第三节 酶的固定化 随着酶学研究的深入和酶工程的发展，酶的应用越来越广泛。将酶用物理或 化学的方法固定在不溶于水的载体上，形成一种可以重复使用的酶，叫固定化酶。 固定化酶既保持了酶的催化特性，又克服了游离酶的不稳定性，具有可反复或连 续使用、易与反应产物分离等显著优点，广泛应用于医药、轻工、食品等行业。 一、固定化酶的制备方法 制备固定化酶的方法很多，有包埋法、吸附法、共价偶联法，以及交联法等 （图 2-3）。 1．包埋法 将酶或含酶菌体包埋在多孔载体中，使酶固定化的方法称为包 埋法。 包埋法根据载体材料和方法的不同，可以分为凝胶包埋法和微胶囊包埋法。凝胶 包埋法是将酶和含酶菌体包埋在各种凝胶内部的微孔中，制成一定形状的固定化 酶的方法。最常用的凝胶有琼脂、琼脂糖、海藻酸钙、卡拉胶、聚丙烯酰胺等。 微胶囊包埋法是将酶包埋在高分子半透膜中，制成微胶囊固定化酶的方法。常用 的半透膜有尼龙膜、醋酸纤维膜等。 2．吸附法 利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面而使酶固定 化的方法称为吸附法。吸附法常用的吸附剂有活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶 瓷、多孔玻璃、硅胶、羧基磷灰石等。 吸附法制备固定化酶，操作简便、条件温和，不会引起酶的变性失活，载体 价廉易得，而且可反复使用。但由于是靠物理吸附作用，结合力较弱，酶与载体 结合不太牢固而易脱落。 3．共价偶联法 利用酶活性中心外的非必需基团与固相载体上的基团共价 结合而制成固定化酶的方法叫共价偶联法，也叫共价结合法。这种方法的优点是 酶与载体牢固，制得的固定化酶稳定性好。缺点是制备过程中反应条件较为强烈， 难以控制，易使酶变性失活。共价偶联法常用的载体有纤维素、葡聚糖、琼脂糖、 甲壳素等。 4．交联法 交联法是采用双功能试剂使酶分子之间或酶分子与固相载体之 间发生交联作用而制成固定化酶的方法。常用的双功能试剂有戊二醛、己二胺、 顺丁烯二酸酐、双偶氮苯等。其中应用最广泛的是戊二醛。 用交联法制备的固定化酶结合牢固，可长时使用。但由于交联反应较激烈， 酶分子的多个基团被交联，酶活力损失较大。实际使用时，往往与其他固定化方 法联用，如将酶先经凝胶包埋后，再经交联等。这种采用两个或多个方法进行固 定化的技术，称为双重或多重固定化法，用此法可制备出酶活性高、机械强度好 的固定化酶
第三节 酶的固定化 随着酶学研究的深入和酶工程的发展，酶的应用越来越广泛。将酶用物理或 化学的方法固定在不溶于水的载体上，形成一种可以重复使用的酶，叫固定化酶。 固定化酶既保持了酶的催化特性，又克服了游离酶的不稳定性，具有可反复或连 续使用、易与反应产物分离等显著优点，广泛应用于医药、轻工、食品等行业。 一、固定化酶的制备方法 制备固定化酶的方法很多，有包埋法、吸附法、共价偶联法，以及交联法等 （图 2-3）。 1．包埋法 将酶或含酶菌体包埋在多孔载体中，使酶固定化的方法称为包 埋法。 包埋法根据载体材料和方法的不同，可以分为凝胶包埋法和微胶囊包埋法。凝胶 包埋法是将酶和含酶菌体包埋在各种凝胶内部的微孔中，制成一定形状的固定化 酶的方法。最常用的凝胶有琼脂、琼脂糖、海藻酸钙、卡拉胶、聚丙烯酰胺等。 微胶囊包埋法是将酶包埋在高分子半透膜中，制成微胶囊固定化酶的方法。常用 的半透膜有尼龙膜、醋酸纤维膜等。 2．吸附法 利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面而使酶固定 化的方法称为吸附法。