶系统的毒理作用。最常使 用的是脑匀浆、肝匀浆，虽然肺、肾、肠等脏器也可制备匀浆，但是因纤维结缔组织或肌细 胞不易破碎影响匀浆的质量。 文献中有机磷化合物对神经系统 标本，主要是以哺乳动物、啮齿类和昆虫的脑完成的。不少外源化学物的代谢和以肝脏为靶 器官的外源化学物的毒性效应特征与机理是通过肝匀浆进行的。现虽然不少工作已为其它技 术所取代，但是应用匀浆作为过筛与初步研究还是有用的，主要因其制备方法简单、制备周 期很短，且不需复杂的设备。 (六) 亚细胞组分 将细胞中各亚细胞组分 性效应的机理均十分重要。它较组织匀浆优越，排除了匀浆中其它因素的影响。现代毒理学 中使用最多的亚细胞组分是细胞膜、微粒体及线粒体。 1. 细胞膜 人与动物红细胞分离后低渗溶血，高速 影，ghost)。血影为常用的细胞膜标本。此外肺巨噬细胞、肺细胞、突触小体等均可制备膜 标本(先将细胞匀浆破膜，低温差速离心、梯度离心制备)。使用细胞膜可以进行很多的毒理 试验，尤其是在探讨化学物中毒机理方面。 以红细胞膜为例，用人工细胞为标本与 0 谱就出现改变，表明膜蛋白的构象发生了变化。 神经末梢断裂脱落的突触体(synaptosome)具有类似 为标本外，还可进一步制备突触体膜(synaptosome membrane)。实验表明对硫磷在 5×10-9mol ／L水平即可抑制突触体的摄钙功能，并引起突触体膜脂流动性下降。 近年来为纯化实验条件，以利于从分子水平研究外源化学物的毒效应 引入毒理学研究。所谓人工膜，即是以正常细胞膜的膜脂组分，人工合成后用之在—定介质 中形成人工膜。 2. 微粒体(microso 于肝脏代谢酶系主要存在于肝细胞内质网，即肝细胞的亚细胞组分分离后的微粒体中。 有报道TNT在无氧而加人NADPH环境下与微粒体温育，用ESR波谱仪检测出硝基阴 子自由基(Ar-NO2 ￣ )；而在有氧环境中能迅速与分子氧反应生成硝基化合物与超氧阴离子(O2 )。 3. 线粒体(mitochondria) 它是细胞中进行呼吸作用的主要场所。据报道溴氰菊酯 (decamethin)在体外试验中，对线粒体呼吸功能有明显抑制作用。又据报道镉对大鼠肝细胞 线粒体Ca2+-ATPase有抑制作用，且使线粒体膜脂流动性下降。 (七) 酶
食品论坛 http://bbs.foodmate.net 外源化学物对机体的毒性效应，往往表现某种或某些酶的活性变化上，即可以利用标志 酶活 学物对靶酶作用的特征、性质和机理。此类研 具有双向效应，即在低浓度时 力学分析，有机磷化合物与 ACh 第二节 哺乳动物细胞制备和培养 一、概述 离的细胞是毒理学中使用最广泛和最深入的体外实验系统。体外系统分 优点 性的变化反映化学物所损伤的靶器官。 在体外毒理学中则主要是定量研究外源化 究的基础工作是纯化酶，如获得纯化酶，可在体外精确地控制各种因素，对纯化酶作用的体 征、性质和机理进行研究，如细胞色素 P-450 重组系统。由于酶的提纯技术复杂，故而在一 般毒理学研究中多用脏器匀浆和亚细胞组分作为酶源。虽然这些酶源标本含有多酶成分，但 是只要测定酶活性的条件适宜，完全可以得到良好的结果。 有报道金属离子Cd2+、Hg2+、Pb2+对一些钙调素依赖酶就 可以激活这些酶，而高浓度时又可抑制酶的活性。 文献中早已证明有机磷化合物的主要靶酶是 AChE。经酶动 E 底物 ACh 呈竞争性；即有机磷化合物对 AChE 为竞争性的不可逆性抑制物。但是不 同结构的有机磷化合物对 AChE 的亲合力可有很大差别。 到目前为止，分 离的细胞包括悬浮液中的新鲜游离细胞、原代培养细胞、细胞株、细胞系及复合培养的细胞。 在毒理学中以哺乳动物细胞作为实验动物的替代系统日渐广泛，造成这种趋势的原因有三： 一是来自公众要求减少实验中使用动物数量的压力；二是非整体动物实验可显著地减少常规 整体动物实验所需的高额费用；三是人们越来越不满意实验动物与人体结果之间相关性的缺 乏。利用细胞，可更严格控制实验条件，有效地研究毒性作用的生化机理。表 12-2 详细列 出细胞在毒理学中应用的优缺点。 表 12-2 体外系统——细胞在毒理学中应用的优、缺点 改善效率，减少费用 使用实验动物较少 仅需少量的受试物 性状 接触时间 系统的影响 能，如毒性代谢酶的丧失 的逐渐累积。 较大程度控制细胞族的 直接控制胞外基质、化学物浓度及 排除可能的混淆因素如激素；神经系统或免疫 可从同一实验体系重复取样 缺点 缺少整个器官的形态学观察 选择性丧失整体器官特异性功 缺乏可能的调节影响因素如激素，神经系统或免疫系统， 一般为静态系统，将导致营养物质的逐渐减少和代谢终产物 多为短期试验，对亚慢性或慢性毒性的评估价值不大 表 12-3 毒理学研究中常用细胞 各种物种的成纤维细胞 淋巴母细胞 腹水瘤细胞 淋巴细胞 角质细胞 肝 细 胞 肝癌细胞
