D0I:10.13374/i.issnl00103.2007.s2.055 第29卷增刊2 北京科技大学学报 Vol.29 Suppl.2 2007年12月 Journal of University of Science and Technology Beijing Dee.2007 产烟酸羟化酶菌株Pseudomonas sp BK一1 培养条件的研究 罗晖)尹祖建)常雁红2) 肖宝清) 1)北京科技大学应用科学学院，北京1000832)北京科技大学土木与环境工程学院，北京100083 摘要对产烟酸羟化酶的菌株Pseudomonas sp·BK一1的培养条件进行了优化，结果表明10gL蔗糖为最佳碳源，20g· L-1玉米浆为最佳氨源，诱导物烟酸浓度12.5gL-,培养基的最适初始pH值7.0.5L发酵罐中进行发酵，在转速400r· min-1、通气量4.2Lmim-1,30℃条件下，16h时酶活可达1.47UmL-1.经36h的连续催化，产物G-羟基烟酸的浓度可以积 累到154gL-1. 关键词烟酸：G一羟基烟酸：生物转化；发酵 分类号Q939 6羟基烟酸是烟酸的一种衍生物，也是一种重 发酵培养基：每升含有碳源10g,氨源10g,酵 要合成医药、农药、染料、材料的化学中间体，如合成 母粉2g,KzHP041g,烟酸10g,金属离子溶液10 烟酸类农药、减肥药，因此具有广阔的市场应用前 mL,pH 7.0. 景[一]，传统的G一羟基烟酸生产方法是利用化学法 金属离子溶液：每升含有CaCl2·2H200.4g, 合成，但普遍存在收率偏低、副产物过多、提纯困难 H3B030.5g,Cus045H200.04g,KI0.1g,Fes04· 等难题，一些微生物具有烟酸羟化酶活性，可直接 7H00.2gMns047Hz00.4g,Zns047Hz00.4 催化烟酸生产6一羟基烟酸)，由于生物法生产具 g.H2MoO2H2O 0.2g.MgSO4.7H2O 50g.CoClz. 有催化效率高、专一性强、条件温和、环境友好等特 6Hz00.1g,浓盐酸20mL. 点，因此在国外生物转化法生产一羟基烟酸已经成 上罐培养基：每升含有烟酸12.5g,酵母粉2g: 为了研究热点，Loza公司已经进行了10m3发酵规 模的工业生产，我国对生物法转化生产6一羟基 玉米浆30q,蔗糖15g,KzHP043.93g,NaHP041 g金属离子溶液10mL,pH7.0. 烟酸的研究近几年才开始，袁生等人筛选出具有烟 (3)主要仪器设备 酸羟化酶活性的菌株Pseudomonas putida NA一 1[8]. Unico PC一2100紫外可见光分光光度计，HZQ F160型全温振荡培养箱购自哈尔滨东联电子技术 本课题组从生产烟酸类产品的工厂周围的土壤 开发有限公司，岛津LC一10AT型高效液相色谱仪， 中筛选出了一株产酶特性较好的菌株Pseudomonas BIOTECH XOS型5L发酵罐购自上海保兴生物工 sp·BK1.本研究利用摇瓶对其培养的条件进行优 程有限公司， 化，并进行了上罐发酵，以期望为该菌株工业化生产 1.2菌体培养方法 奠定基础 取保藏菌种平板划线30℃条件下活化24h,挑 1材料和方法 取少量菌体转接于种子培养基中，30℃，200r· 1.1材料 min1,培养24h(50mL三角瓶含20mL种子培养 基)，然后转接于发酵培养基(100mL三角瓶含20 (1)菌种来源.通过筛选并保藏于本实验室的 mL培养基)，在200rmim-1,30℃的摇床下培养， 菌株Pseudomonas sp·BK一1. 分别测定36h和42h时的酶活 (2)培养基.种子培养基：每升含酵母粉5g,蛋 白胨10g,烟酸10g,NaC110g,K2HP041gpH7.0. 1.3酶活测定 吸取5mL菌液，6000rmin1离心10min,用 收稿日期：2007-10-15 等体积的磷酸缓冲液(0.02molL-1,pH7.0)洗涤2 作者简介：罗晖(1975一)，男，博士 次后，加入等体积1%烟酸溶液(0.02molL-1pH
产烟酸羟化酶菌株 Pseudomonas sp BK－1 培养条件的研究 罗 晖1） 尹祖建12） 常雁红2） 肖宝清2） 1） 北京科技大学应用科学学院北京100083 2） 北京科技大学土木与环境工程学院北京100083 摘 要 对产烟酸羟化酶的菌株 Pseudomonas sp．BK－1的培养条件进行了优化结果表明10g·L －1蔗糖为最佳碳源20g· L －1玉米浆为最佳氮源诱导物烟酸浓度12∙5g·L －1培养基的最适初始 pH 值7∙0∙5L 发酵罐中进行发酵在转速400r· min －1、通气量4∙2L·min －1、30℃条件下16h 时酶活可达1∙47U·mL －1．经36h 的连续催化产物6－羟基烟酸的浓度可以积 累到154g·L －1． 