第十六章 一、仪器与结构流程 分子发光分析法 instrument and general process molecular luminescence 二、荧光分析法和应用 analysis fluorescence analysis and application 第二节 三、磷光分析法的应用 分子荧光与磷光分析法 phosphorescence analysis and application molecular fluorescence and phosphorescence analysis 下一页 231212
23:12:12 第十六章 分子发光分析法 一、 仪器与结构流程 instrument and general process 二、 荧光分析法和应用 fluorescence analysis and application 三、 磷光分析法的应用 phosphorescence analysis and application 第二节 分子荧光与磷光分析法 molecular luminescence analysis molecular fluorescence and phosphorescence analysis
、 仪器结构流程 测量荧光的仪器主要由四个部分组成：激发光源、样品 池、双单色器系统、检测器。 特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。 基本流程如图： 单色器：选择激发光波长 光源 的第一单色器和选择发射 第一单色器 或 光（测量）波长的第二单色 滤光片 记录仪 器； 激发 荧光 第二单色器 光源：灯和高压汞灯，染 或 滤光片 料激光器（可见与紫外区） 样品池 检测器 检测器：光电倍增管。 荧光分析仪基本部件示意图 23:12:12
23:12:12 一、仪器结构流程 测量荧光的仪器主要由四个部分组成：激发光源、样品 池、双单色器系统、检测器。 特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。 基本流程如图： 单色器：选择激发光波长 的第一单色器和选择发射 光(测量)波长的第二单色 器； 光源：灯和高压汞灯，染 料激光器(可见与紫外区) 检测器：光电倍增管
仪器光路图 日立F-4500荧光分光光度计的光学系统图 1一氙灯(150W)；2一透镜；3一光束分裂器，4,11一水平夹缝； 5一激发单色器光栅；6一参考光电管，7一光闸：8一样品池； 9一样品室光闸；10一发射单色器光栅；12一光电倍增管(R-3788) 23:12:12
23:12:12 仪 器 光 路 图
仪器框图 12 该型仪器可进 13 16 行荧光、磷光 10 和发光分析： 11 与9 通 与8通 与3通 附件 LS50B发光分光光度计框图 1一电源，2一氙灯，3一澈发单色器；4一激发夹缝和光栅马达： 5一参考光电倍增管，6一光束分裂器：7一样品室；8一滤光片轮， 9一发射单色器，10一发射夹缝和光栅马达，11一光电倍增管， 12-模拟子系统，13一CPU系统，14一光电倍增管电压稳定单元： 15一步进马达控制，16一计算机 23:12:12
23:12:12 仪器框图 该型仪器可进 行荧光、磷光 和发光分析；
同步扫描技术 根据激发和发射单色器在扫描过程中彼此间所保持的 关系，同步扫描可分为固定波长差（△入）和固定能量差及可 变波长三种； 同步扫描技术可简化光谱，谱 带变窄，减少光谱重叠，提高分辨 率；如图。 合适的△)可减少光谱重叠； 酪氨酸和色氨酸的荧光激发光谱相 似，发射光谱严重重叠，但 300 400 △入60nm时，只显示色 乙醇溶液中的荧光发射谱(a) 氨酸的特征光谱，实现分别测定。 和混合物的同步荧光光谱(b) 23:12:12
23:12:12 同步扫描技术 根据激发和发射单色器在扫描过程中彼此间所保持的 关系，同步扫描可分为固定波长差()和固定能量差及可 变波长三种； 同步扫描技术可简化光谱，谱 带变窄，减少光谱重叠，提高分辨 率； 如图。 合适的可减少光谱重叠； 酪氨酸和色氨酸的荧光激发光谱相 似 ， 发射光谱严重重叠 ， 但 60nm时，只显示色 氨酸的特征光谱，实现分别测定
可获得三维光谱图的仪器 可获得激发光谱与发射光谱同时变化时的荧（磷）光光谱图 EX EM 00 600 A/nm 常规激发光谱和发射光谐 600 带正交多色器光学系统和硅强化靶多通道检测器的 100 快速扫描荧光分光光度计组成示意图 500 600 700 1一硅强化靶多通道检测器：2一分析多色器：3一场透镜：4一透镜系统 入m/nm 5一样品池，6一激发多色器，7,9-150W氙灯，8一激发单色器 图 三维光谱 23:12:12
23:12:12 可获得三维光谱图的仪器 可获得激发光谱与发射光谱同时变化时的荧(磷)光光谱图
磷光检测 荧光计上配上磷光测量附件即可对磷光进行测量。在有 荧光发射的同时测量磷光。 测量方法： (1)通常借助于荧光和磷 光寿命的差别，采用磷光 镜的装置将荧光隔开。 发射光 (2)采用脉冲光源和可控 发射 检测及时间分辨技术。 室温测量时，不需要 转简式磷光镜(a)和转盘式磷光镜(b) 杜瓦瓶。 1一试样池，2一杜瓦瓶，3一电机轴 23:12:12
23:12:12 磷光检测 荧光计上配上磷光测量附件即可对磷光进行测量。在有 荧光发射的同时测量磷光。 测量方法： （1）通常借助于荧光和磷 光寿命的差别，采用磷光 镜的装置将荧光隔开。 （2）采用脉冲光源和可控 检测及时间分辨技术。 室温测量时，不需要 杜瓦瓶
二、荧光分析方法与应用 1. 特点 (1)灵敏度高 比紫外-可见分光光度法高2~4个数量级；为什么？ 检测下限：0.1~0.1μg/cm3 相对灵敏度：0.05mo1/L奎宁硫酸氢盐的硫酸溶液。 (2) 选择性强 既可依据特征发射光谱，又可根据特征吸收光谱； (3)试样量少 缺点：应用范围小。 23:12:12
23:12:12 二、荧光分析方法与应用 1. 特点 （1）灵敏度高 比紫外-可见分光光度法高2～4个数量级；为什么？ 检测下限：0.1～0.1g/cm-3 相对灵敏度：0.05mol/L 奎宁硫酸氢盐的硫酸溶液。 （2）选择性强 既可依据特征发射光谱，又可根据特征吸收光谱； （3）试样量少 缺点：应用范围小
2.定量依据与方法 ()定量依据 荧光强度I正比于吸收的光量I,和荧光量子效率φ： I=φa 由朗-比耳定律：I=Io(1-10e1c) L=01(1-10e1c)=p1(1-e2.3e1c) 浓度很低时，将括号项近似处理后： I=2.3φI8lc=Kc 23:12:12 页下
23:12:12 2.定量依据与方法 (1)定量依据 荧光强度If正比于吸收的光量Ia和荧光量子效率 ： If = Ia 由朗-比耳定律：Ia = I0 (1-10- l c ) If = I0 (1-10- l c ) = I0 (1-e -2.3 l c ) 浓度很低时，将括号项近似处理后： If = 2.3 I0 l c = Kc
(2)定量方法 标准曲线法： 配制一系列标准浓度试样测定荧光强度，绘制标准曲 线，再在相同条件下测量未知试样的荧光强度，在标准曲线 上求出浓度； 比较法： 在线性范围内，测定标样和试样的荧光强度，比较； 23:12:12
23:12:12 （2）定量方法 标准曲线法： 配制一系列标准浓度试样测定荧光强度，绘制标准曲 线，再在相同条件下测量未知试样的荧光强度，在标准曲线 上求出浓度； 比较法： 在线性范围内，测定标样和试样的荧光强度，比较；