食品论坛 http://bbs.foodmate.net 外源化学物对机体的毒性效应，往往表现某种或某些酶的活性变化上，即可以利用标志 酶活 学物对靶酶作用的特征、性质和机理。此类研 具有双向效应，即在低浓度时 力学分析，有机磷化合物与 ACh 第二节 哺乳动物细胞制备和培养 一、概述 离的细胞是毒理学中使用最广泛和最深入的体外实验系统。体外系统分 优点 性的变化反映化学物所损伤的靶器官。 在体外毒理学中则主要是定量研究外源化 究的基础工作是纯化酶，如获得纯化酶，可在体外精确地控制各种因素，对纯化酶作用的体 征、性质和机理进行研究，如细胞色素 P-450 重组系统。由于酶的提纯技术复杂，故而在一 般毒理学研究中多用脏器匀浆和亚细胞组分作为酶源。虽然这些酶源标本含有多酶成分，但 是只要测定酶活性的条件适宜，完全可以得到良好的结果。 有报道金属离子Cd2+、Hg2+、Pb2+对一些钙调素依赖酶就 可以激活这些酶，而高浓度时又可抑制酶的活性。 文献中早已证明有机磷化合物的主要靶酶是 AChE。经酶动 E 底物 ACh 呈竞争性；即有机磷化合物对 AChE 为竞争性的不可逆性抑制物。但是不 同结构的有机磷化合物对 AChE 的亲合力可有很大差别。 到目前为止，分 离的细胞包括悬浮液中的新鲜游离细胞、原代培养细胞、细胞株、细胞系及复合培养的细胞。 在毒理学中以哺乳动物细胞作为实验动物的替代系统日渐广泛，造成这种趋势的原因有三： 一是来自公众要求减少实验中使用动物数量的压力；二是非整体动物实验可显著地减少常规 整体动物实验所需的高额费用；三是人们越来越不满意实验动物与人体结果之间相关性的缺 乏。利用细胞，可更严格控制实验条件，有效地研究毒性作用的生化机理。表 12-2 详细列 出细胞在毒理学中应用的优缺点。 表 12-2 体外系统——细胞在毒理学中应用的优、缺点 改善效率，减少费用 使用实验动物较少 仅需少量的受试物 性状 接触时间 系统的影响 能，如毒性代谢酶的丧失 的逐渐累积。 较大程度控制细胞族的 直接控制胞外基质、化学物浓度及 排除可能的混淆因素如激素；神经系统或免疫 可从同一实验体系重复取样 缺点 缺少整个器官的形态学观察 选择性丧失整体器官特异性功 缺乏可能的调节影响因素如激素，神经系统或免疫系统， 一般为静态系统，将导致营养物质的逐渐减少和代谢终产物 多为短期试验，对亚慢性或慢性毒性的评估价值不大 表 12-3 毒理学研究中常用细胞 各种物种的成纤维细胞 淋巴母细胞 腹水瘤细胞 淋巴细胞 角质细胞 肝 细 胞 肝癌细胞
食品论坛 http://bbs.foodmate.net 肾脏髓质和皮质细胞 细胞 肺的各种类型细胞 培养的背根胶质细胞 培养的睾丸细胞 膀胱细胞 心脏细胞 脊髓微血管 脂肪细胞 由于哺乳细胞作为体外实验系统的优越性，在毒理学中，已有许多不同类型细胞应用于 用以 术 设备 5％CO2，95％空气和 99％的相对湿度的条件下，许多细胞可 存活 (4℃)用于存放培养介质，冷柜(—20℃)则存放酶，(如胰蛋白酶) 简单的倒置显微镜，用作日常观察培养中的细胞，以 装置， 温度 160℃以上， 吸原理制成的冲洗装置。金属器械如 瓶皿。特制的塑料瓶皿具有 不能完全被塑料制品取代，除培养皿和培养瓶外，主要还有：①吸 毒理学实验。表 12-3 为毒理学实验中常用的细胞类型，其中有些细胞可来源于人体组织。 利用哺乳动物细胞进行毒理学体外实验有两种方法：一是建立正在迅速生长的细胞株， 观察受试物对整体细胞的一般毒作用和正在分裂组织的毒作用；二是利用已高度分化的 细胞，无论是原代培养或是特定的细胞株，研究受试物对已分化成熟的细胞或其功能的特殊 毒作用； 二、基本技 （一） 仪器与 1. 培养箱 一般来说，在 。故细胞培养的关键设备是CO2培养箱。其基本要求：①精确地温度控制调节，一般在 土 0.5℃，箱内温度的均衡可依赖风扇；②CO2浓度调节，利用CO2传感器监测箱内CO2浓度； 使箱内大气为 5％CO2，95％空气；③箱内湿度，可用水盘来维持。有的细胞培养可以不控 制CO2分压。例如，原代肝细胞培养，可用LeibovitzL-5 介质，不需CO2，而要求敞开培养瓶， 以供给较高的O2分压。 2. 冰箱和冷柜 冰箱 和某些培养介质如谷氨酸和血清。 3. 显微镜 最基本的配置是一台 便依据细胞生长状况，进行调整或对污染进行补救或处理。进行进一步的研究，则需要更高 级的显微镜，例如，相差显微镜或荧光显微镜，并附有照相装置或摄影装置。 4. 超净工作台 在没有无菌操作室的条件下；可用超净工作台。它是一无菌操作 主要是利用鼓风机，驱动空气通过高效滤膜净化后，缓缓通过工作台面，使工作部位构成无 菌环境。它具有占地面积小，操作方便等优点，但它尚难绝对除去病毒类微生物，而且灰尘 过多对净化作用不利，故超净工作台最好安置在清洁无尘的房间。 5. 清洗和消毒设置：培养中所用玻璃器皿可用电热干燥箱消毒，要求 最好使用较大规格的干燥箱，如 650×500×500mm。 器皿的清洗可用超声波洗涤器。吸管的清洗采用虹 解剖刀、虹膜剪、镊子、尖镊、止血钳等可用高压蒸汽消毒。 6. 培养器皿 为了清洗的方便，塑料瓶皿正逐步取代玻璃 透明、平滑、无毒性、有利于细胞生长的优点。主要的塑料瓶皿有；①多孔培养板，其规格 有 4 孔、6 孔、24 孔及 96 孔，它体积小，适于少量细胞或单个细胞克隆的生长；②培养皿， 规格有直径 30mm、60mm及l00mm，与玻璃培养皿相同，尤其有利于集落形成和细胞转化 等试验；③培养瓶，带有螺旋盖塞，规格有 30ml、50ml、l00ml及 500ml，适于在CO2培养 箱中使用；④其它：冻存细胞的塑料安瓿及微量加样器头，后者的规格有 200~1000μ1 和 1 μl~100μl二种。 玻璃器皿在实验室仍 管，它包括刻度吸管和移液管，常用规格有 l0ml，5ml 和 lml；②玻璃瓶，用于配制各种培 养液的储贮存液和血清等，可用生理盐水瓶或血浆瓶代替，规格有 500ml、250ml 和 l00ml；