关键词 烟酸；6－羟基烟酸；生物转化；发酵 分类号 Q939 收稿日期：2007-10-15 作者简介：罗 晖（1975－）男博士 6－羟基烟酸是烟酸的一种衍生物也是一种重 要合成医药、农药、染料、材料的化学中间体如合成 烟酸类农药、减肥药因此具有广阔的市场应用前 景［1－4］．传统的6－羟基烟酸生产方法是利用化学法 合成但普遍存在收率偏低、副产物过多、提纯困难 等难题．一些微生物具有烟酸羟化酶活性可直接 催化烟酸生产6－羟基烟酸［5－6］由于生物法生产具 有催化效率高、专一性强、条件温和、环境友好等特 点因此在国外生物转化法生产6－羟基烟酸已经成 为了研究热点Lonza 公司已经进行了10m 3 发酵规 模的工业生产［7］．我国对生物法转化生产6－羟基 烟酸的研究近几年才开始袁生等人筛选出具有烟 酸羟化酶活性的菌株 Pseudomonas putida NA－ 1［8］． 本课题组从生产烟酸类产品的工厂周围的土壤 中筛选出了一株产酶特性较好的菌株 Pseudomonas sp．BK－1．本研究利用摇瓶对其培养的条件进行优 化并进行了上罐发酵以期望为该菌株工业化生产 奠定基础． 1 材料和方法 1∙1 材料 （1） 菌种来源．通过筛选并保藏于本实验室的 菌株 Pseudomonas sp．BK－1． （2） 培养基．种子培养基：每升含酵母粉5g蛋 白胨10g烟酸10gNaCl10gK2HPO41gpH7∙0． 发酵培养基：每升含有碳源10g氮源10g酵 母粉2gK2HPO41g烟酸10g金属离子溶液10 mLpH7∙0． 金属离子溶液：每升含有 CaCl2·2H2O 0∙4g H3BO30∙5gCuSO4·5H2O0∙04gKI0∙1gFeSO4· 7H2O0∙2gMnSO4·7H2O 0∙4gZnSO4·7H2O 0∙4 gH2MoO4·2H2O 0∙2gMgSO4·7H2O 50gCoCl2· 6H2O0∙1g浓盐酸20mL． 上罐培养基：每升含有烟酸12∙5g酵母粉2g 玉米浆30g蔗糖15gK2HPO43∙93gNaH2PO41 g金属离子溶液10mLpH7∙0． （3） 主要仪器设备 Unico PC－2100紫外可见光分光光度计HZQ－ F160型全温振荡培养箱购自哈尔滨东联电子技术 开发有限公司岛津 LC－10AT 型高效液相色谱仪 BIOTECH－XQS 型5L 发酵罐购自上海保兴生物工 程有限公司． 1∙2 菌体培养方法 取保藏菌种平板划线30℃条件下活化24h挑 取少量菌体转接于种子培养基中30℃200r· min －1培养24h （50mL 三角瓶含20mL 种子培养 基）然后转接于发酵培养基（100mL 三角瓶含20 mL 培养基）在200r·min －130℃的摇床下培养 分别测定36h 和42h 时的酶活． 1∙3 酶活测定 吸取5mL 菌液6000r·min －1离心10min用 等体积的磷酸缓冲液（0∙02mol·L －1pH7∙0）洗涤2 次后加入等体积1％烟酸溶液（0∙02mol·L －1 pH 第29卷 增刊2 2007年 12月 北 京 科 技 大 学 学 报 Journal of University of Science and Technology Beijing Vol．29Suppl．2 Dec．2007 DOI:10．13374／j．issn1001－053x．2007．s2．055
Vol.29 Suppl.2 罗晖等：产烟酸羟化酶菌株Pseudomonas sp BK-一l培养条件的研究 .217. 7.0磷酸缓冲液配制)，置于50mL三角瓶中，200r· 2),随着玉米浆浓度的增大，菌体酶活和生物量都在 mim1,30℃的条件下反应1h.采用高效液相色谱 提高，当浓度超过2%后，酶活增加缓慢，因此选择 和紫外分光光度计检测，色谱检测条件：色谱柱 了2%的玉米浆作为最佳氨源. Z0RBAX0DS(4.6mmid,150mm,5m),流动相乙 腈：10 mmol L-1KHP04HP04(pH2.5)=2:98 2.2 0.60 (V:V),流速1 mL'min,检测波长260nm;紫外分 5自 0.55 光光度计检测波长295nm. 目20 酶活定义：每1min催化烟酸生成1mol6羟 0.50 基烟酸所需要的酶量定义为一个活力单位(U)· 盒一36h生物量 1.4上罐实验 -·◆-·36h酶活 0.45 一42h生物量 在30℃条件下活化菌种24h,转接到60mL种 一·■一·42h酶活 子培养基中，30℃，200rmim培养24h,以1.5% 0.40 3 蔗糖浓度% 接种量转接到2.4L上罐培养基，培养10h时，连续 流加600mL上罐培养基.培养条件：30℃，400r· 图1蔗糖浓度对酶活、生物量的影响 min,通气量4.2Lmin,用HC调节维持pH 表1不同碳源对酶活和生物量的影响 7.0. 1.5连续催化 36h 42h 碳源 酶活/ 生物量/ 酶活/ 生物量/ 收集上罐发酵16h时的发酵液1L,4000r· min-1离心10min,用600mL0.02molL-1pH6.0 (U'mL)(mg'mL)(U'mL)(mg'mL) 柠檬酸 0.47 1.90 0.53 1.83 的磷酸缓冲液悬浮，流加底物烟酸，维持烟酸含量不 苹果酸 0.51 1.85 0.55 1.77 低于5gL.