上海交通大学生命学院：氨基酸发酵研究进展（陆奇明）.pdf_大学文库

上潘定人孝 Shanghal Jiao Tong Universit 氨基酸发酵研究进展氨基酸发酵研究进展陆奇明上海交通大学生命学院研究生学号:5050809427 摘要:氨基酸广泛应用于生产、生活的诸多方面。氨基酸发酵是现代快速发展起来的氨基酸生产方法,微生物代谢网络和调控机制的研究带动了氨基酸生产相关技术的进步,工程手段、计算机建模的联合使用更优化了氨基酸发酵的监控,基因工程再次为菌种选育和代谢控制开拓了思路。本文就氨基酸发酵的原理,菌种的定向选育,发酵控制的优化,以及基因工程的应用做一简要阐述。关键词:氨基酸发酵,代谢调控,定向育种,发酵控制,基因重组氨基酸是含氨基和羧基的一类有机化合物的统称,是构成生物蛋白质的重要单位,几乎切生命活动都与之相关。氨基酸在医药、食品、饲料、化工等行业中有重要应用人工生产氨基酸始于蛋白质酸水解,化学合成途径的发现和应用使得氨基酸的大规模生产成为可能,但鉴于混合氨基酸的低纯化率,以及化学方法所固有的低产出率,使得这些方法难以被大范围推广。20世纪50~60年代,生物化学基础研究的发展,特别是代谢调控理论的建立,使得氨基酸发酵作为一种新型发酵工程而迅速发展起来。20世纪70年代后期以来,随着载体、受体系统的构建及体外基因重组技术的日益完善,氨基酸生物工程菌的构建得到长足的发展。现代分子生物学的导入,令氨基酸发酵微生物的改造与应用有了更强的目定性和系统性;现代工程技术与生产工艺的发展,使超大规模发酵及与其对应的高效纯化技术得以应用,氨基酸发酵过程和产出更加稳定、高效。 1氨基酸发酵的原理 1957年,日本采用谷氨酸棒状杆菌发酵制造L谷氨酸获得成功。之后不久,多种氨基酸发酵方法得以应用并商业化,从此推动了氨基酸生产的大发展第1页共1页

氨基酸发酵研究进展氨基酸发酵研究进展陆奇明上海交通大学生命学院研究生学号：5050809427 摘要：氨基酸广泛应用于生产、生活的诸多方面。氨基酸发酵是现代快速发展起来的氨基酸生产方法，微生物代谢网络和调控机制的研究带动了氨基酸生产相关技术的进步，工程手段、计算机建模的联合使用更优化了氨基酸发酵的监控，基因工程再次为菌种选育和代谢控制开拓了思路。本文就氨基酸发酵的原理，菌种的定向选育，发酵控制的优化，以及基因工程的应用做一简要阐述。关键词：氨基酸发酵，代谢调控，定向育种，发酵控制，基因重组氨基酸是含氨基和羧基的一类有机化合物的统称，是构成生物蛋白质的重要单位，几乎一切生命活动都与之相关。氨基酸在医药、食品、饲料、化工等行业中有重要应用。人工生产氨基酸始于蛋白质酸水解，化学合成途径的发现和应用使得氨基酸的大规模生产成为可能，但鉴于混合氨基酸的低纯化率，以及化学方法所固有的低产出率，使得这些方法难以被大范围推广。20 世纪 50～60 年代，生物化学基础研究的发展，特别是代谢调控理论的建立，使得氨基酸发酵作为一种新型发酵工程而迅速发展起来。20 世纪 70 年代后期以来，随着载体、受体系统的构建及体外基因重组技术的日益完善，氨基酸生物工程菌的构建得到长足的发展。现代分子生物学的导入，令氨基酸发酵微生物的改造与应用有了更强的目定性和系统性；现代工程技术与生产工艺的发展，使超大规模发酵及与其对应的高效纯化技术得以应用，氨基酸发酵过程和产出更加稳定、高效。 1 氨基酸发酵的原理 1957 年，日本采用谷氨酸棒状杆菌发酵制造 L-谷氨酸获得成功。之后不久，多种氨基酸发酵方法得以应用并商业化，从此推动了氨基酸生产的大发展。第 1 页共 1 页