食品论坛 http://bbs.foodmate.net 肾脏髓质和皮质细胞 细胞 肺的各种类型细胞 培养的背根胶质细胞 培养的睾丸细胞 膀胱细胞 心脏细胞 脊髓微血管 脂肪细胞 由于哺乳细胞作为体外实验系统的优越性，在毒理学中，已有许多不同类型细胞应用于 用以 术 设备 5％CO2，95％空气和 99％的相对湿度的条件下，许多细胞可 存活 (4℃)用于存放培养介质，冷柜(—20℃)则存放酶，(如胰蛋白酶) 简单的倒置显微镜，用作日常观察培养中的细胞，以 装置， 温度 160℃以上， 吸原理制成的冲洗装置。金属器械如 瓶皿。特制的塑料瓶皿具有 不能完全被塑料制品取代，除培养皿和培养瓶外，主要还有：①吸 毒理学实验。表 12-3 为毒理学实验中常用的细胞类型，其中有些细胞可来源于人体组织。 利用哺乳动物细胞进行毒理学体外实验有两种方法：一是建立正在迅速生长的细胞株， 观察受试物对整体细胞的一般毒作用和正在分裂组织的毒作用；二是利用已高度分化的 细胞，无论是原代培养或是特定的细胞株，研究受试物对已分化成熟的细胞或其功能的特殊 毒作用； 二、基本技 （一） 仪器与 1. 培养箱 一般来说，在 。故细胞培养的关键设备是CO2培养箱。其基本要求：①精确地温度控制调节，一般在 土 0.5℃，箱内温度的均衡可依赖风扇；②CO2浓度调节，利用CO2传感器监测箱内CO2浓度； 使箱内大气为 5％CO2，95％空气；③箱内湿度，可用水盘来维持。有的细胞培养可以不控 制CO2分压。例如，原代肝细胞培养，可用LeibovitzL-5 介质，不需CO2，而要求敞开培养瓶， 以供给较高的O2分压。 2. 冰箱和冷柜 冰箱 和某些培养介质如谷氨酸和血清。 3. 显微镜 最基本的配置是一台 便依据细胞生长状况，进行调整或对污染进行补救或处理。进行进一步的研究，则需要更高 级的显微镜，例如，相差显微镜或荧光显微镜，并附有照相装置或摄影装置。 4. 超净工作台 在没有无菌操作室的条件下；可用超净工作台。它是一无菌操作 主要是利用鼓风机，驱动空气通过高效滤膜净化后，缓缓通过工作台面，使工作部位构成无 菌环境。它具有占地面积小，操作方便等优点，但它尚难绝对除去病毒类微生物，而且灰尘 过多对净化作用不利，故超净工作台最好安置在清洁无尘的房间。 5. 清洗和消毒设置：培养中所用玻璃器皿可用电热干燥箱消毒，要求 最好使用较大规格的干燥箱，如 650×500×500mm。 器皿的清洗可用超声波洗涤器。吸管的清洗采用虹 解剖刀、虹膜剪、镊子、尖镊、止血钳等可用高压蒸汽消毒。 6. 培养器皿 为了清洗的方便，塑料瓶皿正逐步取代玻璃 透明、平滑、无毒性、有利于细胞生长的优点。主要的塑料瓶皿有；①多孔培养板，其规格 有 4 孔、6 孔、24 孔及 96 孔，它体积小，适于少量细胞或单个细胞克隆的生长；②培养皿， 规格有直径 30mm、60mm及l00mm，与玻璃培养皿相同，尤其有利于集落形成和细胞转化 等试验；③培养瓶，带有螺旋盖塞，规格有 30ml、50ml、l00ml及 500ml，适于在CO2培养 箱中使用；④其它：冻存细胞的塑料安瓿及微量加样器头，后者的规格有 200~1000μ1 和 1 μl~100μl二种。 玻璃器皿在实验室仍 管，它包括刻度吸管和移液管，常用规格有 l0ml，5ml 和 lml；②玻璃瓶，用于配制各种培 养液的储贮存液和血清等，可用生理盐水瓶或血浆瓶代替，规格有 500ml、250ml 和 l00ml；
食品论坛 http://bbs.foodmate.net ③离心管，规格有 50ml、l0ml 和 5ml，用于细胞洗涤。 7. 液氮贮存器 贮存细胞多用液氮，液氮温度在-196℃，具有经济、省力和能较好保 备自动加水石英玻璃管加热的蒸馏器，具有蒸馏速度快，使用安全等优点。 径为 0.22μl 的滤膜过滤 胞悬液离心处理，以达到细胞洗涤、调节细胞浓度等。 液及生理盐 用于准确调整各种介质及生理盐水的 pH。 使用的溶液，如培养液、消化液、pH 调整液、染液及细胞洗涤液等。 注意下列问题：①容器，应仔 S)等。它具有维持渗 基，它具有丰富的营养物质，对细胞附 简单的 MEM ，还应加入纤维连结素、多聚赖氨酸和胶原等成 素、链霉素及庆 进行传代细胞培养时，为了使细胞脱离生长表面和细胞离散成单个细胞， 养成分稳定和延长贮存时间，配制生理盐溶液，和培养液 持细胞生物学特性的优点。液氮贮存器有 25L 和 50L 两种规格，它与液氮运输瓶，或称杜 瓦瓶不同，因液氮贮存器一般每两周需补充一次液氮。如有需要可配置贮存器和运输瓶。 8. 水纯化装置 细胞培养对水的要求较高，通常要求使用三次蒸馏水配制各种培养液。 对玻璃器皿也应用纯水清洗。但是，在细胞培养中，不宜使用去离子纯水，因其不能有效地 去除有机物。 实验室应配 外购蒸馏水或去离子，应在本实验室重蒸后使用。对水质量应经常检测，如 pH 和电导系数。 同一实验尽量使用同一水源，避免水质量造成结果的差异。 9. 滤过消毒装置 培养介质不能经高压蒸汽消毒，而需通过孔 消毒。滤过消毒装置由抽气泵(水流玻璃抽气泵或真空泵)、安全瓶、抽滤瓶和滤器组成。 