实验一血糖的斐林法测定 、实验目的 掌握 Folin-Wu法测定血糖含量的原理和方法。 二、实验原理 1.血糖指的是血液中哪一种糖 葡萄糖是血液主要的糖类,因此测血糖含量就是测血液中葡萄糖的含量 2.用什么方法测定? 测定血液中葡萄糖的含量,即测复杂组分中一种物质的量,根据生化实验基 本技术的原理,可采用分光光度法(比色法)进行测定 3.葡萄糖可以用比色法直接测定吗? 不行,可以用间接的方法。血液中的葡萄糖与碱性硫酸铜溶液共热,铜离子 即被血液中的葡萄糖还原成氧化亚铜,后者又可使钼酸试剂还原成低价的钼蓝 (蓝色)。血糖的含量与产生的氧化亚铜成正比,氧化亚铜的量与形成的钼化合 物的量成正比,可以用比色的方法进行测定。 三、材料、仪器与试剂 (一)、材料:动物血液 (二)、仪器(仪器的选择在实验开始前由学生在预习报告中提出方案后教师审 定) 分光光度计、血糖管、奥氏吸管、水浴锅、表面皿 (三)、药品(试剂的选择在实验开始前由学生在预习报告中提出方案后教师审 定后并配制) 标准葡萄糖溶液、碱性硫酸铜溶液(A、B液)、酸性钼酸盐溶液、10%钨酸钠溶 液、0.33mol/L硫酸溶液 四、实验操作 1.无蛋白血滤液的制备 用奥氏吸管吸取已加抗凝剂的全血1ml,缓缓放入20ml锥形瓶中,加水7ml 摇匀,血液变成红色透明时加10%钨酸钠lml,摇匀,再加0.33mol/L硫酸, 随加随摇,加完放置5~15πin,至沉淀由鲜红变为暗棕色,滤纸过滤。每亳升
1 实验一 血糖的斐林法测定 一、实验目的 掌握 Folin-Wu 法测定血糖含量的原理和方法。 二、实验原理 1.血糖指的是血液中哪一种糖？ 葡萄糖是血液主要的糖类，因此测血糖含量就是测血液中葡萄糖的含量。 2.用什么方法测定？ 测定血液中葡萄糖的含量，即测复杂组分中一种物质的量，根据生化实验基 本技术的原理，可采用分光光度法（比色法）进行测定。 3.葡萄糖可以用比色法直接测定吗？ 不行，可以用间接的方法。血液中的葡萄糖与碱性硫酸铜溶液共热，铜离子 即被血液中的葡萄糖还原成氧化亚铜，后者又可使钼酸试剂还原成低价的钼蓝 （蓝色）。血糖的含量与产生的氧化亚铜成正比，氧化亚铜的量与形成的钼化合 物的量成正比，可以用比色的方法进行测定。 三、材料、仪器与试剂 （一）、材料：动物血液 （二）、仪器（仪器的选择在实验开始前由学生在预习报告中提出方案后教师审 定） 分光光度计、血糖管、奥氏吸管、水浴锅、表面皿 （三）、药品（试剂的选择在实验开始前由学生在预习报告中提出方案后教师审 定后并配制） 标准葡萄糖溶液、碱性硫酸铜溶液（A、B 液）、酸性钼酸盐溶液、10％钨酸钠溶 液、0.33mol/L 硫酸溶液 四、实验操作： 1.无蛋白血滤液的制备 用奥氏吸管吸取已加抗凝剂的全血 1ml，缓缓放入 20ml 锥形瓶中，加水 7ml， 摇匀，血液变成红色透明时加 10％钨酸钠 1ml， 摇匀，再加 0.33mol /L 硫酸， 随加随摇，加完放置 5～15min，至沉淀由鲜红变为暗棕色，滤纸过滤。每毫升
