第一节：蛋白质组学概述 000八 蛋白质组学概念 蛋白质组学”(proteomics)和“蛋白质组”(proteome)与“基 因组学”(genomics)和“基因组”(genome)相对应，意为“一个 基因组、一种生物或一种细胞、组织所表达的全套蛋白质。” 2
蛋白质组学概念 第一节：蛋白质组学概述 2 “蛋白质组学”(proteomics) 和“蛋白质组” (proteome) 与“基 因组学”(genomics) 和 “基因组” (genome) 相对应，意为“一个 基因组、一种生物或一种细胞、组织所表达的全套蛋白质
第一节：蛋白质组学概述 00以一、蛋白质组学的产生 蛋白质是生理功能的执行者，是生命现象的直接体现者，对蛋白质结构和功能 的研究将直接阐明生命在生理或病理条件下的变化机制。蛋白质本身的存在 形式和活动规律，如翻译后修饰、蛋白质间相互作用及蛋白质构象等问题， 仍依赖对蛋白质的研究来解决。蛋白质组学的研究可望提供精确、详细的有 关细胞或组织状况的分子描述。因为诸如蛋白质合成、降解、加工、修饰的 调控过程只有通过对蛋白质的直接分析才能揭示。 2001年国际权威杂志Science把蛋白质组学列为六大研究热点之一，仅次于干细 胞研究，名列第二 3
一、蛋白质组学的产生 第一节：蛋白质组学概述 3 蛋白质是生理功能的执行者，是生命现象的直接体现者，对蛋白质结构和功能 的研究将直接阐明生命在生理或病理条件下的变化机制。蛋白质本身的存在 形式和活动规律，如翻译后修饰、蛋白质间相互作用及蛋白质构象等问题， 仍依赖对蛋白质的研究来解决。蛋白质组学的研究可望提供精确、详细的有 关细胞或组织状况的分子描述。因为诸如蛋白质合成、降解、加工、修饰的 调控过程只有通过对蛋白质的直接分析才能揭示。 2001年国际权威杂志Science把蛋白质组学列为六大研究热点之一，仅次于干细 胞研究，名列第二
第一节：蛋白质组学概述 0似二、蛋白质组学研究的新进展 1.蛋白质的分离与鉴定 ●双向凝胶电泳(two-dimension electrophoresis,2-DE) ●色谱技术和分离提取技术 ●蛋白质芯片和抗体芯片以及免疫功沉淀技术 2.蛋白质互作或蛋白质复合体研究 3.蛋白质翻译后修饰分析 ·标记技术、质谱技术、特定抗体技术、特定染色剂技术 4.蛋白质功能鉴定研究 ·基因敲除或基因反义技术 5.蛋白质复合体整体结构分析 ·限制性蛋白酶水解技术 4
二、蛋白质组学研究的新进展 第一节：蛋白质组学概述 4 1. 蛋白质的分离与鉴定 ⚫ 双向凝胶电泳(two-dimension electrophoresis, 2-DE) ⚫ 色谱技术和分离提取技术 ⚫ 蛋白质芯片和抗体芯片以及免疫功沉淀技术 2. 蛋白质互作或蛋白质复合体研究 3. 蛋白质翻译后修饰分析 • 标记技术、质谱技术、特定抗体技术、特定染色剂技术 4. 蛋白质功能鉴定研究 • 基因敲除或基因反义技术 5. 蛋白质复合体整体结构分析 • 限制性蛋白酶水解技术
第二节：蛋白质的大规模分离鉴定技术 例八一、蛋白质二维电泳-质谱技术 (一)蛋白质二维电泳技术 根据蛋白质的等电点和分子质量的差异，连续进行成垂直方向的两次电泳将其分离。 二维电泳一次可以分离几千个蛋白质。用固定化pH梯度(immobilized pH gradient, PG)干胶条代替两性电解质，加上与干胶条相配套的电泳仪进行第一向等电聚焦， 不仅极大提高了电泳的分辨率，也提高了结果的可重复性。 First Dimension: Second Dimension: Denaturing isoelectric SDS polyacrylamide focusing in presence gel electrophoresis of urea.Nonidet NP-40 gel rod rebuttered in SDS buffer In discontinuous gradient gel in vertical gel rod sample oH 3 pH 10 PH 10 PH 3 Separation acc.to Separation acc.to Isoelectric Points (charge) Molecular Weight(mass) 5
一、蛋白质二维电泳-质谱技术 第二节：蛋白质的大规模分离鉴定技术 5 （一）蛋白质二维电泳技术 根据蛋白质的等电点和分子质量的差异，连续进行成垂直方向的两次电泳将其分离。 二维电泳一次可以分离几千个蛋白质。用固定化pH梯度(immobilized pH gradient, IPG) 干胶条代替两性电解质，加上与干胶条相配套的电泳仪进行第一向等电聚焦， 不仅极大提高了电泳的分辨率，也提高了结果的可重复性
第二节：蛋白质的大规模分离鉴定技术 例八一、蛋白质二维电泳-质谱技术 (一)蛋白质二维电泳技术 蛋白质是两性电解质，在不同H下所带的电荷不同：等电聚焦EF蛋白质的分子量 (a)Primary structure 和分子形状不同，电泳迁移率不同：SDS-PAGE。 (b)Secondary structure Amino Acid H -C- 0-H H-C-H Hydrogen bonds between a helix amino acids at different H Pieated sheet (c)Tertiary structure (d)Quaternary structure Heme R Heme group B polypeptide 6
一、蛋白质二维电泳-质谱技术 第二节：蛋白质的大规模分离鉴定技术 6 （一）蛋白质二维电泳技术 蛋白质是两性电解质，在不同PH下所带的电荷不同：等电聚焦IEF蛋白质的分子量 和分子形状不同，电泳迁移率不同：SDS-PAGE
