实验一 细菌的简单染色法和革兰氏染色法 一、目的要求 1. 学习微生物涂片、染色的基本技术，并掌握革兰氏染色的方法。 2. 初步认识细菌的形态特征，掌握无菌操作技术。 3. 了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。 二、基本原理 1. 简单染色法： 用单一染料进行细菌染色，操作简便，适于菌体一般形状和细菌排列的观察。 常用碱性染料进行简单染色，这是因为：在中性、碱性或弱碱性溶液中，细 菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷（酸性 染料电离时，其分子的染色部分带正电荷），因此碱性染料的染色部分很容易与 细菌结合使细菌着色，经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下 易于识别。常用作简单染色的染料有：美蓝、结晶紫、碱性复红等。 2. 革兰氏染色法 革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。它是 1884 年由丹麦医生 Gram 创立的。革兰氏染色法（Gram stain）不仅能观察到细菌的形态特征而且还 可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用 G + 表示；染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏染色阴性细菌，用 G -表示。 细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同造成的。 革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是肽聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中， 当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶 紫－碘复合物被保留在细胞内而不易着色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌 的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解， 细胞壁的通透性增加，使结晶紫－碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上 了复染液（番红）的颜色，因此呈现红色。 革兰氏染色需用四种不同的溶液：碱性染料（basic dye）初染液；媒染剂 （mordant）；脱色剂（decolorising agent）和复染液(counterstain) 。碱性染料的 作用象在细菌的简单染色法基本原理中所述的那样，而用于革兰氏染色的初染液 一般是结晶紫(crystal violet)。媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和力或附 着力，即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使不易脱落，不同类型的细胞脱色 反应不同，有的能被脱色，有的则不能，脱色剂常用 95％的酒精(ethanol)。复染 液也是一种碱性染料，其颜色不同于初染液，复染的目的是使被脱色的细胞染上 不同于初染液的颜色，而未被脱色的细胞仍然保持初染的颜色，从而将细胞区分 成 G +和 G -两大类群，常用的复染液是番红。 三、器材 大肠杆菌(Escherichia coli)，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，枯草芽 孢杆菌(Bacillus subtilis)，藤黄微球菌(Micrococcus luteus)，蜡样芽孢杆菌(B. cereus)12～20h 斜面培养物；革兰氏染液，载玻片，显微镜等。 四、操作步骤
实验一 细菌的简单染色法和革兰氏染色法 一、目的要求 1. 学习微生物涂片、染色的基本技术，并掌握革兰氏染色的方法。 2. 初步认识细菌的形态特征，掌握无菌操作技术。 3. 了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。 二、基本原理 1. 简单染色法： 用单一染料进行细菌染色，操作简便，适于菌体一般形状和细菌排列的观察。 常用碱性染料进行简单染色，这是因为：在中性、碱性或弱碱性溶液中，细 菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷（酸性 染料电离时，其分子的染色部分带正电荷），因此碱性染料的染色部分很容易与 细菌结合使细菌着色，经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下 易于识别。常用作简单染色的染料有：美蓝、结晶紫、碱性复红等。 