10. 一般设备 离心机，用于对细 天平，包括普通台秤、扭力天平和分析天平，用于配制各种培养液、酶消化 水等。 酸度计， 电磁搅拌器，微量加样器等。 (二) 培养用液 指细胞培养中所 培养液的选择取决于细胞生长的要求，故它是维持细胞生存和生长所需的基本溶液，它的主 要成分为平衡盐溶液和适应细胞体外培养的各种溶液。 培养液在制备过程中应严格操作，避免混入杂质。应特别 细认真清洗，必要时须消毒；②水，三次重蒸蒸馏水；③严格选择品质优良的药品；④制备 好的培养介质要标明名称、配制日期及配制者；⑤贮存与消毒。 1. 平衡盐溶液 常用的有 Hanks 液、Eagle 液及磷酸盐缓冲液 (PB 透压、控制酸碱度平衡的作用及供给细胞生存所需的能量和无机盐的成分。它是配制各种培 养介质的基础溶液，也是洗涤细胞的溶液。 2. 小牛血清 是细胞培养中最常见的天然培养 着和保护也有明显的作用。但它有成分较为复杂、个体差异较大、来源也有一定的限制等不 足。弥补个体差异的办法是对血清进行无菌检测和支持生长能力测定后，混合使用。天然培 养基除小牛血清外，还有鸡血浆、鸡胚浸出液、水解乳蛋白和鼠尾胶原等。 3. 合成培养基 系依据天然培养基的成分，用化学物质模拟合成的。如最 Eagle 培养液，包括 12 种必需氨基酸、谷氨酸胺和 8 种维生素。根据需要可添加某些成分， 如碳水化合物(葡萄糖、核糖、脱氧核糖及丙酮酸钠等)、核酸的前体物(嘌呤和嘧啶类化合物) 及氧化还原剂，抗坏血酸、谷胱甘肽等。 如进行无血清培养，除上述营养成分外 分以促进细胞贴壁。有时，还需要加入酶的抑制剂，如大豆胰酶抑制剂。 为了防止由于操作不慎所致的污染，可加入抗生素。常用抗生素有青霉 大霉素等。 4. 消化液 通常使用消化液。常用的消化液有胰蛋白溶液(0.25％或 0.125％)和乙二胺四乙酸二钠 (Na2-EDTA)溶液(0.02％)。 5. 其它 pH调整液，为了营
食品论坛 http://bbs.foodmate.net ③离心管，规格有 50ml、l0ml 和 5ml，用于细胞洗涤。 7. 液氮贮存器 贮存细胞多用液氮，液氮温度在-196℃，具有经济、省力和能较好保 备自动加水石英玻璃管加热的蒸馏器，具有蒸馏速度快，使用安全等优点。 径为 0.22μl 的滤膜过滤 胞悬液离心处理，以达到细胞洗涤、调节细胞浓度等。 液及生理盐 用于准确调整各种介质及生理盐水的 pH。 使用的溶液，如培养液、消化液、pH 调整液、染液及细胞洗涤液等。 注意下列问题：①容器，应仔 S)等。它具有维持渗 基，它具有丰富的营养物质，对细胞附 简单的 MEM ，还应加入纤维连结素、多聚赖氨酸和胶原等成 素、链霉素及庆 进行传代细胞培养时，为了使细胞脱离生长表面和细胞离散成单个细胞， 养成分稳定和延长贮存时间，配制生理盐溶液，和培养液 持细胞生物学特性的优点。液氮贮存器有 25L 和 50L 两种规格，它与液氮运输瓶，或称杜 瓦瓶不同，因液氮贮存器一般每两周需补充一次液氮。如有需要可配置贮存器和运输瓶。 8. 水纯化装置 细胞培养对水的要求较高，通常要求使用三次蒸馏水配制各种培养液。 对玻璃器皿也应用纯水清洗。但是，在细胞培养中，不宜使用去离子纯水，因其不能有效地 去除有机物。 实验室应配 外购蒸馏水或去离子，应在本实验室重蒸后使用。对水质量应经常检测，如 pH 和电导系数。 同一实验尽量使用同一水源，避免水质量造成结果的差异。 9. 滤过消毒装置 培养介质不能经高压蒸汽消毒，而需通过孔 消毒。滤过消毒装置由抽气泵(水流玻璃抽气泵或真空泵)、安全瓶、抽滤瓶和滤器组成。 10. 一般设备 离心机，用于对细 天平，包括普通台秤、扭力天平和分析天平，用于配制各种培养液、酶消化 水等。 酸度计， 电磁搅拌器，微量加样器等。 (二) 培养用液 指细胞培养中所 培养液的选择取决于细胞生长的要求，故它是维持细胞生存和生长所需的基本溶液，它的主 要成分为平衡盐溶液和适应细胞体外培养的各种溶液。 培养液在制备过程中应严格操作，避免混入杂质。应特别 细认真清洗，必要时须消毒；②水，三次重蒸蒸馏水；③严格选择品质优良的药品；④制备 好的培养介质要标明名称、配制日期及配制者；⑤贮存与消毒。 1. 平衡盐溶液 常用的有 Hanks 液、Eagle 液及磷酸盐缓冲液 (PB 透压、控制酸碱度平衡的作用及供给细胞生存所需的能量和无机盐的成分。它是配制各种培 养介质的基础溶液，也是洗涤细胞的溶液。 2. 小牛血清 是细胞培养中最常见的天然培养 着和保护也有明显的作用。但它有成分较为复杂、个体差异较大、来源也有一定的限制等不 足。弥补个体差异的办法是对血清进行无菌检测和支持生长能力测定后，混合使用。天然培 养基除小牛血清外，还有鸡血浆、鸡胚浸出液、水解乳蛋白和鼠尾胶原等。 3. 合成培养基 系依据天然培养基的成分，用化学物质模拟合成的。如最 Eagle 培养液，包括 12 种必需氨基酸、谷氨酸胺和 8 种维生素。根据需要可添加某些成分， 如碳水化合物(葡萄糖、核糖、脱氧核糖及丙酮酸钠等)、核酸的前体物(嘌呤和嘧啶类化合物) 及氧化还原剂，抗坏血酸、谷胱甘肽等。 如进行无血清培养，除上述营养成分外 分以促进细胞贴壁。有时，还需要加入酶的抑制剂，如大豆胰酶抑制剂。 为了防止由于操作不慎所致的污染，可加入抗生素。常用抗生素有青霉 大霉素等。 4. 消化液 通常使用消化液。常用的消化液有胰蛋白溶液(0.25％或 0.125％)和乙二胺四乙酸二钠 (Na2-EDTA)溶液(0.02％)。 5. 其它 pH调整液，为了营
