电子科越女学医学院 School of Medicine UESTC 细胞相关实验技术 杨静 yangjing1977@uestc.edu.cn
细胞相关实验技术 杨 静 yangjing1977@uestc.edu.cn
细胞学实验是生命科学研究不可或缺的部分 地球上所有的生物都起源于30亿年前的一个原始细胞，从那时起细 胞分裂从未间断。每个人的生命都开始于单个细胞一 受精卵，经 不断分裂最终产生了我们整个身体100万亿(1014)个细胞。在我们 身体内，每秒都有成百上千个细胞在分裂。 安德斯.塞特博格2001年生理学医学诺贝尔颁奖仪式 每一个生物学问题的关键最终必将从细胞中寻找。 Wilson E.B.《细胞的发育与遗传》
细胞学实验是生命科学研究不可或缺的部分 地球上所有的生物都起源于30亿年前的一个原始细胞，从那时起细 胞分裂从未间断。每个人的生命都开始于单个细胞——受精卵，经 不断分裂最终产生了我们整个身体100万亿（1014）个细胞。在我们 身体内，每秒都有成百上千个细胞在分裂。 安德斯.塞特博格 2001年生理学医学诺贝尔颁奖仪式 每一个生物学问题的关键最终必将从细胞中寻找。 Wilson E.B. 《细胞的发育与遗传》
细胞学实验是生命科学研究中不可或缺的部分 Nobel Prize in Physiology or Medicine 19012016(total:107) 细胞表面调节免疫的遗传结构研究 (1980) 发现神经生长因子及上皮细胞生长因子 (1986) G蛋白及其在细胞中的信号转导 (1994) 发现细胞的中介免疫保护特征（1996) 17 细胞蛋白质内部信号决定其在细胞内定位和移动 (1999) 脑细胞间信号的相互传递（2000) 细胞相关 细胞分裂的关键调节机制(2001) 器官发育和程序性细胞死亡(2002) 25 获得性免疫中树突细胞及其功能的发现 (2011) iPS细胞(2012) 细胞转运系统-囊泡运输 (2013) (其它) 细胞结构和机能的研究 细胞自噬分子机制 ~1974~ ~2016~
细胞学实验是生命科学研究中不可或缺的部分 1901~2016 （ total: 107） Nobel Prize in Physiology or Medicine 细胞结构和机能的研究 ~1974~ 细胞自噬分子机制 ~2016~ 17 细胞相关 25 细胞表面调节免疫的遗传结构研究 （1980） 发现神经生长因子及上皮细胞生长因子 （1986） G蛋白及其在细胞中的信号转导 （1994） 发现细胞的中介免疫保护特征 （1996） 细胞蛋白质内部信号决定其在细胞内定位和移动 （1999） 脑细胞间信号的相互传递（2000） 细胞分裂的关键调节机制 （2001） 器官发育和程序性细胞死亡 （2002） 获得性免疫中树突细胞及其功能的发现 （2011） iPS细胞 （2012） 细胞转运系统-囊泡运输 （2013） 。。。。。。（其它）
常规细胞学实验技术 I.细胞培养 >细胞培养实验室 细胞培养一般程序 >细胞计数 >细胞生长增殖测定 >细胞系鉴定 >细胞的微生物和病毒污染检测 >特殊类型细胞培养 Ⅱ.细胞分离技术 Ⅲ.细胞转染 V.细胞侵袭实验 V.细胞周期分析 I.细胞凋亡检测 Ⅶ.代表性的培养细胞系及其特性
常规细胞学实验技术 Ⅰ. 细胞培养 Ⅱ. 细胞分离技术 Ⅲ. 细胞转染 Ⅵ. 细胞凋亡检测 Ⅴ. 细胞周期分析 Ⅶ. 代表性的培养细胞系及其特性 细胞培养实验室 细胞培养一般程序 细胞计数 细胞生长增殖测定 细胞系鉴定 细胞的微生物和病毒污染检测 特殊类型细胞培养 Ⅳ.细胞侵袭实验
I细胞培养
Ⅰ 细胞培养
I细胞培养 细胞培养实验室环境和基本条件 基本环境 生物实验室分类 P1级：适用于对健康成年人无致病作用的微生物。 P2级：适用于对人和环境有中等潜在危害的微生物。 P3级：适用于主要通过呼吸途径使人传染上严重甚至致死疾病的致病微生物或其毒素。 P4级：适用于对人体具有高度危险性，通过汽溶胶途径传播或传播途径不明、目前 尚无有效疫苗或治疗方法的致病微生物或其毒素。 空间相对独立 洁净、无尘、易于消毒灭菌 (HEPA膜) 恒温恒湿、气流的单向流动