无蛋白血滤液相当于0.1m1全血 2.血糖的测定 取具25ml刻度的血糖管3只,编号,用奧氏吸管吸取无蛋白血滤液2ml, 放入第一只血糖管中,于第二只血糖管中加2ml标准葡萄糖溶液。第三只血糖管 中加2ml蒸馏水。然后各加2nl新配置的碱性硫酸铜溶液,同时置沸水浴内煮 6imin,取出,在流水中迅速冷却,各加入4ml酸性钼酸盐溶液,lmin后以蒸馏 水稀释至25ml,混匀,倒入比色杯,用722型风光光度计于420~440nm波长比 色(先以空白管调节零点,然后测标准管和样品管)。 五、计算 按下式计算100m1全血中所含的血糖质量(mg) m= Alco A0/0.1x100 式中:m:100m1血中所含的糖质量 C0:标准葡萄糖溶液浓度 A1:样品溶液吸光度 A0:标准溶液吸光度 六、注意事项 1.欲得准确结果,所取血液的量必须准确。如果由吸管中放出血液的速度太 快,会有大量血液粘在吸管内壁,容量不准,所以一般放出1m1血液所用的时间 不应少于1min 2.沉淀由鲜红变为暗棕色,是因钨酸钠与硫酸作用生成钨酸,在适当酸度时, 使血红蛋白变性、沉淀。如血沉淀放置后不变为棕红色或重滤后仍混浊,可在钨 酸与血混合液中加入10%硫酸1~2滴,待变为暗棕色后再滤
2 无蛋白血滤液相当于 0.1ml 全血。 2.血糖的测定 取具 25ml 刻度的血糖管 3 只，编号，用奥氏吸管吸取无蛋白血滤液 2ml， 放入第一只血糖管中，于第二只血糖管中加 2ml 标准葡萄糖溶液。第三只血糖管 中加 2ml 蒸馏水。然后各加 2ml 新配置的碱性硫酸铜溶液，同时置沸水浴内煮 6min，取出，在流水中迅速冷却，各加入 4ml 酸性钼酸盐溶液，1min 后以蒸馏 水稀释至 25ml，混匀，倒入比色杯，用 722 型风光光度计于 420～440nm 波长比 色（先以空白管调节零点，然后测标准管和样品管）。 五、计算 按下式计算 100ml 全血中所含的血糖质量（mg）。 m＝ A1C0 A0 / 0.1 x100 式中：m：100ml 血中所含的糖质量 C0：标准葡萄糖溶液浓度 A1：样品溶液吸光度 A0：标准溶液吸光度 六、注意事项 1.欲得准确结果，所取血液的量必须准确。如果由吸管中放出血液的速度太 快，会有大量血液粘在吸管内壁，容量不准，所以一般放出 1ml 血液所用的时间 不应少于 1min。 2.沉淀由鲜红变为暗棕色，是因钨酸钠与硫酸作用生成钨酸，在适当酸度时， 使血红蛋白变性、沉淀。如血沉淀放置后不变为棕红色或重滤后仍混浊，可在钨 酸与血混合液中加入 10％硫酸 1～2 滴，待变为暗棕色后再滤
实验二种子粗脂肪的提取 、实验目的 脂肪广泛存在于油料植物种子和果实中,测定脂肪的含量,可以鉴别其品质 的优劣,也是油料作物选种和种质资源调査的常规测定项目。 、实验原理 在了解了实验目的之后,关于这个实验有以下几个问题需要大家思考: 1.种子成分很复杂,脂肪的提取如何进行? 2.什么是粗脂肪? (答:脂肪不溶于水,易溶于有机溶剂(如石油醚)。利用这一特性,选用 有机溶剂直接浸提出样品中的脂肪进行测定。提取物中除脂肪之外,还有游离脂 肪酸、石蜡、磷脂、固醇、色素、有机酸等物质,故浸提物称粗脂肪。)通过以 上问题的思考,我们知道了脂肪的提取主要是利用其易溶于有机溶剂的特性。具 体的实验操作粗脂肪的提取,一般采用索氏脂肪提取器 利用脂类物质溶于有机溶剂的特性。在索氏提取器中用有机溶剂(本实验用 石油醚,沸程为30~60℃)对样品中的脂类物质进行提取。 图索氏脂肪提取器 1.浸提管2.通气管3.虹吸管4.小烧瓶5.冷凝管 索氏提取器是由提取瓶、提取管、冷凝器三部分组成的,提取管两侧分别有
