医学实验方法与技术 蛋白质研究方法与技术 电子科技大学医学院 王子艳 wangzifengshe@163.com
蛋白质研究方法与技术 电子科技大学医学院 王子艳 wangzifengshe@163.com 医学实验方法与技术
课程内容 ▣蛋白质研究的背景与发展 ▣Western blot(主要讲解部分) ▣蛋白质研究的其他方法
课程内容 蛋白质研究的背景与发展 Western blot(主要讲解部分) 蛋白质研究的其他方法
实验室常用蛋白质研究方法 Pull-down 基因敲除 免疫共沉淀 免疫荧光 酵母双杂交 蛋白芯片 Elisa 冷冻电镜(Cryo-SEM)
实验室常用蛋白质研究方法 Pull-down 免疫共沉淀 酵母双杂交 Elisa 基因敲除 免疫荧光 蛋白芯片 冷冻电镜（Cryo-SEM）
Signaling Pathway via Protein Pl3 Kinase/Akt Signaling Autophagy Signaling Macroautophagy CD19 PI3K-V/Akt MAPK/Erk1/2 Mitophagy Signaling Signaling Mitochondrial b Damage Parkin GPCR AAMP:>AMPK ATP p53/Genotoxic ub-targets *06886 PARL Amino ATMATR DNA-PK GBL mTOR Raptor BNIP3 Signaling PRAS40 BNIP3U/NIX PTEN mTORC2 PIP PTEN PP2A PHLPP12 CTMP O L NEDD1-4 Atg13 FIP200 Oxidative TBK1 ULK1 Suess 47pho p150 p7050g Lamin A PI3K SQSTM1/p62 Tpl2 Beclln-1 Membrane NBR1+LC3-11 PDCD4 TSC2 .(KKo Bcl-2 (Atg14 Nucleation Ambra1 +mTORC1 TSC1 Ambrat Apoptosis Rubicon ATG13 GABAAR Akt Sequestration Atnxin-1 08 P件KFB2 SK-3 SQSTM1/p62 Bim PIP5K A1g16L1 A1g12Atgs 吃 Bcl-2 0号+Nei+Lc3 Cytoplasmic 5p2 5CF Contents ALFY Girdin G5 A1g16L1 Atg3 -PE Fusion Atg5 Atg10 mTORC1 mTORC2 Atg7 Autophagolysosome CDK2 Cyclin Atg7 LC3- Lysosome Atg12 Atg4 LC3
Signaling Pathway via Protein
蛋白质的相互作用 ▣定义：两个或两个以上蛋白质结合在一起 执行生物学功能时，发生的相互作用 蛋白质带有发挥作用的空间位点 蛋白质的构象会发生改变，蛋白质的功能 以此被激活或抑制 ▣功能：主要介导生物催化、物质转运、信 号传导、免疫反应、转录调控等生命过程
蛋白质的相互作用 定义：两个或两个以上蛋白质结合在一起 执行生物学功能时，发生的相互作用 • 蛋白质带有发挥作用的空间位点 • 蛋白质的构象会发生改变，蛋白质的功能 以此被激活或抑制 功能：主要介导生物催化、物质转运、信 号传导、免疫反应、转录调控等生命过程
蛋白质相互作用研究方法 ▣Pull-down(体外蛋白质相互作用) ▣CO-lP(co-immunoprecipitation,免疫共沉淀) ▣Yeast two-hybrid system(酵母双杂交系统) FRET(fluorescent resonant energy transfer, 光共振能力转移) ▣BlFC(bimolecular flurescent complement,双分 子荧光互补)
蛋白质相互作用研究方法 Pull-down(体外蛋白质相互作用) CO-IP(co-immunoprecipitation,免疫共沉淀) Yeast two-hybrid system(酵母双杂交系统) FRET(fluorescent resonant energy transfer,荧 光共振能力转移) BIFC(bimolecular flurescent complement,双分 子荧光互补)
Pull-down(in vitro） 口原理：利用GST、HIS等标签蛋白将一种蛋白质 (诱饵蛋白)固定于某种基质上（如 sepharose)，当细胞抽提液经过该基质时，可 与该诱饵蛋白发生相互作用的配体蛋白被吸附 通过改变洗脱液或洗脱条件即可回收所吸附的 蛋白，并用于下一步检测分析 Bait Prey GST
Pull-down（in vitro） 原理：利用GST、HIS等标签蛋白将一种蛋白质 （诱饵蛋白）固定于某种基质上（如 sepharose），当细胞抽提液经过该基质时，可 与该诱饵蛋白发生相互作用的配体蛋白被吸附， 通过改变洗脱液或洗脱条件即可回收所吸附的 蛋白，并用于下一步检测分析 GST Bait Prey
Pull-down-融合蛋白的表达 tac_promoter M13 pUC fwd_primer M13_puC_rev_primer M13_forward20_prime MscI 465 构建融合表达载体 M13_reverse_primer M13_pUC_rev_primer lac_promoter BstBI 655 GST pGEX 5 prlmer BaTHI 930 5124 loxP AmpR_promoter 大肠杆菌(BL21) EcoRI 1097 46 9ma11104 SalI 1107 转化 XhoI 1112 NotI 1118 lacI Eag11118 V621 pGEX-4T-LP Acceptor oGEX 3 prlmer 3843 1281 5127bp 挑取大肠杆菌 (BL21)表达克隆 AatII 1403 341E 1708 AmpR_promoter 2989 2195 IPTG诱导大肠杆菌 2562 BL21)表达蛋白 Ampicillin pBR322_origin PstI 2080 提取纯化融合蛋白 pGEX-4T-1-GST
Pull-down-融合蛋白的表达 构建融合表达载体 大肠杆菌（BL21） 转化 挑取大肠杆菌 （BL21）表达克隆 IPTG诱导大肠杆菌 （BL21）表达蛋白 提取纯化融合蛋白 pGEX-4T-1-GST
Pul-down实验流程 Step 1.Immobilize the fusion-tagged Step 2.Wash away unbound protein. Step 3.Bind "prey"protein to "bait"from the lysate. immobilized“bait°protein. >BatP酒 Gel Affinity Ligand Co*2 Chelatel P● Bait Protein-Containing Prey Protein-Containing Lysate 2B Spin Step 4.Wash away unbound protein. Step 5.Elute protein:protein interaction Step 6.Analyze protein:protein complex. interaction complex on SDS-PAGE B赋 Prey 828 Mk世 Purifed Agarose Puified 8 G Protein:Pr域n Control Interaction Spin sPM道 Displaced Interacting Complex =Fusicn Tag (GST or polyHis)
Pull-down实验流程
Pul-down的应用 ▣鉴定两个已知蛋白质之间是否存在相互作 用 ▣筛选与己知融合蛋白相互作用的未知蛋白 质
Pull-down的应用 鉴定两个已知蛋白质之间是否存在相互作 用 筛选与已知融合蛋白相互作用的未知蛋白 质