吸附法常用的吸附剂有活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶 瓷、多孔玻璃、硅胶、羧基磷灰石等。 吸附法制备固定化酶，操作简便、条件温和，不会引起酶的变性失活，载体 价廉易得，而且可反复使用。但由于是靠物理吸附作用，结合力较弱，酶与载体 结合不太牢固而易脱落。 3．共价偶联法 利用酶活性中心外的非必需基团与固相载体上的基团共价 结合而制成固定化酶的方法叫共价偶联法，也叫共价结合法。这种方法的优点是 酶与载体牢固，制得的固定化酶稳定性好。缺点是制备过程中反应条件较为强烈， 难以控制，易使酶变性失活。共价偶联法常用的载体有纤维素、葡聚糖、琼脂糖、 甲壳素等。 4．交联法 交联法是采用双功能试剂使酶分子之间或酶分子与固相载体之 间发生交联作用而制成固定化酶的方法。常用的双功能试剂有戊二醛、己二胺、 顺丁烯二酸酐、双偶氮苯等。其中应用最广泛的是戊二醛。 用交联法制备的固定化酶结合牢固，可长时使用。但由于交联反应较激烈， 酶分子的多个基团被交联，酶活力损失较大。实际使用时，往往与其他固定化方 法联用，如将酶先经凝胶包埋后，再经交联等。这种采用两个或多个方法进行固 定化的技术，称为双重或多重固定化法，用此法可制备出酶活性高、机械强度好 的固定化酶
图 2-3 制备固定化酶的各种方法 二、固定化酶的性质 酶经固定化以后，由于受到载体等因素的影响，其特征可能会发生某些改变。 为此，在固定化酶的应用过程中，必须了解固定化酶的性质与游离酶之间的差别， 并对操作条件加以适当调整。 1．稳定性 固定化酶的稳定性一般比游离酶的稳定性好，主要表现在对热、 蛋白酶、各种变性剂的耐受性增强，使用和保存的稳定性提高。 2．最适温度 固定化酶的最适作用温度一般与游离酶差不多，活化能也变 化不大。但也有些固定化酶的最适温度与游离酶比较有明显的差别。例如，氨基 酸酰化酶最适温度一般在 60 ℃左右，用 DEAE-纤维素固定化后，其最适温度 高达 72 ℃。 3．最适 pH 酶经固定化后，其最适 pH 往往会发生变化，这一点在使用时 必须引起注意。影响固定化酶最适 pH 因素主要有两个：一个是载体的带电性质； 另一个是酶催化反应的产物性质。 载体的带电性质对固定化酶的最适 pH 也有明显的影响。一般说来，带负电 的载体制备固定化酶，其最适 pH 比游离酶高；而带正电的载体制备的固定化酶 其最适 pH 比游离酶低；而用电中性的载体制备的固定化酶，其最适 pH 一般不 改变。 酶催化反应的产物性质对固定化酶的最适 pH 也有一定的影响。一般来说， 产物为酸性时固定化酶的最适 pH 比游离酶高一些；产物为碱性时，固定化酶的 最适 pH 比游离酶低一些，产物为中性时，最适 pH 一般不改变。 4．底物特异性 固定化酶的底物特异性与游离酶比较有所不同。比如对一 些可作用于大分子底物，也可作用于小分子底物的酶而言，经固定化后，由于受 到载体空间位阻作用的影响，大分子底物难于接近酶分子，而使其催化反应速度 大大降低，而小分子底物的反应速度则不受影响。 三、固定化酶在食品工业中的应用 自 1953 年 N·Grubhofer 用共价偶联法，在载体聚氨基聚苯乙烯树脂上连接 了淀粉酶、羧肽酶、胃蛋白酶与核糖核酸酶，获得首批固定化酶之后，经多年实 线，运用各种各样的方法，现已制备出数百种固定化酶。如生产中使用规模最大 的固定化酶是在 DEAE−葡聚糖凝胶上固定的氨基酸酰化酶。该酶水解 N−酰基 −L−氨基酸中的酰胺键，对于 N−酰基−D−氨基酸无作用，故可用来拆分 DL−氨 基酸，制备 L−氨基酸。 在食品工业中，可把固定化的 -淀粉酶与葡萄糖淀粉酶混合装柱，糊化的淀 粉溶液流经此柱后，淀粉便水解为葡萄糖，这是近几年提出的酶法制葡萄糖的一 条新途径。近几年来，不少地方采用过氧化氢对牛奶灭菌，为了除去牛奶中过量