在30℃条件下曝气催化，通过HPLC 富马酸 0.51 2.28 0.59 1.96 检测反应液中烟酸和6羟基烟酸浓度， 乙酸钠 0.51 1.81 0.56 1.84 2结果和讨论 蔗糖 0.56 1.91 0.56 1.90 简萄糖 0.01 0.31 0.02 0.34 2.1培养条件优化 甘油 0.45 3.57 0.51 3.49 不同菌株都有其最佳培养条件，本实验通过优 可溶性淀粉 0.49 1.81 0.49 1.78 化培养条件，满足菌体生长所需，使酶活达到最高， 乳酸 0.45 1.94 0.46 1.95 通过测定36h和42h时培养液酶活，确定该菌株最 佳培养条件. 表2不同氮源对酶活、生物量的影响 (1)碳源、氨源、诱导物对酶活的影响 36h 42h 以蛋白胨为氨源的发酵培养基中添加9种不同 氨源 酶活/ 生物量/ 酶活/ 生物量/ 的碳源（表1），从表1可知以葡萄糖为碳源时菌体 (U'mL)(mg'mL)(UmL)(mg'mL) 基本不生长，酶活低：以甘油为碳源，生物量最大，但 (NH)2804 0.46 1.06 0.51 1.06 比酶活较低，蔗糖为碳源的培养基酶活最高达到 NaNO3 0.46 1.37 0.50 1.37 0.56UmL-1;以富马酸为碳源的培养基最高达到 尿素 0.0048 0.077 0.0017 0.097 0.59UmL-1,但考虑成本因素，选择蔗糖为碳源. 酵母粉 0.52 2.42 0.54 2.11 蔗糖浓度优化结果见图1，当蔗糖达到1%后，再增 谷氨酸 0.57 1.65 0.49 1.52 加蔗糖浓度，菌体的干重和酶活基本无变化，因此选 牛肉膏 0.60 2.22 0.56 2.17 择1%的蔗糖作为最佳碳源浓度. 玉米浆 0.63 1.8 0.64 1.93 分别考察了8种氨源对酶活、生物量的影响，结 蛋白冻 0.56 1.9 0.57 1.92 果显示表2.无机氨源不利于菌体生长，酶活也较 低，其中以尿素为氨源几乎没有酶活·在有机氮源 由于烟酸羟化酶是一种诱导酶，需要添加诱导 中，以酵母粉为氮源的培养基获得生物量最大，但比 物进行诱导表达，在以1%蔗糖、2%玉米浆的发酵 酶活并不高，而以玉米浆为氮源时酶活最高，生物量 培养基中添加1%的吡啶类似物，测定培养的Psu 也比较高，不同的玉米浆的浓度优化实验表明（图 domonas sp·BK1酶活（表3），以烟酸为诱导剂能
7∙0磷酸缓冲液配制）置于50mL 三角瓶中200r· min －130℃的条件下反应1h．采用高效液相色谱 和紫外分光光度计检测色谱检测条件：色谱柱 ZORBAX ODS（4∙6mm id150mm5μm）流动相乙 腈：10mmol·L －1 KH2PO4－H3PO4（pH2∙5）＝2∶98 （V∶V）流速1mL·min －1检测波长260nm；紫外分 光光度计检测波长295nm． 酶活定义：每1min 催化烟酸生成1μmol6－羟 基烟酸所需要的酶量定义为一个活力单位（U）． 1∙4 上罐实验 在30℃条件下活化菌种24h转接到60mL 种 子培养基中30℃200r·min －1培养24h以1∙5％ 接种量转接到2∙4L 上罐培养基培养10h 时连续 流加600mL 上罐培养基．培养条件：30℃400r· min －1通气量4∙2L·min －1用 HCl 调节维持 pH 7∙0． 1∙5 连续催化 收集上罐发酵16h 时的发酵液1L4000r· min －1离心10min用600mL 0∙02mol·L －1 pH6∙0 的磷酸缓冲液悬浮流加底物烟酸维持烟酸含量不 低于5g·L －1．在30℃条件下曝气催化通过 HPLC 检测反应液中烟酸和6－羟基烟酸浓度． 2 结果和讨论 2∙1 培养条件优化 不同菌株都有其最佳培养条件本实验通过优 化培养条件满足菌体生长所需使酶活达到最高． 通过测定36h 和42h 时培养液酶活确定该菌株最 佳培养条件． （1） 碳源、氮源、诱导物对酶活的影响 以蛋白胨为氮源的发酵培养基中添加9种不同 的碳源（表1）从表1可知以葡萄糖为碳源时菌体 基本不生长酶活低；以甘油为碳源生物量最大但 比酶活较低．蔗糖为碳源的培养基酶活最高达到 0∙56U·mL －1 ；以富马酸为碳源的培养基最高达到 0∙59U·mL －1但考虑成本因素选择蔗糖为碳源． 蔗糖浓度优化结果见图1当蔗糖达到1％后再增 加蔗糖浓度菌体的干重和酶活基本无变化因此选 择1％的蔗糖作为最佳碳源浓度． 分别考察了8种氮源对酶活、生物量的影响结 果显示表2．无机氮源不利于菌体生长酶活也较 低其中以尿素为氮源几乎没有酶活．在有机氮源 中以酵母粉为氮源的培养基获得生物量最大但比 酶活并不高而以玉米浆为氮源时酶活最高生物量 也比较高．