上定通大字 Shanghal Jiao Tong Universit 氨基酸发酵研究进展氨基酸生物合成的基本调节机制有反馈控制、在合成途径分枝点处的优先合成,及其他特殊的控制机制。氨基酸的代谢控制发酵,就是基于部分或全部解除上述的自动调节机制, 从而改变菌种的代谢特性,使得微生物体内的代谢流按照人们所需要的方向进行,过量地积累氨基酸 2氨基酸菌种的定向选育不同菌种的代谢调控方式不尽相同,采用不同的出发株,育种途径也有所差异,所以在考虑出发菌株时,应尽量吸取前人经验,选择那些代谢途径简单、硏究透彻、又易于解除调控机制的菌种为出发株。通过对微生物体内氨基酸代谢与调控途径的研究,可以从不同方向对产酸菌株进行定向育种。 1)解除反馈调节:利用目标氨基酸或其他酶阻遏物的酶结合构型,选育出结构类似物抗性株,解除氨基酸生物合成的反馈调节或代谢互锁 2)切断支路代谢:通过支路酶的诱变缺失,选育岀营养缺陷型菌株,解除支路氨基酸的协同反馈调节作用 3)优先合成的转换:使用过量的终产物诱变降低酶活性,获得渗漏缺陷型菌株,改变分枝点处氨基酸合成的优先顺序。 4)选育温度敏感菌株:控制培养温度,针对特定的酶进行温度敏感性筛选,获得高温下营养缺陷型的突变株。用此菌株进行发酵,通过控制发酵条件,尤其是温度,可以提高培养基中糖的转化率,这是一种新型的氨基酸发酵工艺 5)改善细胞膜的通透性:脂肪酸是形成细胞膜磷脂的重要成分,选育丧失脂肪酸合成相关酶的各种营养缺陷型,则可以改变细胞膜透性,把作为反馈抑制因子的终产物氨基酸迅速不断地排出细胞外,在生物素含量丰富的培养基中积累氨基酸目前氨基酸菌种选育中一般多种手段同时采用,常见的如联合使用营养缺陷型和结构类似物抗性,令生物合成的代谢流流向产物的合成,减少副产物的形成,同时又可以解除微生物体内酶的调节机制,更有利于生产上的控制。 3氨基酸发酵控制的优化氨基酸发酵是一个复杂的生化反应过程,无论是发酵设备、配套设备以及仪表的配置, 第3页共3页

氨基酸发酵研究进展氨基酸生物合成的基本调节机制有反馈控制、在合成途径分枝点处的优先合成，及其他特殊的控制机制。氨基酸的代谢控制发酵，就是基于部分或全部解除上述的自动调节机制，从而改变菌种的代谢特性，使得微生物体内的代谢流按照人们所需要的方向进行，过量地积累氨基酸。 2 氨基酸菌种的定向选育不同菌种的代谢调控方式不尽相同，采用不同的出发株，育种途径也有所差异，所以在考虑出发菌株时，应尽量吸取前人经验，选择那些代谢途径简单、研究透彻、又易于解除调控机制的菌种为出发株。通过对微生物体内氨基酸代谢与调控途径的研究，可以从不同方向对产酸菌株进行定向育种。 1) 解除反馈调节：利用目标氨基酸或其他酶阻遏物的酶结合构型，选育出结构类似物抗性株，解除氨基酸生物合成的反馈调节或代谢互锁。 2) 切断支路代谢：通过支路酶的诱变缺失，选育出营养缺陷型菌株，解除支路氨基酸的协同反馈调节作用。 3) 优先合成的转换：使用过量的终产物诱变降低酶活性，获得渗漏缺陷型菌株，改变分枝点处氨基酸合成的优先顺序。 