图 2-3 制备固定化酶的各种方法 二、固定化酶的性质 酶经固定化以后，由于受到载体等因素的影响，其特征可能会发生某些改变。 为此，在固定化酶的应用过程中，必须了解固定化酶的性质与游离酶之间的差别， 并对操作条件加以适当调整。 1．稳定性 固定化酶的稳定性一般比游离酶的稳定性好，主要表现在对热、 蛋白酶、各种变性剂的耐受性增强，使用和保存的稳定性提高。 2．最适温度 固定化酶的最适作用温度一般与游离酶差不多，活化能也变 化不大。但也有些固定化酶的最适温度与游离酶比较有明显的差别。例如，氨基 酸酰化酶最适温度一般在 60 ℃左右，用 DEAE-纤维素固定化后，其最适温度 高达 72 ℃。 3．最适 pH 酶经固定化后，其最适 pH 往往会发生变化，这一点在使用时 必须引起注意。影响固定化酶最适 pH 因素主要有两个：一个是载体的带电性质； 另一个是酶催化反应的产物性质。 载体的带电性质对固定化酶的最适 pH 也有明显的影响。一般说来，带负电 的载体制备固定化酶，其最适 pH 比游离酶高；而带正电的载体制备的固定化酶 其最适 pH 比游离酶低；而用电中性的载体制备的固定化酶，其最适 pH 一般不 改变。 酶催化反应的产物性质对固定化酶的最适 pH 也有一定的影响。一般来说， 产物为酸性时固定化酶的最适 pH 比游离酶高一些；产物为碱性时，固定化酶的 最适 pH 比游离酶低一些，产物为中性时，最适 pH 一般不改变。 4．底物特异性 固定化酶的底物特异性与游离酶比较有所不同。比如对一 些可作用于大分子底物，也可作用于小分子底物的酶而言，经固定化后，由于受 到载体空间位阻作用的影响，大分子底物难于接近酶分子，而使其催化反应速度 大大降低，而小分子底物的反应速度则不受影响。 三、固定化酶在食品工业中的应用 自 1953 年 N·Grubhofer 用共价偶联法，在载体聚氨基聚苯乙烯树脂上连接 了淀粉酶、羧肽酶、胃蛋白酶与核糖核酸酶，获得首批固定化酶之后，经多年实 线，运用各种各样的方法，现已制备出数百种固定化酶。如生产中使用规模最大 的固定化酶是在 DEAE−葡聚糖凝胶上固定的氨基酸酰化酶。该酶水解 N−酰基 −L−氨基酸中的酰胺键，对于 N−酰基−D−氨基酸无作用，故可用来拆分 DL−氨 基酸，制备 L−氨基酸。 在食品工业中，可把固定化的 -淀粉酶与葡萄糖淀粉酶混合装柱，糊化的淀 粉溶液流经此柱后，淀粉便水解为葡萄糖，这是近几年提出的酶法制葡萄糖的一 条新途径。近几年来，不少地方采用过氧化氢对牛奶灭菌，为了除去牛奶中过量
的过氧化氢，可用固定化的过氧化氢酶使之分解。此外，还有人介绍固定化的葡 萄糖氧化酶清除蛋清中微量的葡萄糖，以防制成的蛋白干片在贮存中发生褐变。 固定化酶在食品工业上还有以下几方面的应用：如用固定化果胶酶澄清果 汁；用固定化木瓜蛋白酶澄清啤酒；用固定化葡萄糖异构酶将葡萄糖转变为果糖 等。一旦固定化酶大规模用于食品工业，必将有助于更经济更有效地生产高质量 的食品
的过氧化氢，可用固定化的过氧化氢酶使之分解。此外，还有人介绍固定化的葡 萄糖氧化酶清除蛋清中微量的葡萄糖，以防制成的蛋白干片在贮存中发生褐变。 固定化酶在食品工业上还有以下几方面的应用：如用固定化果胶酶澄清果 汁；用固定化木瓜蛋白酶澄清啤酒；用固定化葡萄糖异构酶将葡萄糖转变为果糖 等。一旦固定化酶大规模用于食品工业，必将有助于更经济更有效地生产高质量 的食品