2. 革兰氏染色法 革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。它是 1884 年由丹麦医生 Gram 创立的。革兰氏染色法（Gram stain）不仅能观察到细菌的形态特征而且还 可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用 G + 表示；染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏染色阴性细菌，用 G -表示。 细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同造成的。 革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是肽聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中， 当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶 紫－碘复合物被保留在细胞内而不易着色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌 的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解， 细胞壁的通透性增加，使结晶紫－碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上 了复染液（番红）的颜色，因此呈现红色。 革兰氏染色需用四种不同的溶液：碱性染料（basic dye）初染液；媒染剂 （mordant）；脱色剂（decolorising agent）和复染液(counterstain) 。碱性染料的 作用象在细菌的简单染色法基本原理中所述的那样，而用于革兰氏染色的初染液 一般是结晶紫(crystal violet)。媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和力或附 着力，即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使不易脱落，不同类型的细胞脱色 反应不同，有的能被脱色，有的则不能，脱色剂常用 95％的酒精(ethanol)。复染 液也是一种碱性染料，其颜色不同于初染液，复染的目的是使被脱色的细胞染上 不同于初染液的颜色，而未被脱色的细胞仍然保持初染的颜色，从而将细胞区分 成 G +和 G -两大类群，常用的复染液是番红。 三、器材 大肠杆菌(Escherichia coli)，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，枯草芽 孢杆菌(Bacillus subtilis)，藤黄微球菌(Micrococcus luteus)，蜡样芽孢杆菌(B. cereus)12～20h 斜面培养物；革兰氏染液，载玻片，显微镜等。 四、操作步骤
1. 涂片 取两块载玻片，各滴一小滴蒸馏水于玻片中央，用接种环以无菌 操作分别从培养14～16h的枯草芽孢杆菌和培养24h的大肠杆菌的斜面上挑取少 量菌苔于水滴中，混匀并涂成薄膜。 载玻片要洁净无油迹；滴蒸馏水和取菌不宜过多；涂片要均匀，不宜过厚。 2. 干燥 室温自然干燥。 3. 固定 固定时通过火焰 2～3 次即可。此过程称热固定，其目的是使细胞 质凝固，以固定细胞形态，并使之牢固附着在载玻片上。 热固定温度不易过高，以载玻片背面不烫手为宜，否则会改变甚至破坏细 胞形态。 4. 染色 （1）简单染色法： ① 染色 滴加染液于涂片上(染液刚好覆盖涂片薄膜为宜)。吕氏碱性美蓝染 色 1～2min；石炭酸复红或草酸铵结晶紫染色约 1min。 ② 水洗 倾去染液，用自来水冲洗，直至涂片上流下的水无色为止。 水洗时，不要直接冲洗液面，而应使水从载玻片的一段流下，水流不易过 急过大，以免涂片薄膜脱落。 ③ 干燥 自然干燥或用电吹风吹干，也可用吸水纸吸干。 ④ 镜检 涂片干燥后镜检。 （2）革兰氏染色法： ① 初染 加草酸铵结晶紫一滴，约 1～2min，水洗。 ② 媒染 滴加碘液冲去残水，并覆盖约 1min，水洗。 ③ 脱色 将载玻片上面的水甩净，并衬以白背景，用 95％酒精滴洗至流出 酒精刚刚不出现蓝色时为止，约 20～30s，立即用水冲净酒精。 ④ 复染 用番红液染 1～2min，水洗。 ⑤ 镜检 干燥后，置油镜下观察。革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫 色。以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性。 (3) 混合涂片法： 按上述方法，在同一玻片上，以大肠杆菌和枯草芽孢杆菌或金黄色葡萄球菌混合 涂片、染色、镜检进行比较。 革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度，如脱色过度，则阳性菌可被 误染为阴性菌；而脱色不够时，阴性菌可被误染为阳性菌。此外，菌龄也影响染 色结果，如阳性菌培养时间过长，或已死亡及部分菌自行溶解了，都常呈阴性反 应