4) 选育温度敏感菌株：控制培养温度，针对特定的酶进行温度敏感性筛选，获得高温下营养缺陷型的突变株。用此菌株进行发酵，通过控制发酵条件，尤其是温度，可以提高培养基中糖的转化率，这是一种新型的氨基酸发酵工艺。 5) 改善细胞膜的通透性：脂肪酸是形成细胞膜磷脂的重要成分，选育丧失脂肪酸合成相关酶的各种营养缺陷型，则可以改变细胞膜透性，把作为反馈抑制因子的终产物氨基酸迅速不断地排出细胞外，在生物素含量丰富的培养基中积累氨基酸。目前氨基酸菌种选育中一般多种手段同时采用，常见的如联合使用营养缺陷型和结构类似物抗性，令生物合成的代谢流流向产物的合成，减少副产物的形成，同时又可以解除微生物体内酶的调节机制，更有利于生产上的控制。 3 氨基酸发酵控制的优化氨基酸发酵是一个复杂的生化反应过程，无论是发酵设备、配套设备以及仪表的配置，第 3 页共 3 页

上定通大字 Shanghal Jiao Tong Universit 氨基酸发酵研究进展还是工艺参数的设定,均需理论与实践相结合,才能达到预期的目的发酵培养基的成分与配比是决定产酸菌代谢的主要因素,与氨基酸的产率、转化率及提取收率关系很密切。有实验显示,在限氮条件下,支链氨基酸发酵的产酸率和糖转化率都有大幅度的下降,证明了常用的蛋白质水解液是氨基酸发酵的主要氮源。通过对胞内氮元素的代谢流分析,建立起代谢流平衡模型,再结合发酵过程中的检测数据,计算出代谢网络中不同途径以及氨基酸发酵不同时期的代谢流分布,能够对氨基酸发酵的控制进行优化。同时, 有机氮源也是氨基酸发酵中生长因子的重要来源。在氨基酸发酵的定向育种中这些生长因子都是对氨基酸合成途径具有重要调控作用的关键因子,对氨基酸发酵具有重要意义。溶氧是氨基酸发酵等好氧发酵工艺的一个重要参数。氧的供应对菌体的生长和代谢产物的积累都有很大的影响,决定着氨基酸产量的高低。在氨基酸发酵中,供氧量应根据不同菌种、发酵条件和发酵阶段等具体情况决定。近年来,氨基酸发酵硏究者开始从溶氧对代谢流量的影响角度硏究溶氧对发酵产酸的影响。现发现,对氨基酸发酵过程进行分阶段溶氧控制, 可以显著提高目的氨基酸的产量,同时还可降低副产物的量,减轻下游工艺的负担氨基酸发酵的最适温度因菌种性质和所生产的氨基酸种类不同而异,其中菌体生长和氨基酸合成的最适温度亦是不同的。发酵过程中,由于菌体增殖和合成代谢而产生热量使发酵液温度升高,须及时冷却,以维持适宜的发酵温度,使用温度敏感菌株时尤需注意 pH值对氨基酸发酵同样重要,主要影响酶的活性和菌的代谢。生产上控制pH值的方法一般有两种,一种是流加尿素,一种是流加氨水。目前已趋向用电子计算机自动控制pH 值 4基因工程手段的应用传统的氨基酸生产方法,如提取法、酶法和化学合成法等,由于前体物的成本高,工艺复杂,难以达到工业化生产的目的,而目前大多采用的诱变筛选获得的菌株发酵法生产氨基酸,在菌种保存和后期纯化等方面也有较大的局限性。基因工程的手段包括利用细菌原有优良基因的遗传性重组,以及需要构建载体受体系统的体外重组。通过细胞内基因重组技术的应用,易于组合遗传特性,能较为有效地育种但存在种属界限、重组率低等难点。体外构建重组体的方法已经获得一定的成功:1979年前苏联科学家首先成功地利用体外构建重组质粒的基因工程方法选育了能稳定产酸的苏氨酸产生菌,进行工业生产苏氨酸:美国将大肠杆菌变异株染色体上的脯氨酸基因连接到质粒第4页共4页