3 实验二 种子粗脂肪的提取 一、实验目的 脂肪广泛存在于油料植物种子和果实中，测定脂肪的含量，可以鉴别其品质 的优劣，也是油料作物选种和种质资源调查的常规测定项目。 二、实验原理 在了解了实验目的之后，关于这个实验有以下几个问题需要大家思考： 1.种子成分很复杂，脂肪的提取如何进行？ 2.什么是粗脂肪？ （答：脂肪不溶于水，易溶于有机溶剂（如石油醚）。利用这一特性，选用 有机溶剂直接浸提出样品中的脂肪进行测定。提取物中除脂肪之外，还有游离脂 肪酸、石蜡、磷脂、固醇、色素、有机酸等物质，故浸提物称粗脂肪。）通过以 上问题的思考，我们知道了脂肪的提取主要是利用其易溶于有机溶剂的特性。具 体的实验操作粗脂肪的提取，一般采用索氏脂肪提取器。 利用脂类物质溶于有机溶剂的特性。在索氏提取器中用有机溶剂（本实验用 石油醚，沸程为 30 ～ 60 ℃）对样品中的脂类物质进行提取。 图 索氏脂肪提取器 1. 浸提管 2. 通气管 3. 虹吸管 4. 小烧瓶 5. 冷凝管 索氏提取器是由提取瓶、提取管、冷凝器三部分组成的，提取管两侧分别有
虹吸管和连接管。各部分连接处要严密不能漏气。提取时,将待测样品包在脱脂 滤纸包内,放入提取管内。提取瓶内加入石油醚,加热提取瓶,石油醚气化,由 连接管上升进入冷凝器,凝成液体滴入提取管内,浸提样品中的脂类物质。待提 取管内石油醚液面达到一定髙度,溶有粗脂肪的石油醚经虹吸管流λ提取瓶。流 入提取瓶内的石油醚继续被加热气化、上升、冷凝,滴入提取管内,如此循环往 复,直到抽提完全为止。 三、材料、仪器与试剂 (一)实验材料 大豆、花生、蓖麻、向日葵、芝麻等油料种子。 (二)仪器设备 索氏提取器(50皿),烧杯,干燥器,脱脂滤纸,镊子,分析天平,烘箱, 恒温水浴,脱脂棉 (三)试剂 石油醚(化学纯,沸程30~60℃)。 四、实验操作 1.将洗净、晾干的芝麻种籽放在80~100℃烘箱中烘4小时。待冷却后, 准确地称取2~4g,置于硏钵中硏磨细,将硏碎的样品及擦净硏钵的脱脂棉 并用脱脂滤纸包住用丝线扎好,勿让样品漏出。或用特制的滤纸斗装样品后, 斗口用脱脂棉塞好。放入索氏提取器的提取管内,最后再用石油醚洗净硏钵后倒 入提取管内 2.洗净索氏提取瓶,在105℃烘箱内烘干至恒重,记录重量。将石油醚加 到提取瓶内约为瓶容积的1/2~2/3。把提取器各部分连接后,接口处不能漏 气。用70~80℃恒温水浴加热提取瓶,使抽提进行16小时左右,直至抽提 管内的石油醚用滤纸检验无油迹为止。此时表示提取完全 提取完毕,取岀滤纸包,再回馏一次,洗涤提取管。再继续蒸馏,当提 取管中的石油醚液面接近虹吸管口而未流入提取瓶时,倒出石油醚。若提取瓶中 仍有石油醚,继续蒸馏,直至提取瓶中石油醚完全蒸完。取下提取瓶,洗净瓶的 外壁,放入105℃烘箱中烘干至恒重,记录重量。 五、注意事项 1.本法采用沸点低于60℃的有机溶剂,不能提取出样品中结合状态的脂
4 虹吸管和连接管。各部分连接处要严密不能漏气。提取时，将待测样品包在脱脂 滤纸包内，放入提取管内。提取瓶内加入石油醚，加热提取瓶，石油醚气化，由 连接管上升进入冷凝器，凝成液体滴入提取管内，浸提样品中的脂类物质。待提 取管内石油醚液面达到一定高度，溶有粗脂肪的石油醚经虹吸管流入提取瓶。流 入提取瓶内的石油醚继续被加热气化、上升、冷凝，滴入提取管内，如此循环往 复，直到抽提完全为止。 三、材料、仪器与试剂 （一）实验材料 大豆、花生、蓖麻、向日葵、芝麻等油料种子。 （二）仪器设备 索氏提取器（ 50 mL ），烧杯，干燥器，脱脂滤纸，镊子，分析天平，烘箱， 恒温水浴，脱脂棉。 （三）试剂 石油醚（化学纯，沸程 30 ～ 60 ℃）。 四、实验操作 1.