不同的玉米浆的浓度优化实验表明（图 2）随着玉米浆浓度的增大菌体酶活和生物量都在 提高当浓度超过2％后酶活增加缓慢因此选择 了2％的玉米浆作为最佳氮源． 图1 蔗糖浓度对酶活、生物量的影响 表1 不同碳源对酶活和生物量的影响 碳源 36h 酶活／ （U·mL －1） 生物量／ （mg·mL －1） 42h 酶活／ （U·mL －1） 生物量／ （mg·mL －1） 柠檬酸 0∙47 1∙90 0∙53 1∙83 苹果酸 0∙51 1∙85 0∙55 1∙77 富马酸 0∙51 2∙28 0∙59 1∙96 乙酸钠 0∙51 1∙81 0∙56 1∙84 蔗糖 0∙56 1∙91 0∙56 1∙90 葡萄糖 0∙01 0∙31 0∙02 0∙34 甘油 0∙45 3∙57 0∙51 3∙49 可溶性淀粉 0∙49 1∙81 0∙49 1∙78 乳酸 0∙45 1∙94 0∙46 1∙95 表2 不同氮源对酶活、生物量的影响 氮源 36h 酶活／ （U·mL －1） 生物量／ （mg·mL －1） 42h 酶活／ （U·mL －1） 生物量／ （mg·mL －1） （NH4）2SO4 0∙46 1∙06 0∙51 1∙06 NaNO3 0∙46 1∙37 0∙50 1∙37 尿素 0∙0048 0∙077 0∙0017 0∙097 酵母粉 0∙52 2∙42 0∙54 2∙11 谷氨酸 0∙57 1∙65 0∙49 1∙52 牛肉膏 0∙60 2∙22 0∙56 2∙17 玉米浆 0∙63 1∙8 0∙64 1∙93 蛋白冻 0∙56 1∙9 0∙57 1∙92 由于烟酸羟化酶是一种诱导酶需要添加诱导 物进行诱导表达在以1％蔗糖、2％玉米浆的发酵 培养基中添加1％的吡啶类似物测定培养的 Pseudomonas sp．BK－1酶活（表3）．以烟酸为诱导剂能 Vol．29Suppl．2 罗 晖等： 产烟酸羟化酶菌株 Pseudomonas sp BK－1培养条件的研究 ·217·
.218 北京科技大学学报 2007年增刊2 产生较高的酶活，而以3一氰基吡啶诱导基本没有酶 于在偏酸性的条件下生长（图5），在pH5.5下几乎 活，并且生物量最小，可能3一氰基吡啶抑制了菌体 不能生长，而在pH6.0时，菌体的干重急剧上升，当 的生长，一羟基烟酸是微生物代谢烟酸后的第一个 超过pH6.5时，菌体干重则开始下降.但酶活在 产物町，对酶的表达也有一定的诱导作用，不同浓 pH7.0达到最高，在偏碱性条件下(pH值超过 度的烟酸对菌体酶活和生物量的影响见图3，在 7.5),菌体酶活显著下降，所以培养基起始pH值应 0.5%~1.25%时，随着烟酸浓度的加大，菌体酶活 该设定在6.5~7.5之间.在微生物的生长过程中， 和生物量都在增加，但继续增加烟酸的浓度，酶活和 改变生长环境，菌体的生长都有一段延迟期，可以通 菌体生物量反而减小，说明高浓度的烟酸会抑制菌 过改变接种量来缩短延迟期，在装有50mL发酵培 体的生长和酶的表达，改变诱导物的加入时间（图 养基的300mL的三角瓶中分别接1%，2%，4%， 4),结果发现诱导时间越早，则酶活和干重越高，可 6%,8%,10%的接种量.结果表明（图6,7），接种量 能是烟酸补充了菌体在前期生长中所消耗的碳源和 的不同对菌体的生长和酶活变化的影响并不大，只 氮源， 有10%的接种量使达到最大酶活的时间提前，但最 表3不同的诱导物对酶活、生物量的影响 大酶活与其它接种量相比有所下降.在36h时，接 36h 42h 种量为1%的菌体酶活最大，所以选择的接种量为 诱导物 酶活/ 生物量/ 酶活/ 生物量/ 1% (U'mL)(mgmL)(U'mL)(mg'mL) 2.5 0.8 烟酸 0.67 2.1 0.71 2.3 2.0◆ 0.6 3一氰基吡啶 0.02 1.0 0.03 1.1 一羟基烟酸 0.51 2.4 0.56 2.7 1.5 人 0.4 ★·一36h生物量 ◆-·36h酶活 1.0 ●一42h生物量 0.2 3.0 0.75 一·■一·42h酶活 0.5 0 1015 必 一2.5 0.65 时间小 2.0 0.55 (。 图4诱导时间对酶活、生物量影响 36h生物量 ·36h酶活 鉴 42h生物量 0.45 30 0.8 ■一·42h酶活 2.5 “受”一 0.6 0.35 3 20 玉米浆浓度% 0.4 血一36h生物量 1.0 一·◆一·36h酶活 图2玉米浆浓度对酶活、生物量的影响 -42h生物量 0.2 0.5 一-■一·42h酶活 2.5 0.8 6.0 6.57.0 7.5 PH 2.0 0.6 图5起始pH对酶活、生物量的影响 1.5 一36h生物量 0.4 一-●一·36h酶活 1% 2. 1.0 42h生物量 0.2 --■一·42h酶活 4% 6% 2 ·8% 烟酸浓度% -10% 由 1.5 图3烟酸浓度对酶活、生物量的影响 (2)起始pH、接种量、溶氧对酶活的影响 10 202530 3540 45 在以1%蔗糖、2%玉米浆、1.25%烟酸的发酵 时间h 培养基上改变其起始pH值(5.5,6.0,6.5,7.0， 图6不同接种量对生物量的影响 7.5,8.0).研究发现Pseudomonas sp·BK一1不适