氨基酸发酵研究进展还是工艺参数的设定，均需理论与实践相结合，才能达到预期的目的。发酵培养基的成分与配比是决定产酸菌代谢的主要因素，与氨基酸的产率、转化率及提取收率关系很密切。有实验显示，在限氮条件下，支链氨基酸发酵的产酸率和糖转化率都有大幅度的下降，证明了常用的蛋白质水解液是氨基酸发酵的主要氮源。通过对胞内氮元素的代谢流分析，建立起代谢流平衡模型，再结合发酵过程中的检测数据，计算出代谢网络中不同途径以及氨基酸发酵不同时期的代谢流分布，能够对氨基酸发酵的控制进行优化。同时，有机氮源也是氨基酸发酵中生长因子的重要来源。在氨基酸发酵的定向育种中这些生长因子都是对氨基酸合成途径具有重要调控作用的关键因子，对氨基酸发酵具有重要意义。溶氧是氨基酸发酵等好氧发酵工艺的一个重要参数。氧的供应对菌体的生长和代谢产物的积累都有很大的影响，决定着氨基酸产量的高低。在氨基酸发酵中，供氧量应根据不同菌种、发酵条件和发酵阶段等具体情况决定。近年来，氨基酸发酵研究者开始从溶氧对代谢流量的影响角度研究溶氧对发酵产酸的影响。现发现，对氨基酸发酵过程进行分阶段溶氧控制，可以显著提高目的氨基酸的产量，同时还可降低副产物的量，减轻下游工艺的负担。氨基酸发酵的最适温度因菌种性质和所生产的氨基酸种类不同而异，其中菌体生长和氨基酸合成的最适温度亦是不同的。发酵过程中，由于菌体增殖和合成代谢而产生热量使发酵液温度升高，须及时冷却，以维持适宜的发酵温度，使用温度敏感菌株时尤需注意。 pH 值对氨基酸发酵同样重要，主要影响酶的活性和菌的代谢。生产上控制 pH 值的方法一般有两种，一种是流加尿素，一种是流加氨水。目前已趋向用电子计算机自动控制 pH 值。 4 基因工程手段的应用传统的氨基酸生产方法，如提取法、酶法和化学合成法等，由于前体物的成本高，工艺复杂，难以达到工业化生产的目的，而目前大多采用的诱变筛选获得的菌株发酵法生产氨基酸，在菌种保存和后期纯化等方面也有较大的局限性。基因工程的手段包括利用细菌原有优良基因的遗传性重组，以及需要构建载体-受体系统的体外重组。通过细胞内基因重组技术的应用，易于组合遗传特性，能较为有效地育种，但存在种属界限、重组率低等难点。体外构建重组体的方法已经获得一定的成功：1979 年前苏联科学家首先成功地利用体外构建重组质粒的基因工程方法选育了能稳定产酸的苏氨酸产生菌，进行工业生产苏氨酸；美国将大肠杆菌变异株染色体上的脯氨酸基因连接到质粒第 4 页共 4 页

上定通大字 Shanghal Jiao Tong Universit 氨基酸发酵研究进展上转化寄主菌,并进行了克隆,获得高效表达,产酸力大大地增强;英国开展了色氨酸基因工程的研究,用DNA限制性核酸内切酶把tpA-trpB两个基因从染色体切下连到载体上,并转化大肠杆菌,所获转化体的合成酶β2亚单位活性提高230倍,酶的含量约占菌体蛋白的 20%,色氨酸产量提高氨基酸基因工程的硏究尽管取得了一些进展,但至目前“工程菌”的产酸能力普遍较低还不十分稳定,能够达到工业化生产水平的为数不多。不过,作为一项发展迅速技术,基因工程对氨基酸生产和应用有着巨大的潜力,若把基因工程技术成果与固定化、生物反应器等其他新兴技术有机结合起来,定能发挥更大的效用。 