将洗净、晾干的芝麻种籽放在 80 ～ 100 ℃烘箱中烘 4 小时。待冷却后， 准确地称取 2 ～ 4 g ，置于研钵中研磨细，将研碎的样品及擦净研钵的脱脂棉 一并用脱脂滤纸包住用丝线扎好，勿让样品漏出。或用特制的滤纸斗装样品后， 斗口用脱脂棉塞好。放入索氏提取器的提取管内，最后再用石油醚洗净研钵后倒 入提取管内。 2. 洗净索氏提取瓶，在 105 ℃烘箱内烘干至恒重，记录重量。将石油醚加 到提取瓶内约为瓶容积的 1/2 ～ 2/3 。把提取器各部分连接后，接口处不能漏 气。用 70 ～ 80 ℃恒温水浴加热提取瓶，使抽提进行 16 小时左右，直至抽提 管内的石油醚用滤纸检验无油迹为止。此时表示提取完全。 3. 提取完毕，取出滤纸包，再回馏一次，洗涤提取管。再继续蒸馏，当提 取管中的石油醚液面接近虹吸管口而未流入提取瓶时，倒出石油醚。若提取瓶中 仍有石油醚，继续蒸馏，直至提取瓶中石油醚完全蒸完。取下提取瓶，洗净瓶的 外壁，放入 105 ℃烘箱中烘干至恒重，记录重量。 五、注意事项 1.本法采用沸点低于 60 ℃的有机溶剂，不能提取出样品中结合状态的脂
类,故此法又称为游离脂类定量测定法 2.待测样品若是液体,应将一定体积的样品滴在脱脂滤纸上在60~80℃烘 箱中烘干后放入提取管内。 本法使用有机溶剂石油醚(沸程30~60℃)故加热时不能用明火。 六、思考题 1.索氏提取法提取的为什么是粗脂肪? 做好本实验应注意哪些事项?
5 类，故此法又称为游离脂类定量测定法。 2.待测样品若是液体，应将一定体积的样品滴在脱脂滤纸上在 60～80℃烘 箱中烘干后放入提取管内。 3.本法使用有机溶剂石油醚（沸程 30 ～ 60 ℃）故加热时不能用明火。 六、思考题 1. 索氏提取法提取的为什么是粗脂肪 ? 2. 做好本实验应注意哪些事项 ?
实验三氨基酸分离——双向层析法 、实验目的 学习双向纸层析的原理和操作方法,进行混合氨基酸的分离分析。 二、实验原理 纸层析是以滤纸作支持物,用一定的溶剂系统展开,使混合样品达到分离分 析的层析方法。其一般操作是将样品溶解在适当溶剂中,点样在滤纸的一端;再 选用适当的溶剂系统,从点样的一端通过毛细现象向另一端展开,展开完毕,取 出滤纸晾干或烘干,再以适当的显色剂或紫外灯、荧光灯下观察其图谱。样品经 展开后其一物质在纸层析谱上的位置常用比移值R来表示 原点至纸层析斑点中心点的距离 原点至溶剂前沿的距离 纸层析可看作是溶质(样品)在固定相与流动相之间的连续抽提,由于溶质 在两相之间的分配系数不同而达到分离。一定的物质在两相间有固定的分配系 数,因而在恒定条件(液剂、P、温度)下,各物质有固定的R值,据此可达到 分析鉴定的目的。 由于滤纸纤维可吸收20~25%的水分;且其中6~7%以氢键形式与纤维素上 羟基结合,一般条件下难脱去;所以纸层析实际上是以水相作固定相,展开的溶 剂作流动相 纸层析操作按溶剂展开方向可分为上行、下行和径向三种。氨基酸分离一般 用上行法。上行法又分单向(成分较为简单的样品)和双向(单向时斑点重叠分 离不开,于是在其垂直方向用另一种溶剂系统展层)。双相层析谱可分辨十几种 以上的样品。 层析滤纸要求: (1)质地均匀,平整无折痕,厚薄适当,溶剂能匀速展开。 (2)机械强度好,溶剂展开后能保持原状,不易折到。 (3)有一定纯度而少杂质,以免影响层析图谱背景。 (4)纤维松紧适宜,一般选用中速滤纸,或根据溶剂选择。如丁醇类粘度 大,宜用快速滤纸:而氯仿、石油醚展开快,宜用慢速滤纸 6