Ⅰ细胞培养 细胞培养实验室环境和基本条件 基本环境 生物实验室分类 P1级：适用于对健康成年人无致病作用的微生物。 P2级：适用于对人和环境有中等潜在危害的微生物。 P3级：适用于主要通过呼吸途径使人传染上严重甚至致死疾病的致病微生物或其毒素。 P4级：适用于对人体具有高度危险性，通过汽溶胶途径传播或传播途径不明、目前 尚无有效疫苗或治疗方法的致病微生物或其毒素。 空间相对独立 洁净、无尘、易于消毒灭菌 （HEPA膜） 恒温恒湿、气流的单向流动
I细胞培养 细胞培养实验室环境和基本条件 基本设备 生物安全柜 CO2培养箱 倒置相差显微镜（荧光) 二级(HEPA;下沉气流；负压环绕；紫外) 细胞计数仪 微量移液器 冰箱 液氨罐 台式离心机 恒温水浴箱
Ⅰ细胞培养 细胞培养实验室环境和基本条件 基本设备 生物安全柜 二级（HEPA; 下沉气流；负压环绕；紫外） CO2 培养箱 冰箱 台式离心机 倒置相差显微镜（荧光） 细胞计数仪 微量移液器 液氮罐 恒温水浴箱
工细胞培养 细胞培养实验室环境和基本条件 常用试剂 > 细胞培养基 (PH7.2-7.4;渗透压260-320m0sm/kg;5%C02) ●天然培养基 血浆、血清、淋巴液、鸡胚浸出液、水解乳蛋白等 ●平衡盐溶液 如D-anks液、Eage's液 基础培养基 如M199、MEM、RPMI-1640、DMEM、DMEM/F12等。主要包括 氨基酸(L谷氨酰胺)、维生素、碳水化合物、无机盐等(+小牛血清) ●低血清培养基营养成分优于基础培养基，仅需添加1%~5%小牛血清 无血清培养基 基础培养基十生长因子。成分明确；能用于悬浮细胞培养；昂贵 胰蛋白酶 传代时消化细胞；工作浓度0.25%（-/+0.02%EDTA) >抗生素 预防细菌污染，视不同情况选择加或不加 常用PS双抗（青霉素-链霉素双抗) > DMSO 冻存细胞时保护细胞；冻存液工作浓度10% >PBS
Ⅰ细胞培养 细胞培养实验室环境和基本条件 常用试剂 天然培养基 血浆、血清、淋巴液、鸡胚浸出液、水解乳蛋白等 平衡盐溶液 如D-Hanks液、 Eagle's液 基础培养基 如M199、MEM、RPMI-1640、DMEM 、DMEM/F12等。主要包括 氨基酸（L-谷氨酰胺）、维生素、碳水化合物、无机盐等（+小牛血清） 低血清培养基 营养成分优于基础培养基，仅需添加1％～5％小牛血清 无血清培养基 基础培养基+生长因子。成分明确；能用于悬浮细胞培养；昂贵 细胞培养基 （PH 7.2-7.4；渗透压 260-320 mOsm/kg；5% CO2） 胰蛋白酶 传代时消化细胞；工作浓度0.25%（-/+0.02% EDTA） 抗生素 预防细菌污染；视不同情况选择加或不加 常用PS双抗（青霉素-链霉素双抗） DMSO 冻存细胞时保护细胞；冻存液工作浓度10% PBS
I细胞培养 细胞培养实验室环境和基本条件 常用耗材
常用耗材 Ⅰ细胞培养 细胞培养实验室环境和基本条件
I细胞培养 细胞培养实验室环境和基本条件 细胞培养室基本规则 规范着装无菌观念！ 实验服；无菌手套；专用拖鞋；口罩 用酒精消毒进入生物安全柜和培养箱的物品 生物安全柜使用前后紫外灯照射30min以上 。 废液消毒；废弃枪头收集处理 培养箱定期消毒；防止真菌支原体等污染 所有新入细胞株均需要质控确定无污染 。 两次不同类细胞操作应间隔15min以上 不允许在细胞间吃东西和喝水
细胞培养室基本规则 Ⅰ细胞培养 细胞培养实验室环境和基本条件 规范着装 无菌观念！ • 实验服；无菌手套；专用拖鞋；口罩 • 用酒精消毒进入生物安全柜和培养箱的物品 • 生物安全柜使用前后紫外灯照射30min以上 • 废液消毒；废弃枪头收集处理 • 培养箱定期消毒；防止真菌支原体等污染 • 所有新入细胞株均需要质控确定无污染 • 两次不同类细胞操作应间隔15min以上 • 不允许在细胞间吃东西和喝水