产生较高的酶活而以3－氰基吡啶诱导基本没有酶 活并且生物量最小可能3－氰基吡啶抑制了菌体 的生长．6－羟基烟酸是微生物代谢烟酸后的第一个 产物［9］对酶的表达也有一定的诱导作用．不同浓 度的烟酸对菌体酶活和生物量的影响见图3在 0∙5％～1∙25％时随着烟酸浓度的加大菌体酶活 和生物量都在增加但继续增加烟酸的浓度酶活和 菌体生物量反而减小说明高浓度的烟酸会抑制菌 体的生长和酶的表达．改变诱导物的加入时间（图 4）结果发现诱导时间越早则酶活和干重越高可 能是烟酸补充了菌体在前期生长中所消耗的碳源和 氮源． 表3 不同的诱导物对酶活、生物量的影响 诱导物 36h 酶活／ （U·mL －1） 生物量／ （mg·mL －1） 42h 酶活／ （U·mL －1） 生物量／ （mg·mL －1） 烟酸 0∙67 2∙1 0∙71 2∙3 3－氰基吡啶 0∙02 1∙0 0∙03 1∙1 6－羟基烟酸 0∙51 2∙4 0∙56 2∙7 图2 玉米浆浓度对酶活、生物量的影响 图3 烟酸浓度对酶活、生物量的影响 （2） 起始 pH、接种量、溶氧对酶活的影响 在以1％蔗糖、2％玉米浆、1∙25％烟酸的发酵 培养基上改变其起始 pH 值（5∙56∙06∙57∙0 7∙58∙0）．研究发现 Pseudomonas sp．BK－1不适 于在偏酸性的条件下生长（图5）在 pH5∙5下几乎 不能生长而在 pH6∙0时菌体的干重急剧上升当 超过 pH6∙5时菌体干重则开始下降．但酶活在 pH7∙0达到最高在偏碱性条件下（pH 值超过 7∙5）菌体酶活显著下降所以培养基起始 pH 值应 该设定在6∙5～7∙5之间．在微生物的生长过程中 改变生长环境菌体的生长都有一段延迟期可以通 过改变接种量来缩短延迟期．在装有50mL 发酵培 养基的300mL 的三角瓶中分别接1％2％4％ 6％8％10％的接种量．结果表明（图67）接种量 的不同对菌体的生长和酶活变化的影响并不大只 有10％的接种量使达到最大酶活的时间提前但最 大酶活与其它接种量相比有所下降．在36h 时接 种量为1％的菌体酶活最大所以选择的接种量为 1％． 图4 诱导时间对酶活、生物量影响 图5 起始 pH 对酶活、生物量的影响 图6 不同接种量对生物量的影响 ·218· 北 京 科 技 大 学 学 报 2007年 增刊2
Vol.29 Suppl.2 罗晖等：产烟酸羟化酶菌株Pseudomonas sp BK-1培养条件的研究 .219 0.8 通过持续滴加烟酸进行催化，由于一定浓度的烟酸 0.7 可以抑制产物羟基烟酸的分解，因此维持烟酸的 0.6 浓度在5gL-以上.在催化的起始阶段，反应液中 ● 0.5 1% 的产物6一羟基烟酸浓度比较低，对酶活的抑制不 2% 强，0~6h期间，6一羟基烟酸的浓度与时间几乎成直 4% ◆一·6% 线关系，而高浓度的6羟基烟酸对酶活有抑制作 0.3 黑一·8% -…●-·10% 用，随着6羟基烟酸的浓度增加其增加的幅度在逐 00 15 202530 35 45 渐减小，在36h时，6羟基烟酸浓度可以达到154g· 时间h L1.对离心后的上清反应液调节pH值<2.0，可 图7不同接种量对酶活的影响 以得到6羟基烟酸的沉淀，通过这种简单的分离操 作，产物6羟基烟酸的纯度可以达到99%以上. 微生物对烟酸的代谢需要氧参与，而该菌的生 15 3.5 长也需要充足的氧供给，通过不同装液量的摇瓶实 烟酸 —●一6-羟基烟酸 ·酶活 一·生物量 3.0 验来研究该菌的耗氧情况，分别在100mL的三角瓶 中装入20mL,40mL,60mL,80mL,100mL的发酵 10 培养基，实验结果表明装液量越少（溶氧量越高），菌 2.0 体的干重和酶活也就越高（图8），说明菌体的生长 5 和烟酸羟化酶的表达需要充足的氧气供应· 1.0 2.5 0.8 0.5 2.0 0.6 10 15 20 0 1.5 时间h 0.4 1.0 盒一36h生物量 -·◆一·36h酶活 图9生物量、酶活、烟酸和6羟基烟酸浓度的变化 ●一42h生物量 0.2 -■·42h酶活 180 0 0 20406080100 150 装液量mL 120 90 图8不同装液量对酶活、生物量的影响 60 2.2上罐发酵 % 在摇瓶实验优化的培养条件基础上，在5L发 10 20 30 40 酵罐中进行了发酵实验，测定了发酵过程的各个指 时间h 标，结果发现，该菌株在上罐培养过程中，16h时酶 活即达到最高1.47UmL-1,与摇瓶培养相比酶活 图10 Pseudomon匹sp-BK一1催化烟酸积累6羟基烟酸过程 增加了一倍，而达到最高酶活的时间大大缩短，发酵 过程控制pH为中性和改善通氧条件都有利于菌体 3 结论 的生长·在发酵过程中，随着诱导剂烟酸的消耗，酶 通过对Pseudomonas sp,BK-1的培养条件进 活不断提高，在10h时烟酸已经基本消耗完，此时 行研究，得到优化培养条件为：烟酸12.5gL1,蔗 发酵液中的烟酸代谢产物6一羟基烟酸可以继续作 糖10gL-1,玉米浆浓度20gL-1,酵母粉2g· 为诱导剂诱导酶的生成，随着发酵液中6羟基烟酸 L-1,K2HP041gL-1、金属离子溶液10mL、接种 完全分解(16h),酶活开始下降，此时也是菌体的对 量1%.