1. 涂片 取两块载玻片，各滴一小滴蒸馏水于玻片中央，用接种环以无菌 操作分别从培养14～16h的枯草芽孢杆菌和培养24h的大肠杆菌的斜面上挑取少 量菌苔于水滴中，混匀并涂成薄膜。 载玻片要洁净无油迹；滴蒸馏水和取菌不宜过多；涂片要均匀，不宜过厚。 2. 干燥 室温自然干燥。 3. 固定 固定时通过火焰 2～3 次即可。此过程称热固定，其目的是使细胞 质凝固，以固定细胞形态，并使之牢固附着在载玻片上。 热固定温度不易过高，以载玻片背面不烫手为宜，否则会改变甚至破坏细 胞形态。 4. 染色 （1）简单染色法： ① 染色 滴加染液于涂片上(染液刚好覆盖涂片薄膜为宜)。吕氏碱性美蓝染 色 1～2min；石炭酸复红或草酸铵结晶紫染色约 1min。 ② 水洗 倾去染液，用自来水冲洗，直至涂片上流下的水无色为止。 水洗时，不要直接冲洗液面，而应使水从载玻片的一段流下，水流不易过 急过大，以免涂片薄膜脱落。 ③ 干燥 自然干燥或用电吹风吹干，也可用吸水纸吸干。 ④ 镜检 涂片干燥后镜检。 （2）革兰氏染色法： ① 初染 加草酸铵结晶紫一滴，约 1～2min，水洗。 ② 媒染 滴加碘液冲去残水，并覆盖约 1min，水洗。 ③ 脱色 将载玻片上面的水甩净，并衬以白背景，用 95％酒精滴洗至流出 酒精刚刚不出现蓝色时为止，约 20～30s，立即用水冲净酒精。 ④ 复染 用番红液染 1～2min，水洗。 ⑤ 镜检 干燥后，置油镜下观察。革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫 色。以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性。 (3) 混合涂片法： 按上述方法，在同一玻片上，以大肠杆菌和枯草芽孢杆菌或金黄色葡萄球菌混合 涂片、染色、镜检进行比较。 革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度，如脱色过度，则阳性菌可被 误染为阴性菌；而脱色不够时，阴性菌可被误染为阳性菌。此外，菌龄也影响染 色结果，如阳性菌培养时间过长，或已死亡及部分菌自行溶解了，都常呈阴性反 应
实验二 细菌的芽孢和荚膜染色法 一、实验目的 1. 学习并掌握芽孢和荚膜染色法 2. 初步了解芽孢和荚膜的形态。 二、基本原理 芽孢又叫内生孢子(endosopre)，是某些细菌生长到一定阶段在菌体内形成的 休眠体，通常呈圆形或椭圆形。细菌能否形成芽孢以及芽孢的形状、芽孢在芽孢 囊内的位置、芽孢囊是否膨大等特征是鉴定细菌的依据之一。 芽孢染色法是利用细菌的芽孢和菌体对染料的亲和力不同的原理，用不同染 料进行着色，使芽孢和菌体呈不同的颜色而便于区别。芽孢壁厚、透性低，着色、 脱色均较困难，因此，当先用弱碱性染料，如孔雀绿（malachite green）或碱性 品红（basic fuchsin）在加热条件下进行染色时，此染料不仅可进入菌体，而且 也可进入芽孢，进入菌体的染料可经水洗脱色，而进入芽孢的染料则难以透出， 若再用复染液（如番红液）或衬托溶液（如黑色素溶液）处理，则菌体和芽孢易 于区分。 荚膜是包围在细菌细胞外面的一层粘液性物质，其主要成分是多糖类，不易 染色，故常用衬托染色法，即将菌体和背景着色，而把不着色且透明的荚膜衬托 出来。荚膜很薄，易变形，因此，制片时一般不用热固定。 三、器材 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），腊样芽孢杆菌（B. cereus），球形芽孢 杆菌(B. sphaericus)，生孢梭菌（Clostridium sporogenes）；圆褐固氮菌（Azotobacter chroococcum）或胶质芽孢杆菌(B. mucilaginosus)约 2d 无氮培养基琼脂斜面培养 物；孔雀绿染液，番红水溶液，苯酚品红溶液，黑色素溶液。 荚膜染色液：绘图墨水，1％甲基紫水溶液，1％结晶紫水溶液，6％葡萄糖 水溶液，20％硫酸铜水溶液，纯甲醇等。 四、操作步骤 （一）荚膜染色技术 方法一： （1）将培养 24h 左右的枯草芽孢杆菌或其他芽孢杆菌，作涂片、干燥、固定。 （2）滴加 3～5 滴孔雀绿染液于已固定的涂片上。 （3）用木夹夹住载玻片在火焰上加热，使染液冒蒸汽但勿沸腾，切忌使染液 蒸干，必要时可添加少许染液。加热时间从染液冒蒸汽时开始计算约 4~5min。 这一步也可不加热，改用饱和的孔雀绿水溶液染 10min。 （4）倾去染液，待玻片冷却后水洗至孔雀绿不再退色为止。 （5）用番红水溶液复染 1min，水洗。 （6）待干燥后，置油镜观察，芽孢呈绿色，菌体呈红色。 方法二：