食品论坛 http://bbs.foodmate.net 时，均在临用前加入NaHCO3溶液。常用浓度有 3.7％、5.6％和 7.4%。此外，还有HEPES溶 液，是一种氢离子缓冲剂，能较长时间保持恒定的pH值范围。使用终浓度为 10～15mmol ／L。 染色液：常用的有①苏木精-伊红染色液或称 H.E 染色；②Giemsa 染色液。 固定液； 消毒是最基本的一项工作，它直接影响实验的结果。消毒措施应在细胞 同的细胞培养所用物品，可采用不同的消毒灭菌的方法。一般有两类：一是物理灭 消毒空气、操作表面及一些不宜用其它方法消毒的物品和培养板等， 液。一般要求 15 磅压力下 贮存。加温应到 160℃， 适于大多数培养用液。选择孔径为 0.22μm 的微孔滤膜，过滤除菌效果 适于操作者的皮肤、操作表面和台面、桌椅及墙壁等，常用的消毒剂有来 的：一是观察培养有无变化，以决定是否终止培养，并从冷 的污染有真菌、细菌和支原体等，此外有化学物和非同一种细胞的污染。 或低倍光学显微镜观察，支原体仅能用特别 意下列方面：消毒步骤(如 固定液：常用的有①中性缓冲福尔马林，相当于 10％的福尔马林；②Bouin 氏 ③醋酸甲醇，临用前配制，结合 Giemsa 染色效果较好；④FAA 固定液，由福尔马林、冰醋 酸及 80％酒精组成，用于盖片单层培养的固定。 (三) 消毒技术 在细胞培养中， 培养的每个环节严格执行。细胞培养的微生物污染，包括细菌、真菌及病毒，它们主要来源 于：操作者的粗心；操作表面或周围的环境；培养液及培养器皿的灭菌不彻底或存放时间过 久等。 对不 菌法，即利用紫外线、干热及微孔过滤等；二是化学灭菌法，即利用化学消毒剂。主要消毒 方面法介绍如下： 1. 紫外线 适于 使用方便，效果较好。应注意其可产生臭氧，影响健康。 2. 高压蒸气消毒 它适于金属器械、胶塞、布类及某些培养 20min。或者更简单的，煮沸消毒，其不足是湿度大，不易久存。 3. 干热消毒 适于玻璃器皿，消毒后器皿保持干燥并便于使用 保持 90-120min。 4. 滤过消毒 较佳。 5. 消毒剂 苏儿、新洁尔灭、过氧乙酸及 70％酒精。 三、培养细胞的鉴定 对培养细胞的鉴定有两个目 冻贮存的样品重新建立新的培养细胞；二是培养条件(如培养液)变化，对培养细胞的影响。 因为培养条件的一致性，对于实验结果的可信性有极为重要的影响。对于培养细胞的鉴定包 括污染鉴定、生存指标及细胞性质(如细胞形态、生长特性、染色体数目及结构等)。 (一) 污染鉴定 细胞培养中常见 受到污染的细胞培养可明显地改变生长特性，引起 pH 变化和生长迟缓。污染常常表现为 pH 变化，培养液表面起泡或起膜，培养液中的絮状物及细胞生长表面的斑点，摇动培养器皿可 消失。肉眼见不到的污染可影响细胞的代谢。 1. 鉴定方法 真菌或细菌的污染可用肉眼 的荧光染料如 Hoechst 33258 染色后在光学显微镜下，或用扫描电子显微镜观察。由于用肉 眼无法发现支原体的污染，在细胞培养过程中应经常定期检查，例如每三个月。最简便和最 可靠的检测支原体的方法是用荧光染料染色在显微镜下观察。 2. 处理 基本的良好消毒技术并不一定能防止污染，还应注 高压锅和干热消毒柜)的效果；多层流防护罩的消毒效果；经常检查培养器皿；每个工作者 有自己配制的培养用液，处理受污染的培养用具和环境。对于已污染或怀疑污染的培养用具 均可用 2.5％高氯酸处理。用抗生素对预防或去除细菌污染较为有效。对支原体污染，消除 方法较多，如抗生素、加温及动物体内接种等，但都较为繁琐，且效果不甚满意，最好的办
食品论坛 http://bbs.foodmate.net 时，均在临用前加入NaHCO3溶液。常用浓度有 3.7％、5.6％和 7.4%。此外，还有HEPES溶 液，是一种氢离子缓冲剂，能较长时间保持恒定的pH值范围。使用终浓度为 10～15mmol ／L。 染色液：常用的有①苏木精-伊红染色液或称 H.E 染色；②Giemsa 染色液。 固定液； 消毒是最基本的一项工作，它直接影响实验的结果。消毒措施应在细胞 同的细胞培养所用物品，可采用不同的消毒灭菌的方法。一般有两类：一是物理灭 消毒空气、操作表面及一些不宜用其它方法消毒的物品和培养板等， 液。一般要求 15 磅压力下 贮存。加温应到 160℃， 适于大多数培养用液。选择孔径为 0.22μm 的微孔滤膜，过滤除菌效果 适于操作者的皮肤、操作表面和台面、桌椅及墙壁等，常用的消毒剂有来 的：一是观察培养有无变化，以决定是否终止培养，并从冷 的污染有真菌、细菌和支原体等，此外有化学物和非同一种细胞的污染。 或低倍光学显微镜观察，支原体仅能用特别 意下列方面：消毒步骤(如 固定液：常用的有①中性缓冲福尔马林，相当于 10％的福尔马林；②Bouin 氏 ③醋酸甲醇，临用前配制，结合 Giemsa 染色效果较好；④FAA 固定液，由福尔马林、冰醋 酸及 80％酒精组成，用于盖片单层培养的固定。 (三) 消毒技术 在细胞培养中， 培养的每个环节严格执行。