上罐发酵实验表明该菌的培养时间比摇瓶 数生长末期，发酵液的溶氧量急剧上升，发酵过程完 大大缩短，酶活也提高了一倍，与前人的研究相比具 成（图9） 有培养时间短、酶活较高等特点[-6,8】.连续催化结 2.3连续催化 果表明，该菌株可以催化积累高浓度的6一羟基烟 对菌体静息细胞催化烟酸的过程进行了研究 酸，展现了很好的工业应用前景， (图10)·为了减少高浓度烟酸对酶活的抑制作用
图7 不同接种量对酶活的影响 微生物对烟酸的代谢需要氧参与而该菌的生 长也需要充足的氧供给．通过不同装液量的摇瓶实 验来研究该菌的耗氧情况分别在100mL 的三角瓶 中装入20mL40mL60mL80mL100mL 的发酵 培养基实验结果表明装液量越少（溶氧量越高）菌 体的干重和酶活也就越高（图8）说明菌体的生长 和烟酸羟化酶的表达需要充足的氧气供应． 图8 不同装液量对酶活、生物量的影响 2∙2 上罐发酵 在摇瓶实验优化的培养条件基础上在5L 发 酵罐中进行了发酵实验测定了发酵过程的各个指 标结果发现该菌株在上罐培养过程中16h 时酶 活即达到最高1∙47U·mL －1与摇瓶培养相比酶活 增加了一倍而达到最高酶活的时间大大缩短发酵 过程控制 pH 为中性和改善通氧条件都有利于菌体 的生长．在发酵过程中随着诱导剂烟酸的消耗酶 活不断提高在10h 时烟酸已经基本消耗完此时 发酵液中的烟酸代谢产物6－羟基烟酸可以继续作 为诱导剂诱导酶的生成随着发酵液中6－羟基烟酸 完全分解（16h）酶活开始下降此时也是菌体的对 数生长末期发酵液的溶氧量急剧上升发酵过程完 成（图9）． 2∙3 连续催化 对菌体静息细胞催化烟酸的过程进行了研究 （图10）．为了减少高浓度烟酸对酶活的抑制作用 通过持续滴加烟酸进行催化由于一定浓度的烟酸 可以抑制产物6－羟基烟酸的分解因此维持烟酸的 浓度在5g·L －1以上．在催化的起始阶段反应液中 的产物6－羟基烟酸浓度比较低对酶活的抑制不 强0～6h 期间6－羟基烟酸的浓度与时间几乎成直 线关系．而高浓度的6－羟基烟酸对酶活有抑制作 用随着6－羟基烟酸的浓度增加其增加的幅度在逐 渐减小在36h 时6－羟基烟酸浓度可以达到154g· L －1．对离心后的上清反应液调节 pH 值＜2∙0可 以得到6－羟基烟酸的沉淀通过这种简单的分离操 作产物6－羟基烟酸的纯度可以达到99％以上． 图9 生物量、酶活、烟酸和6－羟基烟酸浓度的变化 图10 Pseudomonas sp．BK－1催化烟酸积累6－羟基烟酸过程 3 结论 通过对 Pseudomonas sp．BK－1的培养条件进 行研究得到优化培养条件为：烟酸12∙5g·L －1蔗 糖10g·L －1玉米浆浓度20g·L －1酵母粉2g· L －1K2HPO41g·L －1、金属离子溶液10mL、接种 量1％．上罐发酵实验表明该菌的培养时间比摇瓶 大大缩短酶活也提高了一倍与前人的研究相比具 有培养时间短、酶活较高等特点［5－68］．连续催化结 果表明该菌株可以催化积累高浓度的6－羟基烟 酸展现了很好的工业应用前景． Vol．29Suppl．2 罗 晖等： 产烟酸羟化酶菌株 Pseudomonas sp BK－1培养条件的研究 ·219·
.220 北京科技大学学报 2007年增刊2 参考文献 [5]Nagasawa T.Hurh B.Yamane T.Production of 6hydroxyni- [1]Zhao L M.Yan B.A novel path to luminescent hybrid molecular cotie acid from nicotinic acid by resting cell of Pseudomonas fluo- rescents TN5.Biosci Biotech Biochem.1994.58(4):665 materials:modifying the hydroxyl group of 6-hydroxynicotinic acid grafting to silica network.Appl Organomet Chem.2005. [6]Hurh B.Ohshima M.Yamane T.et al.Microbial production of 6 19,1060 hydroxynicotinic acid,an important building block for the syn- [2]Kagabu S.Moriya K.Shibuya K.et al.