第二节：蛋白质的大规模分离鉴定技术 例八一、蛋白质二维电泳-质谱技术 (二)质谱技术 离子化：两种软电离技术 基质辅助激光解吸电离(matrix--assisted laser desorption/ionization, MALDI) 和电喷雾 电离（electro-spray ionization, ESI) 337 nm UV laser Fluid(no salt) 000 0。 cyano-hydroxy Gold tip needle cinnamic acid MALDI ESI
一、蛋白质二维电泳-质谱技术 第二节：蛋白质的大规模分离鉴定技术 7 （二）质谱技术 离子化：两种软电离技术 基质辅助激光解吸电离（ matrix-assisted laser desorption/ionization， MALDI） 和 电 喷 雾 电 离（ electro-spray ionization， ESI）
第二节：蛋白质的大规模分离鉴定技术 0一、蛋白质二维电泳-质谱技术 (二)质谱技术 生物质谱的质量分析器主要有4种：离子阱(ion-trap,T)、飞行时 间(time of flight,TOF)、四极杆(quadrupole)和傅里叶变换离 子回旋共振(Fourier transform ion cyclotron resonance,FTICR) 25 选择母离子 打碎 扫描定量 1000 m/ 1500 三重四极杆质量分析器 8
一、蛋白质二维电泳-质谱技术 第二节：蛋白质的大规模分离鉴定技术 8 （二）质谱技术 生物质谱的质量分析器主要有4 种：离子阱（ion-trap，IT）、飞行时 间（time of flight，TOF）、四极杆（quadrupole）和傅里叶变换离 子回旋共振（Fourier transform ion cyclotron resonance，FTICR） 三重四极杆质量分析器
第二节：蛋白质的大规模分离鉴定技术 00似二、一维（二维）色谱-质谱技术 (一)一维电泳（色谱）-质谱技术(HPLC-MS) 1.一维SDS-PAGE电泳（色谱)-质谱技术 维SDS-PAGE电泳结合MALDI-TOFMS技术，或者蛋白质复合物经 酶切后用LC-MS-MS技术 2.一维EF电泳-质谱技术 以2DE-MS为基础的蛋白质分析策略，第一维等电聚焦电泳是根据等 电点的不同而分离蛋白质，第二维$DS-PAGE电泳是依据相对分子质 量的不同再次分离蛋白质。 9
二、一维（二维）色谱-质谱技术 第二节：蛋白质的大规模分离鉴定技术 9 （一）一维电泳（色谱）- 质谱技术（HPLC-MS） 1．一维SDS-PAGE 电泳（色谱）- 质谱技术 一维SDS-PAGE 电泳结合MALDI-TOFMS 技术，或者蛋白质复合物经 酶切后用LC-MS-MS 技术 2．一维IEF 电泳- 质谱技术 以2DE-MS 为基础的蛋白质分析策略，第一维等电聚焦电泳是根据等 电点的不同而分离蛋白质，第二维SDS-PAGE 电泳是依据相对分子质 量的不同再次分离蛋白质
第二节：蛋白质的大规模分离鉴定技术 0八二、一维（二维)色谱-质谱技术 (一)二维色谱-质谱技术（2D-HPLC/MS) 蛋白质多肽复合物 从组织、细胞或其他生物样 进样 本获得的蛋白质混合物，用 强离子交换柱(SCX) 蛋白酶（通常是胰蛋白酶） 盐浓度梯度洗脱 裂解，得到的多肽混合物样 品进行二维色谱分离。质谱 组分1 组分2 组分3 组分n 分析一般采用电喷雾串联质 谱，通过测定肽段序列的分 反相柱 反相柱 反相柱 反相柱 子质量对蛋白质进行鉴定。 质谱分析 0
二、一维（二维）色谱-质谱技术 第二节：蛋白质的大规模分离鉴定技术 1 0 （一）二维色谱- 质谱技术（2D-HPLC/MS） 从组织、细胞或其他生物样 本获得的蛋白质混合物，用 蛋白酶（通常是胰蛋白酶） 裂解，得到的多肽混合物样 品进行二维色谱分离。质谱 分析一般采用电喷雾串联质 谱，通过测定肽段序列的分 子质量对蛋白质进行鉴定
第二节：蛋白质的大规模分离鉴定技术 0八二、一维（二维)色谱-质谱技术 (一)二维色谱-质谱技术(2D-HPLC/MS) 荧光差异凝胶电泳技术(difference gel electrophoresis,DIGE) 结合了多重荧光分析的方法，在同一块胶上共同分离多个分别由不同 荧光标记的样品，并第一次引入了内标的概念。两种样品中的蛋白质 采用不同的荧光标记后混合，进行2-DE,用来检测蛋白质在两种样品 中表达情况，极大地提高了结果的准确性、可靠性和可重复性。 Co-migration in Samples Labeled proteins 2D electrophoresis Image analysis abel with Cy3 IPG strip control CemnmsmnIO ○y3 image label with Cy5 treated SDS gel Cy5 image label with Cy2 scan at different pooled internal standard wavelengths 1 Cy2 image 1
二、一维（二维）色谱-质谱技术 第二节：蛋白质的大规模分离鉴定技术 1 1 （一）二维色谱- 质谱技术（2D-HPLC/MS） 荧光差异凝胶电泳技术（difference gel electrophoresis，DIGE） 结合了多重荧光分析的方法，在同一块胶上共同分离多个分别由不同 荧光标记的样品，并第一次引入了内标的概念。两种样品中的蛋白质 采用不同的荧光标记后混合，进行2-DE，用来检测蛋白质在两种样品 中表达情况，极大地提高了结果的准确性、可靠性和可重复性