细胞培养的微生物污染，包括细菌、真菌及病毒，它们主要来源 于：操作者的粗心；操作表面或周围的环境；培养液及培养器皿的灭菌不彻底或存放时间过 久等。 对不 菌法，即利用紫外线、干热及微孔过滤等；二是化学灭菌法，即利用化学消毒剂。主要消毒 方面法介绍如下： 1. 紫外线 适于 使用方便，效果较好。应注意其可产生臭氧，影响健康。 2. 高压蒸气消毒 它适于金属器械、胶塞、布类及某些培养 20min。或者更简单的，煮沸消毒，其不足是湿度大，不易久存。 3. 干热消毒 适于玻璃器皿，消毒后器皿保持干燥并便于使用 保持 90-120min。 4. 滤过消毒 较佳。 5. 消毒剂 苏儿、新洁尔灭、过氧乙酸及 70％酒精。 三、培养细胞的鉴定 对培养细胞的鉴定有两个目 冻贮存的样品重新建立新的培养细胞；二是培养条件(如培养液)变化，对培养细胞的影响。 因为培养条件的一致性，对于实验结果的可信性有极为重要的影响。对于培养细胞的鉴定包 括污染鉴定、生存指标及细胞性质(如细胞形态、生长特性、染色体数目及结构等)。 (一) 污染鉴定 细胞培养中常见 受到污染的细胞培养可明显地改变生长特性，引起 pH 变化和生长迟缓。污染常常表现为 pH 变化，培养液表面起泡或起膜，培养液中的絮状物及细胞生长表面的斑点，摇动培养器皿可 消失。肉眼见不到的污染可影响细胞的代谢。 1. 鉴定方法 真菌或细菌的污染可用肉眼 的荧光染料如 Hoechst 33258 染色后在光学显微镜下，或用扫描电子显微镜观察。由于用肉 眼无法发现支原体的污染，在细胞培养过程中应经常定期检查，例如每三个月。最简便和最 可靠的检测支原体的方法是用荧光染料染色在显微镜下观察。 2. 处理 基本的良好消毒技术并不一定能防止污染，还应注 高压锅和干热消毒柜)的效果；多层流防护罩的消毒效果；经常检查培养器皿；每个工作者 有自己配制的培养用液，处理受污染的培养用具和环境。对于已污染或怀疑污染的培养用具 均可用 2.5％高氯酸处理。用抗生素对预防或去除细菌污染较为有效。对支原体污染，消除 方法较多，如抗生素、加温及动物体内接种等，但都较为繁琐，且效果不甚满意，最好的办
食品论坛 http://bbs.foodmate.net 法是弃去，再重新培养。 (二) 生存指标 1. 台盼蓝排斥试验 是判定细胞损伤的快速试验，它还可很方便进行细胞计数。具体 细胞混悬液，加人等量的 0.5％台盼蓝溶液。 染，而未染的细胞为存活细胞。统 酶(LDH)的漏出检测也与染料排斥试验有同样的 NaCl，0.1％TritorX-100 和 0.1％牛血清白蛋白。 ml的蒸馏水。配好后，可 于 4.5ml的 1％NaHCO3，临用前配制。 损伤。例如肝细胞用 50g DH 和 25~200μl 的样品(取决于培养细胞的种 方法 铬的释放，利用51Cr3+可被活细胞吸收，并还原成51Cr3+，留在胞内，而死 胞可能发生某些变化，如细胞与原始细胞的差异逐渐加大。但每一 时，其生长特性的检查较易进行，主要通过测定更换 数目。一般认为， 方法如下： ①取少量 ②放置 1-5min 后，将混合液滴入血细胞计数池内。 ③显微镜下，细胞显蓝色的为死亡细胞，尤其是核深 计出细胞总数后，可计算出细胞存活率。 2. 酶漏出的检测 胞浆酶如乳酸脱氢 灵敏度，同时，可更精确地进行定量，但操作时间较长。 (1) 仪器：分光光度计，最好配有温育(37℃)的装置。 (2) 试剂： 溶液 0.9％ 底物 3.5g K2HPO4，0.45gkH2PO4和 31.0mg丙酮酸钠溶于 450 贮存于-20℃的冰箱内。 NADH，称 42mg，溶 (3) 操作步骤：离心，以适当速度使所有细胞沉淀而不引起细胞 ×2min。取出上清，放人干净试管，并保持 0℃以下备用，加入等量的溶液至细胞沉淀，用 漩涡混合器混合。保持在 0℃以下，备用。 取一比色杯，加 3ml 底物，50μl 的 NA 类)，迅速混合后，在 340nm 处进行比色。整个过程应在 37℃条件下完成。计算上清或沉淀 (即溶液中细胞)的 LDH 活性，漏出率表示方法为培养液中 LDH 活性占总的 LDH 活性的百 分率。 3. 其它 亡细胞则释放51Cr3+。用r-计数器检测无细胞上清液中51Cr3+的量，即可判断培养细胞的存活 情况。还有贴壁效率和ATP含量等指标可鉴定培养细胞的存活情况。 (三) 细胞特性鉴定 在连续培养期间，细 细胞株具有一系列细胞特性“正常”的参数，可供鉴定评价。例如，形态学参数、生长特性 及染色体分析等皆为细胞特性鉴定的指标，其中形态学与生长特性的测定相对容易进行。 1. 形态学检查 评价细胞正常与否的最简单方法是形态学检查；应在每次传代时用倒 置显微镜进行观察，最好拍照记录细胞的形态。要详细地描述每一细胞系的形态。若因限于 篇幅，不能详述，可掌握两个述语，即“成纤维样”和“上皮样”细胞，即可描述所观察的 细胞。成纤维样细胞系指在单层细胞培养时，细胞的长度要大于其宽度的两倍的细胞，而上 皮样细胞系指呈多角形的细胞。 2. 生长特性的检查 在培养细胞 培养液的时间和传代的时间来完成。虽然不同的细胞其传代时间和更换培养液的时间不同， 但对于每一细胞系应该较为固定，因为主要取决于细胞生长速率。 每个细胞系均有其自己的生长循环周期，这取决于接种进行培养的细胞 在培养中的细胞，是处于不同的生长阶段。进行生长分析，应观察单个细胞的生长速率。在 实际工作中，是测定克隆效率或者接种效率。克隆效率是测定由单个细胞生长的克隆。接种 效率是测定植入小量细胞(2~50 个／cm 2 )后，等生长至可分辨的小克隆时，经用生理盐水洗 涤，甲醇固定，吉姆沙染色(2ml／25cm2 )和清水冲洗后，计算克隆数