(6Halonicotinyl)-2- thesis of modern insecticides.J Ferment Bioeng.1994.77(4): 382 nitromethylene imidazolidines as potential new insecticides.Biosci Biotech Biochem,1992.56(2):362 [7]孙志浩，生物催化制备手性化合物技术进展，精细与专用化 [3]Moriya K.Shibuya K.Hattori Y,et al.(6Chloronicotinyl)- 学品，2006,14(24)：5 [8]陆伟宏，王鑫，徐莉，等.恶臭假单胞菌NA一1菌株烟酸羟化 2 nitroimino imidazolidines and related compounds as potential new insecticides.Biosci Biotech Biochem.1992.56(2):364 酶活性诱导和转化条件的研究.微生物学报，2005,45(41)： 551 [4]WenIT,Kuang Y H.Ching Y H.Synthesis and liquid crystal compounds containing the core structure of 6-hydroxynicotinic [9]Rona H.Ensign J C.Oxidation of nicotinie acid by a Bacillus acid or 4-hydroxyphenylacetic acid.J Chin Chem Soc.2006, species:regulation of nicotinic acid and 6hydroxynicotinic acid 53:1385 hydroxylases.J Bacteriol,1972.112(1):392 Cultivation and biotransformation of Pseudomonas sp.BK1 LUO Hui),YIN Zujian.CHANG Yanhong2),XIAO Baoqing 1)Applied Science School.University of Science and Technology Beijing Beijing 100083.China 2)Civil and Environmental Engineering School.University of Science and Technology Beijing.Beijing 100083,China ABSTRACI To increase the activity of nicotinic acid hydroxylase of Pseudomonas sp.BK1,the culture con- ditions of the strain were optimized.The experimental results show that 10gLsucrose is the optimal carbon source and 20gLcorn steep liquor is the optimal nitrogen source.The optimized concentration of the inducer nicotinic acid is 12.5gand initial pH of culture medium is7.0.Under the conditions of rotation 400r/min and ventilate 4.2L/min the highest enzyme activity of this strain can reach 1.47UmLat 16h in a 5liter fer- mentor.The accumulation of 6 hydroxynicotinic acid in reaction mixture by Pseudomonas sp.BK-1 can reach 154gL-1at36h. KEY WORDS nicotinic acid;6 hydroxynicotinic acid;biotransformation:fermentation