5展望氨基酸广泛应用于生产、生活的诸多方面,以其在生理作用上的不可取代性,决不会因社会技术的进步而被更迭或淘汰。氨基酸生产技术不断进步,验证又刺激了氨基酸代谢相关的理论研究。氨基酸发酵是当今氨基酸生产的主要模式,应用重组DNA技术使氨基酸发酵工业方兴未艾。在氨基酸发酵整体优化方面,由于其系统性和便捷性,运用计算计软件进行算法和模型的构建愈发受到关注,正在形成遗传算法、神经网络和模糊控制相结合,进而构成一种新型的智能控制系统整体优化的结构形式。发酵后处理依然是氨基酸生产硏究的热点,络合萃取和膜分离等技术在分离纯化氨基酸发酵液方面都取得了令人欣喜的成果,为产业革新提供了充足的动力。参考文献江宁.微生物生物技术[M,北京:化学工业出版社,2008:73-137 [2]彭珍荣.微生物资源与氨基酸的生产和应用J化学与生物工程,2003,20(6)7-8 3]陈燕珠氨基酸的应用与发展趋势化工时刊,2001,15(7)-46 4]王宏龄,富春江.国外知名氨基酸生产企业最新动态卩.精细与专用化学品,2004,12(17)21-24 5]俞俊棠,唐孝宣,邬行彦,等.新编生物工艺学[M]北京:化学工业出版社2003205-217 第5页共5页

氨基酸发酵研究进展上转化寄主菌，并进行了克隆，获得高效表达，产酸力大大地增强；英国开展了色氨酸基因工程的研究，用DNA限制性核酸内切酶把trpA-trpB两个基因从染色体切下连到载体上，并转化大肠杆菌，所获转化体的合成酶β2 亚单位活性提高 230 倍，酶的含量约占菌体蛋白的 20％，色氨酸产量提高。氨基酸基因工程的研究尽管取得了一些进展，但至目前“工程菌”的产酸能力普遍较低，还不十分稳定，能够达到工业化生产水平的为数不多。不过，作为一项发展迅速技术，基因工程对氨基酸生产和应用有着巨大的潜力，若把基因工程技术成果与固定化、生物反应器等其他新兴技术有机结合起来，定能发挥更大的效用。 5 展望氨基酸广泛应用于生产、生活的诸多方面，以其在生理作用上的不可取代性，决不会因社会技术的进步而被更迭或淘汰。氨基酸生产技术不断进步，验证又刺激了氨基酸代谢相关的理论研究。氨基酸发酵是当今氨基酸生产的主要模式，应用重组DNA技术使氨基酸发酵工业方兴未艾。在氨基酸发酵整体优化方面，由于其系统性和便捷性，运用计算计软件进行算法和模型的构建愈发受到关注，正在形成遗传算法、神经网络和模糊控制相结合，进而构成一种新型的智能控制系统整体优化的结构形式。发酵后处理依然是氨基酸生产研究的热点，络合萃取和膜分离等技术在分离纯化氨基酸发酵液方面都取得了令人欣喜的成果，为产业革新提供了充足的动力。参考文献 [1] 江宁. 微生物生物技术[M]. 北京:化学工业出版社,2008:73-137. [2] 彭珍荣. 微生物资源与氨基酸的生产和应用[J]. 化学与生物工程,2003,20(6):7-8. [3] 陈燕珠. 氨基酸的应用与发展趋势[J]. 化工时刊,2001,15(7):4-6. [4] 王宏龄 , 富春江 . 国外知名氨基酸生产企业最新动态 [J]. 精细与专用化学品,2004,12(17):21-24. [5] 俞俊棠,唐孝宣,邬行彦,等. 新编生物工艺学[M]. 北京:化学工业出版社,2003:205-217. 第 5 页共 5 页