食品论坛 http://bbs.foodmate.net 法是弃去，再重新培养。 (二) 生存指标 1. 台盼蓝排斥试验 是判定细胞损伤的快速试验，它还可很方便进行细胞计数。具体 细胞混悬液，加人等量的 0.5％台盼蓝溶液。 染，而未染的细胞为存活细胞。统 酶(LDH)的漏出检测也与染料排斥试验有同样的 NaCl，0.1％TritorX-100 和 0.1％牛血清白蛋白。 ml的蒸馏水。配好后，可 于 4.5ml的 1％NaHCO3，临用前配制。 损伤。例如肝细胞用 50g DH 和 25~200μl 的样品(取决于培养细胞的种 方法 铬的释放，利用51Cr3+可被活细胞吸收，并还原成51Cr3+，留在胞内，而死 胞可能发生某些变化，如细胞与原始细胞的差异逐渐加大。但每一 时，其生长特性的检查较易进行，主要通过测定更换 数目。一般认为， 方法如下： ①取少量 ②放置 1-5min 后，将混合液滴入血细胞计数池内。 ③显微镜下，细胞显蓝色的为死亡细胞，尤其是核深 计出细胞总数后，可计算出细胞存活率。 2. 酶漏出的检测 胞浆酶如乳酸脱氢 灵敏度，同时，可更精确地进行定量，但操作时间较长。 (1) 仪器：分光光度计，最好配有温育(37℃)的装置。 (2) 试剂： 溶液 0.9％ 底物 3.5g K2HPO4，0.45gkH2PO4和 31.0mg丙酮酸钠溶于 450 贮存于-20℃的冰箱内。 NADH，称 42mg，溶 (3) 操作步骤：离心，以适当速度使所有细胞沉淀而不引起细胞 ×2min。取出上清，放人干净试管，并保持 0℃以下备用，加入等量的溶液至细胞沉淀，用 漩涡混合器混合。保持在 0℃以下，备用。 取一比色杯，加 3ml 底物，50μl 的 NA 类)，迅速混合后，在 340nm 处进行比色。整个过程应在 37℃条件下完成。计算上清或沉淀 (即溶液中细胞)的 LDH 活性，漏出率表示方法为培养液中 LDH 活性占总的 LDH 活性的百 分率。 3. 其它 亡细胞则释放51Cr3+。用r-计数器检测无细胞上清液中51Cr3+的量，即可判断培养细胞的存活 情况。还有贴壁效率和ATP含量等指标可鉴定培养细胞的存活情况。 (三) 细胞特性鉴定 在连续培养期间，细 细胞株具有一系列细胞特性“正常”的参数，可供鉴定评价。例如，形态学参数、生长特性 及染色体分析等皆为细胞特性鉴定的指标，其中形态学与生长特性的测定相对容易进行。 1. 形态学检查 评价细胞正常与否的最简单方法是形态学检查；应在每次传代时用倒 置显微镜进行观察，最好拍照记录细胞的形态。要详细地描述每一细胞系的形态。若因限于 篇幅，不能详述，可掌握两个述语，即“成纤维样”和“上皮样”细胞，即可描述所观察的 细胞。成纤维样细胞系指在单层细胞培养时，细胞的长度要大于其宽度的两倍的细胞，而上 皮样细胞系指呈多角形的细胞。 2. 生长特性的检查 在培养细胞 培养液的时间和传代的时间来完成。虽然不同的细胞其传代时间和更换培养液的时间不同， 但对于每一细胞系应该较为固定，因为主要取决于细胞生长速率。 每个细胞系均有其自己的生长循环周期，这取决于接种进行培养的细胞 在培养中的细胞，是处于不同的生长阶段。进行生长分析，应观察单个细胞的生长速率。在 实际工作中，是测定克隆效率或者接种效率。克隆效率是测定由单个细胞生长的克隆。接种 效率是测定植入小量细胞(2~50 个／cm 2 )后，等生长至可分辨的小克隆时，经用生理盐水洗 涤，甲醇固定，吉姆沙染色(2ml／25cm2 )和清水冲洗后，计算克隆数
食品论坛 http://bbs.foodmate.net 接种效率= × %100 植入细胞数目 克隆数目 一般认为，传代效率小于 30 表示生长不正常。此项指标可用于正常细胞生长的监测， 贮存细胞的复苏及鉴定每一批血清等。 在细胞培养试验中，一般监测指标可采用形态学、生长模式及接种效率即可。 3. 其它检查 除上述指标外，在细胞培养时，可进行染色体分析，包括染色体的数目 和结构以及 DNA、RNA 和蛋白质的含量测定，来判断培养细胞的特性。 七、细胞培养在食品毒理学中应用 利用培养的细胞，可进行多方面的毒理学研究，如表 12-4 中所列。 表 12-4 培养细胞用于毒理学体外实验的实例 一般毒性：主要为急性细胞毒性 器官特异性毒性：利用有代表性细胞类型如肝细胞、肾近曲小管细胞、神经细胞及心肌细胞等： 毒作用机理 生物转化、毒性代谢产物的形成 遗传毒性，如程序外 DNA 合成测定 繁殖毒性 联合毒性 不同物种间的比较毒性 光敏毒性 以下重点讨论毒理学中应用细胞培养技术时应注意的几个问题。 1. 细胞类型的选择 细胞类型的选择取决于实验的目的。一般性筛选系列化合物的一 般毒性时，应选择生长迅速且易于处理的细胞系。机理研究多不用细胞系，因为培养的细胞 会逐渐丧失许多功能，如细胞色素 P-450 的活性。 细胞培养的优点之一是可选择来源于人体的组织细胞，可减少试验结果的物种差异。成 纤维样细胞和上皮样细胞均可选用。