6 原点至溶剂前沿的距离 原点至纸层析斑点中心点的距离 实验三 氨基酸分离——双向层析法 一、实验目的 学习双向纸层析的原理和操作方法，进行混合氨基酸的分离分析。 二、实验原理 纸层析是以滤纸作支持物，用一定的溶剂系统展开，使混合样品达到分离分 析的层析方法。其一般操作是将样品溶解在适当溶剂中，点样在滤纸的一端；再 选用适当的溶剂系统，从点样的一端通过毛细现象向另一端展开，展开完毕，取 出滤纸晾干或烘干，再以适当的显色剂或紫外灯、荧光灯下观察其图谱。样品经 展开后其一物质在纸层析谱上的位置常用比移值 Rf来表示。 Rf = 纸层析可看作是溶质（样品）在固定相与流动相之间的连续抽提，由于溶质 在两相之间的分配系数不同而达到分离。一定的物质在两相间有固定的分配系 数，因而在恒定条件（液剂、PH、温度）下，各物质有固定的 Rf值，据此可达到 分析鉴定的目的。 由于滤纸纤维可吸收 20～25%的水分；且其中 6～7%以氢键形式与纤维素上 羟基结合，一般条件下难脱去；所以纸层析实际上是以水相作固定相，展开的溶 剂作流动相。 纸层析操作按溶剂展开方向可分为上行、下行和径向三种。氨基酸分离一般 用上行法。上行法又分单向（成分较为简单的样品）和双向（单向时斑点重叠分 离不开，于是在其垂直方向用另一种溶剂系统展层）。双相层析谱可分辨十几种 以上的样品。 层析滤纸要求： （1）质地均匀，平整无折痕，厚薄适当，溶剂能匀速展开。 （2）机械强度好，溶剂展开后能保持原状，不易折到。 （3）有一定纯度而少杂质，以免影响层析图谱背景。 （4）纤维松紧适宜，一般选用中速滤纸，或根据溶剂选择。如丁醇类粘度 大，宜用快速滤纸；而氯仿、石油醚展开快，宜用慢速滤纸
层析溶剂要求: (1)被分离物质在该溶剂系统中R在0.05~0.8之间,各组分之R值相差 最好能大于0.05,以免斑点重叠。 (2)溶剂系统中任一组分与分离物之间不能起化学反应 (3)分离物质在溶剂系统中的分配较恒定,不随温度而变化,且易迅速达 到平衡,这样所得斑点较圆整 本实验采用八种混合氨基酸为样品,用酸性和碱性两种溶剂进行双向层析, 以茚三酮为显色剂,可获得分离清晰的层析图谱。图谱示意如下 时…冖 原点 Ⅱ相正酶::9别乙醇:水=5:1:l:1 三、材料、仪器与试剂 (一)实验材料 标准氨基酸混合溶液:亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丙氨酸、天门 冬氨酸、组氨酸、丝氨酸各100ng溶于50m10.01M盐酸中。 (二)仪器设备 层析缸25×40cm(×2);培养皿15cm(×2);喷雾器:毛细管内径0.lcm; 电吹风;烘箱。层析滤纸14×1lcm:;铅笔,尺。 (三)试剂 0.1%(w/V)茚三酮溶丙酮液; 溶剂系统:第一相:正丁醇:88%甲酸:水=15:3:2(V/V 第二相:正丁醇:吡啶:95%乙醇:水=5:1:1:1(V/)
