第十八章全自动DNA测序仪 和蛋白质自动测序仪
第十八章 全自动DNA测序仪 和蛋白质自动测序仪
前言 ·了解生命现象、解释疾病的发生、诊断和 治疗疾病，是生命科学的核心内容之一 。核酸和蛋白质是控制生命过程的两种重要 大分子，其结构或功能异常是导致遗传性 疾病或遗传相关性疾病的主要因素或相关 因素，是生命科学研究的主要对象
◈ ⊃ ► ◄ ■ 前 言 ❖了解生命现象、解释疾病的发生、诊断和 治疗疾病，是生命科学的核心内容之一 ❖核酸和蛋白质是控制生命过程的两种重要 大分子，其结构或功能异常是导致遗传性 疾病或遗传相关性疾病的主要因素或相关 因素，是生命科学研究的主要对象
前言 冬核酸分子携带生命活动的全套信息，其基 本结构一核苷酸的线性排列构成它的一级 结构 蛋白质的一级结构是指构成蛋白质的基本 单位一氨基酸的排列顺序，研究蛋白质的 一 级结构是了解蛋白质功能的基础
◈ ⊃ ► ◄ ■ 前 言 ❖核酸分子携带生命活动的全套信息，其基 本结构―核苷酸的线性排列构成它的一级 结构 ❖蛋白质的一级结构是指构成蛋白质的基本 单位－氨基酸的排列顺序，研究蛋白质的 一级结构是了解蛋白质功能的基础
本章内容提要 第一节全自动DNA测序仪 一、工作原理 (一)双脱氧链末端终止法测序原理 (二)新生链的荧光标记原理 (三)荧光标记DNA的检测原理 二、全自动DNA测序仪的结构与功能 （一)仪器的组成 (二)仪器各组成部分的功能 三、全自动DNA测序仪的常见故障及维护 (一)毛细管电泳型DNA测序仪的常见故障及维护 (二)平板电泳型DNA测序仪的常见故障及维护 四、全自动DNA测序仪的进展 五、全自动DNA测序仪的主要应用 第二节蛋白质自动测序仪 一、蛋白质测序仪的工作原理 三。蛋白质测序仪的结构及其各部件的功能 三、蛋白质测序仪的主要应用 本童小结
◈ ⊃ ► ◄ ■ 本章内容提要 第一节 全自动DNA测序仪 一、工作原理 （一）双脱氧链末端终止法测序原理 （二）新生链的荧光标记原理 （三）荧光标记DNA的检测原理 二、全自动DNA测序仪的结构与功能 （一）仪器的组成 （二）仪器各组成部分的功能 三、全自动DNA测序仪的常见故障及维护 （一）毛细管电泳型DNA测序仪的常见故障及维护 （二）平板电泳型DNA测序仪的常见故障及维护 四、全自动DNA测序仪的进展 五、全自动DNA测序仪的主要应用 第二节 蛋白质自动测序仪 一、蛋白质测序仪的工作原理 二、蛋白质测序仪的结构及其各部件的功能 三、蛋白质测序仪的主要应用 本章小结
第一节全自动DNA测序仪 DNA测序 核苷酸序列 冬早期：小片段重叠法 通过测定RNA序列来推测DNA序列 缺点：既费时又不准确 20世纪80年代以后：DNA自动测序仪 Sanger双脱氧链末端终止法 Maxam-Gilber化学降解法 优点：操作简单、安全、快速、准确
◈ ⊃ ► ◄ ■ 第一节 全自动DNA测序仪 DNA测序 核苷酸序列 ❖ 早期：小片段重叠法 通过测定RNA序列来推测DNA序列 缺点：既费时又不准确 ❖ 20世纪80年代以后 ：DNA自动测序仪 Sanger双脱氧链末端终止法 Maxam-Gilber化学降解法 优点：操作简单、安全、快速、准确
一、全自动DNA测序仪工作原理 Sanger双脱氧链末端终止法 Maxam-Gilber化学降解法 都是根据在某一固定的点开始核苷酸链的延伸，随机在某 一个特定的碱基处终止，产生A、T、C、G四组不同长度 的一系列核苷酸链，在变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳进行片 段的分离和检测，从而获得DNA序列 双脱氧链末端终止法更简便和更适合于光学自动探测，故 在全自动DNA测序仪中应用广泛
◈ ⊃ ► ◄ ■ 一、全自动DNA测序仪工作原理 Sanger双脱氧链末端终止法 Maxam-Gilber化学降解法 ❖ 都是根据在某一固定的点开始核苷酸链的延伸，随机在某 一个特定的碱基处终止，产生A、T、C、G四组不同长度 的一系列核苷酸链，在变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳进行片 段的分离和检测，从而获得DNA序列 ❖ 双脱氧链末端终止法更简便和更适合于光学自动探测，故 在全自动DNA测序仪中应用广泛
(一)双脱氧链末端终止法测序原理 利用DNA的体外合成过程一一聚合酶链反应 (polymerase chain reaction,PCR) DNA聚合酶的催化 以目的DNA为模板 单核苷酸聚合形成新DNA链 按照碱基互补配对原则 冬在引物的引导下
◈ ⊃ ► ◄ ■ （一）双脱氧链末端终止法测序原理 ❖ 利用DNA的体外合成过程－－聚合酶链反应 （polymerase chain reaction, PCR） ❖ DNA聚合酶的催化 ❖ 以目的DNA为模板 ❖ 按照碱基互补配对原则 ❖ 在引物的引导下 单核苷酸聚合形成新DNA链
(一)双脱氧链末端终止法测序原理 ·普通的PCR反应体系中，加入 的核苷酸单体为4种2'-脱氧核苷 Base 三磷酸（dATP,dCTP,dGTP, dTTP) N Base Base HO 图18-1dNTP结构示意图
◈ ⊃ ► ◄ ■ （一）双脱氧链末端终止法测序原理 • 普通的PCR反应体系中，加入 的核苷酸单体为 4种2’-脱氧核苷 三磷酸（dATP，dCTP，dGTP， dTTP） 图18-1 dNTP结构示意图
(一)双脱氧链末端终止法测序原理 。 测序反应体系中，加入的核苷酸 单体为2,3'-双脱氧核苷三磷酸 (ddNTP) NH Base 0p8 Base 图18-2 ddNTP结构示意图
◈ ⊃ ► ◄ ■ （一）双脱氧链末端终止法测序原理 • 测序反应体系中，加入的核苷酸 单体为 2’,3’-双脱氧核苷三磷酸 （ddNTP） 图18-2 ddNTP结构示意图
(一)双脱氧链末端终止法测序原理 与dNTP相比，ddNTP在脱氧核糖的位置上缺少一 个羟基，反应过程中虽然可以在DNA聚合酶作用下， 通过其磷酸基团与正在延伸的DNA链的末端脱氧核糖 -OH发生反应，形成磷酸二酯键而掺入到DNA链中， 但它们本身没有-OH,不能同后续的dNTP形成磷酸 二酯键，从而使正在延伸的DNA链在此终止
◈ ⊃ ► ◄ ■ （一）双脱氧链末端终止法测序原理 与dNTP相比，ddNTP在脱氧核糖的位置上缺少一 个羟基，反应过程中虽然可以在DNA聚合酶作用下， 通过其磷酸基团与正在延伸的DNA链的末端脱氧核糖 -OH发生反应，形成磷酸二酯键而掺入到DNA链中， 但它们本身没有-OH，不能同后续的dNTP形成磷酸 二酯键，从而使正在延伸的DNA链在此终止