常用的细胞系有 CHO、V79、Hela、BHR 及 L929 等。 2. 代谢活化 细胞经 8-24h 培养后，细胞色素 P-450 活性将迅速下降。而在 CHO 细胞 系中，涉及代谢活化的酶活性下降。所以，培养细胞对需代谢活化的化学物不能够敏感。 解决这个问题有两个方法，一是加 S9，二是与原代肝细胞复合培养。S9 需要 NADPH 才具有代谢活化作用，故在培养液中应加有 NADPH 生成系统(葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡萄 糖-6-磷酸和 NADP)。与原代肝细胞进行复合培养时也可采用其它不同的细胞系，如 V79、 中国地鼠肺成纤维细胞和人成纤维细胞。 3. 受试物的给予许多 受试物由于水溶性较低，在加入培养液前，常需溶于有机溶剂 有机溶剂对细胞有损害作用，故应限制有机溶剂浓度在 1％以下。在试验中可设立适当的有 机溶剂对照和培养液对照。例如，需用 S9 混合液；有机溶剂的浓度应限制在 0.1％，因为 许多有机溶剂可抑制酶的活性。不溶性的受试物如，颗粒和油剂在给予培养液时仍存在问题。 一般是混悬于培养液或者先溶于溶剂，再加人培养液，但有时会产生不同的毒性结果。例如， 黄樟醚和降脂乙醚等油性受试物，假如使用高剂量时将有某些塑料培养皿成分的溶出，则所 观察到的毒性作用可能部分地是由于某些塑料成分所致。 4. 设立阳性对照组 实验系统的重现性应该用阳性对照物来检查。阳性对照物指采用 经过研究或公认有特定作用的化学物。例如在代谢活化研究中常选择环磷酰胺为阳性对照 物，在细胞毒性筛检时可选二甲基环己基烃乙基戊二酰亚胺和二硝基苯酚为阳性对照物。 5. 毒性指标的选择 依据不同的试验目的和试验条件，可选择不同的观察指标。下列 指标在毒理学中经常采用： (1) IC50：即经 3 天培养后，引起生长速率减至对照组一半时所需受试物的浓度生长速
食品论坛 http://bbs.foodmate.net 接种效率= × %100 植入细胞数目 克隆数目 一般认为，传代效率小于 30 表示生长不正常。此项指标可用于正常细胞生长的监测， 贮存细胞的复苏及鉴定每一批血清等。 在细胞培养试验中，一般监测指标可采用形态学、生长模式及接种效率即可。 3. 其它检查 除上述指标外，在细胞培养时，可进行染色体分析，包括染色体的数目 和结构以及 DNA、RNA 和蛋白质的含量测定，来判断培养细胞的特性。 七、细胞培养在食品毒理学中应用 利用培养的细胞，可进行多方面的毒理学研究，如表 12-4 中所列。 表 12-4 培养细胞用于毒理学体外实验的实例 一般毒性：主要为急性细胞毒性 器官特异性毒性：利用有代表性细胞类型如肝细胞、肾近曲小管细胞、神经细胞及心肌细胞等： 毒作用机理 生物转化、毒性代谢产物的形成 遗传毒性，如程序外 DNA 合成测定 繁殖毒性 联合毒性 不同物种间的比较毒性 光敏毒性 以下重点讨论毒理学中应用细胞培养技术时应注意的几个问题。 1. 细胞类型的选择 细胞类型的选择取决于实验的目的。一般性筛选系列化合物的一 般毒性时，应选择生长迅速且易于处理的细胞系。机理研究多不用细胞系，因为培养的细胞 会逐渐丧失许多功能，如细胞色素 P-450 的活性。 细胞培养的优点之一是可选择来源于人体的组织细胞，可减少试验结果的物种差异。成 纤维样细胞和上皮样细胞均可选用。常用的细胞系有 CHO、V79、Hela、BHR 及 L929 等。 2. 代谢活化 细胞经 8-24h 培养后，细胞色素 P-450 活性将迅速下降。而在 CHO 细胞 系中，涉及代谢活化的酶活性下降。所以，培养细胞对需代谢活化的化学物不能够敏感。 解决这个问题有两个方法，一是加 S9，二是与原代肝细胞复合培养。S9 需要 NADPH 才具有代谢活化作用，故在培养液中应加有 NADPH 生成系统(葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡萄 糖-6-磷酸和 NADP)。与原代肝细胞进行复合培养时也可采用其它不同的细胞系，如 V79、 中国地鼠肺成纤维细胞和人成纤维细胞。 3. 受试物的给予许多 受试物由于水溶性较低，在加入培养液前，常需溶于有机溶剂 有机溶剂对细胞有损害作用，故应限制有机溶剂浓度在 1％以下。在试验中可设立适当的有 机溶剂对照和培养液对照。例如，需用 S9 混合液；有机溶剂的浓度应限制在 0.1％，因为 许多有机溶剂可抑制酶的活性。不溶性的受试物如，颗粒和油剂在给予培养液时仍存在问题。 一般是混悬于培养液或者先溶于溶剂，再加人培养液，但有时会产生不同的毒性结果。例如， 黄樟醚和降脂乙醚等油性受试物，假如使用高剂量时将有某些塑料培养皿成分的溶出，则所 观察到的毒性作用可能部分地是由于某些塑料成分所致。 4. 设立阳性对照组 实验系统的重现性应该用阳性对照物来检查。阳性对照物指采用 经过研究或公认有特定作用的化学物。例如在代谢活化研究中常选择环磷酰胺为阳性对照 物，在细胞毒性筛检时可选二甲基环己基烃乙基戊二酰亚胺和二硝基苯酚为阳性对照物。 5. 毒性指标的选择 依据不同的试验目的和试验条件，可选择不同的观察指标。下列 指标在毒理学中经常采用： (1) IC50：即经 3 天培养后，引起生长速率减至对照组一半时所需受试物的浓度生长速