7 层析溶剂要求： （1）被分离物质在该溶剂系统中 Rf在 0.05～0.8 之间，各组分之 Rf值相差 最好能大于 0.05，以免斑点重叠。 （2）溶剂系统中任一组分与分离物之间不能起化学反应。 （3）分离物质在溶剂系统中的分配较恒定，不随温度而变化，且易迅速达 到平衡，这样所得斑点较圆整。 本实验采用八种混合氨基酸为样品，用酸性和碱性两种溶剂进行双向层析， 以茚三酮为显色剂，可获得分离清晰的层析图谱。图谱示意如下： 三、材料、仪器与试剂 （一）实验材料 标准氨基酸混合溶液：亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丙氨酸、天门 冬氨酸、组氨酸、丝氨酸各 100mg 溶于 50ml 0.01M 盐酸中。 （二）仪器设备 层析缸 25×40cm（×2）；培养皿 15cm（×2）；喷雾器；毛细管内径 0.1cm； 电吹风；烘箱。层析滤纸 14×11cm；铅笔，尺。 （三）试剂 0.1%（W/V）茚三酮溶丙酮液; 溶剂系统：第一相：正丁醇∶88%甲酸∶水＝15∶3∶2（V/V）； 第二相：正丁醇∶吡啶∶95%乙醇∶水＝5∶1∶1∶1（V/V）
四、实验操作 1.点样 取层析滤纸一张(14×11cm),在距纸边1.2cm处划一基线:再将纸转90° 距纸边1.2cm处作一线与上线垂直。以毛细管吸取混合氨基酸溶液,点与二线交 点处(见图4-1),点的直径控制在2mm左右,不可过大。待样品干燥后再点 次。滤纸上点样斑点干燥后,把滤纸卷成圆筒形,纸的两边以铬丝相连,但不可 重叠相碰 2.展层 在层析缸中平稳的放入装有第一相层析溶剂的培养皿。将圆筒形滤纸放入, 点样一段接触溶剂,以点样处不浸入溶剂为准。待溶剂自下而上均匀展开,约2 小时后溶剂到达距纸边0.5cm处取出滤纸,悬挂于室温中,以电吹风充分吹尽溶 剂。然后裁去未走过溶剂的滤纸边缘,将滤纸转90°,卷成如前圆筒状,放入 盛第二相溶剂的层析缸内展开(操作同上),约1小时后溶剂展开到距纸边0.5cm 时取出,以电吹风吹尽溶剂使其干燥。 溶剂前沿 溶剂1 点样 结果 溶剂2 转90°裁去溶 剂前沿部分 单向上行 双向上行 纸层析点样、展层 (X,Y分别为云点至斑点中心和溶剂前沿的距离,x为点样原点) 3.显色 以喷雾器将茚三酮均匀地喷在滤纸上,然后悬滤纸于65℃烘箱内加热20分 钟,即可看到紫红色氨基酸斑点,将图谱上的斑点用铅笔圈出
8 四、实验操作 1.点样 取层析滤纸一张（14×11cm），在距纸边 1.2cm 处划一基线；再将纸转 90°， 距纸边 1.2cm 处作一线与上线垂直。以毛细管吸取混合氨基酸溶液，点与二线交 点处（见图 4-1），点的直径控制在 2mm 左右，不可过大。待样品干燥后再点一 次。滤纸上点样斑点干燥后，把滤纸卷成圆筒形，纸的两边以铬丝相连，但不可 重叠相碰。 2.展层 在层析缸中平稳的放入装有第一相层析溶剂的培养皿。将圆筒形滤纸放入， 点样一段接触溶剂，以点样处不浸入溶剂为准。待溶剂自下而上均匀展开，约 2 小时后溶剂到达距纸边 0.5cm 处取出滤纸，悬挂于室温中，以电吹风充分吹尽溶 剂。然后裁去未走过溶剂的滤纸边缘，将滤纸转 90°，卷成如前圆筒状，放入 盛第二相溶剂的层析缸内展开（操作同上），约 1 小时后溶剂展开到距纸边 0.5cm 时取出，以电吹风吹尽溶剂使其干燥。 3.显色 以喷雾器将茚三酮均匀地喷在滤纸上，然后悬滤纸于 65℃烘箱内加热 20 分 钟，即可看到紫红色氨基酸斑点，将图谱上的斑点用铅笔圈出。 纸层析点样、展层 （X, Y 分别为云点至斑点中心和溶剂前沿的距离，x 为点样原点）
五、注意事项 (1)烘箱加热温度不可过高,且不可有氨的干扰,否则图谱背景会泛红 2)第一相溶剂最好在使用前再按比例混合,否则会引起酯化影响层析效果。 (3)接触滤纸时,要戴手套。 六、思考题: 1.酸性与碱性溶剂系统对氨基酸极性基团的解离各有何影响? 为什么展层时要用两种溶剂系统?