参 考 文 献 ［1］ Zhao L MYan B．A novel path to luminescent hybrid molecular materials：modifying the hydroxyl group of 6－hydroxynicotinic acid grafting to silica network．Appl Organomet Chem2005 19：1060 ［2］ Kagabu SMoriya KShibuya Ket al．1－（6－Halonicotinyl）-2- nitromethylene-imidazolidines as potential new insecticides．Biosci Biotech Biochem199256（2）：362 ［3］ Moriya KShibuya KHattori Yet al．1－（6－Chloronicotinyl）- 2-nitroimino-imidazolidines and related compounds as potential new insecticides．Biosci Biotech Biochem199256（2）：364 ［4］ Wen l TKuang Y HChing Y H．Synthesis and liquid crystal compounds containing the core structure of 6－hydroxynicotinic acid or 4－hydroxyphenylacetic acid．J Chin Chem Soc2006 53：1385 ［5］ Nagasawa THurh BYamane T．Production of 6－hydroxynicotic acid from nicotinic acid by resting cell of Pseudomonas f luorescents T N5．Biosci Biotech Biochem199458（4）：665 ［6］ Hurh BOhshima MYamane Tet al．Microbial production of6 －hydroxynicotinic acidan important building block for the synthesis of modern insecticides．J Ferment Bioeng199477（4）： 382 ［7］ 孙志浩．生物催化制备手性化合物技术进展．精细与专用化 学品200614（24）：5 ［8］ 陆伟宏王鑫徐莉等．恶臭假单胞菌 NA－1菌株烟酸羟化 酶活性诱导和转化条件的研究．微生物学报200545（41）： 551 ［9］ Rona HEnsign J C．Oxidation of nicotinic acid by a Bacillus species：regulation of nicotinic acid and 6－hydroxynicotinic acid hydroxylases．J Bacteriol1972112（1）：392 Cultivation and biotransformation of Pseudomonas sp．BK－1 LUO Hui 1）Y IN Zujian 12）CHA NG Y anhong 2）XIAO Baoqing 2） 1） Applied Science SchoolUniversity of Science and Technology BeijingBeijing100083China 2） Civil and Environmental Engineering SchoolUniversity of Science and Technology BeijingBeijing100083China ABSTRACT To increase the activity of nicotinic acid hydroxylase of Pseudomonas sp．BK－1the culture conditions of the strain were optimized．The experimental results show that 10g·L －1sucrose is the optimal carbon source and20g·L －1corn steep liquor is the optimal nitrogen source．The optimized concentration of the inducer nicotinic acid is12∙5g·L －1and initial pH of culture medium is7∙0．Under the conditions of rotation400r／min and ventilate4∙2L／min the highest enzyme activity of this strain can reach1∙47U·mL －1at16h in a5liter fermentor．The accumulation of 6－hydroxynicotinic acid in reaction mixture by Pseudomonas sp．BK－1can reach 154g·L －1at 36h． KEY WORDS nicotinic acid；6－hydroxynicotinic acid；biotransformation；fermentation ·220· 北 京 科 技 大 学 学 报 2007年 增刊2