9 五、注意事项 （1）烘箱加热温度不可过高，且不可有氨的干扰，否则图谱背景会泛红。 （2）第一相溶剂最好在使用前再按比例混合，否则会引起酯化影响层析效果。 （3）接触滤纸时，要戴手套。 六、思考题： 1．酸性与碱性溶剂系统对氨基酸极性基团的解离各有何影响？ 2．为什么展层时要用两种溶剂系统？
实验四样品中总氮量的测定—微量凯氏定氮法 、实验目的 1.掌握凯氏定氮仪的使用方法 2.掌握凯氏定氮法测定样品总氮量的原理。 、实验原理 1.什么是凯氏定氮法?有什么意义? 大多数蛋白质中氮的含量较恒定,平均为16%,即每100g蛋白质中含16g 氮,因此可通过测定生物样品中的氮来测定蛋白质的含量(每测得1g氮即相当 于6.25g蛋白质)。这是定氮法测定蛋白质含量的计算基础,即用定氮法测得的 样品含氮量乘以6.25,即可算出样品中蛋白质的含量。蛋白质含量=含氮量× 6.25,测定蛋白质含量的方法很多,其中最基本和常用的方法就是测定含氮量的 方法。测定含氮量一般都采用微量凯氏定氮法。 2.该方法原理? 蛋白质样品先经浓硫酸加热消化,使蛋白质中的有机氮转变成为无机氮,然 后经碱化蒸馏,放出的氨气用标准酸吸收,再用标准碱来滴定剩余的酸,计算出 的含氮量乘以6.25即是该样品中的蛋白质含量。 三、材料、仪器与试剂 (一)实验材料:市售面粉 (二)仪器设备(仪器的选择在实验开始前由学生在预习报告中提出方案 后教师审定) 凯氏烧瓶;凯氏定氮蒸馏装置;容量瓶;微量滴定管;烘箱;电炉;1000 毫升蒸馏烧瓶;小玻璃珠或毛细管;电子天平 (三)试剂(试剂的选择在实验开始前由学生在预习报告中提出方案后教 师审定后并配制) 浓硫酸(AR);硫酸铜;硫酸钾混;甲基红乙醇;溴甲酚绿乙醇;棚酸:乙 醇;氢氧化钠; 四、实验操作 1.凯氏定氮仪的构造和安装:
10 实验四 样品中总氮量的测定——微量凯氏定氮法 一、实验目的 1.掌握凯氏定氮仪的使用方法； 2.掌握凯氏定氮法测定样品总氮量的原理。 二、实验原理 1.什么是凯氏定氮法？有什么意义？ 大多数蛋白质中氮的含量较恒定，平均为 16％，即每 100g 蛋白质中含 16g 氮，因此可通过测定生物样品中的氮来测定蛋白质的含量（每测得 1g 氮即相当 于 6.25g 蛋白质）。这是定氮法测定蛋白质含量的计算基础，即用定氮法测得的 样品含氮量乘以 6.25，即可算出样品中蛋白质的含量。蛋白质含量＝含氮量× 6.25，测定蛋白质含量的方法很多，其中最基本和常用的方法就是测定含氮量的 方法。测定含氮量一般都采用微量凯氏定氮法。 2.该方法原理？ 蛋白质样品先经浓硫酸加热消化，使蛋白质中的有机氮转变成为无机氮，然 后经碱化蒸馏，放出的氨气用标准酸吸收，再用标准碱来滴定剩余的酸，计算出 的含氮量乘以 6.25 即是该样品中的蛋白质含量。 三、材料、仪器与试剂 （一）实验材料：市售面粉 （二）仪器设备 （仪器的选择在实验开始前由学生在预习报告中提出方案 后教师审定） 凯氏烧瓶；凯氏定氮蒸馏装置；容量瓶；微量滴定管；烘箱；电炉；1000 毫升蒸馏烧瓶；小玻璃珠或毛细管；电子天平。 （三）试剂 （试剂的选择在实验开始前由学生在预习报告中提出方案后教 师审定后并配制） 浓硫酸（AR）；硫酸铜；硫酸钾混；甲基红乙醇；溴甲酚绿乙醇；棚酸；乙 醇；氢氧化钠； 四、实验操作： 1．凯氏定氮仪的构造和安装：