实验二 细菌的芽孢和荚膜染色法 一、实验目的 1. 学习并掌握芽孢和荚膜染色法 2. 初步了解芽孢和荚膜的形态。 二、基本原理 芽孢又叫内生孢子(endosopre)，是某些细菌生长到一定阶段在菌体内形成的 休眠体，通常呈圆形或椭圆形。细菌能否形成芽孢以及芽孢的形状、芽孢在芽孢 囊内的位置、芽孢囊是否膨大等特征是鉴定细菌的依据之一。 芽孢染色法是利用细菌的芽孢和菌体对染料的亲和力不同的原理，用不同染 料进行着色，使芽孢和菌体呈不同的颜色而便于区别。芽孢壁厚、透性低，着色、 脱色均较困难，因此，当先用弱碱性染料，如孔雀绿（malachite green）或碱性 品红（basic fuchsin）在加热条件下进行染色时，此染料不仅可进入菌体，而且 也可进入芽孢，进入菌体的染料可经水洗脱色，而进入芽孢的染料则难以透出， 若再用复染液（如番红液）或衬托溶液（如黑色素溶液）处理，则菌体和芽孢易 于区分。 荚膜是包围在细菌细胞外面的一层粘液性物质，其主要成分是多糖类，不易 染色，故常用衬托染色法，即将菌体和背景着色，而把不着色且透明的荚膜衬托 出来。荚膜很薄，易变形，因此，制片时一般不用热固定。 三、器材 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），腊样芽孢杆菌（B. cereus），球形芽孢 杆菌(B. sphaericus)，生孢梭菌（Clostridium sporogenes）；圆褐固氮菌（Azotobacter chroococcum）或胶质芽孢杆菌(B. mucilaginosus)约 2d 无氮培养基琼脂斜面培养 物；孔雀绿染液，番红水溶液，苯酚品红溶液，黑色素溶液。 荚膜染色液：绘图墨水，1％甲基紫水溶液，1％结晶紫水溶液，6％葡萄糖 水溶液，20％硫酸铜水溶液，纯甲醇等。 四、操作步骤 （一）荚膜染色技术 方法一： （1）将培养 24h 左右的枯草芽孢杆菌或其他芽孢杆菌，作涂片、干燥、固定。 （2）滴加 3～5 滴孔雀绿染液于已固定的涂片上。 （3）用木夹夹住载玻片在火焰上加热，使染液冒蒸汽但勿沸腾，切忌使染液 蒸干，必要时可添加少许染液。加热时间从染液冒蒸汽时开始计算约 4~5min。 这一步也可不加热，改用饱和的孔雀绿水溶液染 10min。 （4）倾去染液，待玻片冷却后水洗至孔雀绿不再退色为止。 （5）用番红水溶液复染 1min，水洗。 （6）待干燥后，置油镜观察，芽孢呈绿色，菌体呈红色。 方法二：
（1）取两支洁净的小试管，分别加入 0.2mL 无菌水，再往一管中加入 2~3 接 种环的腊样芽孢杆菌的菌苔，另一管中加入 2~3 接种环的生孢梭菌的菌苔，两管 中各自充分混合成浓厚的菌悬液。 （2）在菌悬液中分别加入 0.2mL 苯酚品红溶液，充分混合后，于沸水浴中加热 3~5min。 （3）用接种环分别取上述混合液 2~3 环于两载玻片上，涂薄，风干后，将载 玻片稍倾斜于烧杯上，用 95％乙醇冲洗至无红色液流出。 （4）再用自来水冲洗，滤纸吸干。 （5）取 1~2 接种环黑色素溶液于涂片处，立即展开涂薄，自然风干后，油镜 观察，在淡紫色背景的衬托下，菌体为白色，菌体内的芽孢为红色。 （二）荚膜染色技术 1. 湿墨水法 （1）制备菌和墨水混合液 加一滴水于洁净的载玻片上，然后挑取少量菌体与其 混合均匀。 （2）加盖玻片 将一洁净的盖玻片盖在混合液上，然后在盖玻片上放一张滤 纸，轻轻按压以吸去多余的混合液。 （3）镜检 用低倍镜和高倍镜观察，若用相差显微镜观察，效果更好。 背景灰色，菌体较暗，在菌体周围呈现明亮的透明圈即为荚膜。 2. 干墨水法 （1）在载玻片一端滴一滴 6％葡萄糖水溶液，取少许培养了 72h 的圆褐固氮 菌在水滴中制成菌悬液，充分混匀。 （2）取一滴新配好的黑色素溶液（也可用绘图墨水）与菌悬液混合，另取一 块载玻片作为推片，将推片一端平整的边缘与菌悬液以 30°角接触后，顺势将菌 悬液推向前方，使其成匀薄的一层，风干。 （3）用纯甲醇固定 1min。 （4）加番红液数滴于涂片上，冲去残余的甲醇，并染 30s，以细水流适当冲 洗，吸干后油镜检查，背景黑色，荚膜无色，细胞红色。 3. Anthony 法 （1）涂片 按常规取菌涂片。 （2）固定 空气中自然干燥。不可加热干燥固定。 （3）染色 用 1％结晶紫水溶液染色 2min。 （4）脱色 以 20％硫酸铜水溶液冲洗，用吸水纸吸干残液。 （5）镜检 干后用油镜观察 菌体染成深紫色，菌体周围的荚膜呈淡紫色
（1）取两支洁净的小试管，分别加入 0.2mL 无菌水，再往一管中加入 2~3 接 种环的腊样芽孢杆菌的菌苔，另一管中加入 2~3 接种环的生孢梭菌的菌苔，两管 中各自充分混合成浓厚的菌悬液。 （2）在菌悬液中分别加入 0.2mL 苯酚品红溶液，充分混合后，于沸水浴中加热 3~5min。 （3）用接种环分别取上述混合液 2~3 环于两载玻片上，涂薄，风干后，将载 玻片稍倾斜于烧杯上，用 95％乙醇冲洗至无红色液流出。 （4）再用自来水冲洗，滤纸吸干。 （5）取 1~2 接种环黑色素溶液于涂片处，立即展开涂薄，自然风干后，油镜 观察，在淡紫色背景的衬托下，菌体为白色，菌体内的芽孢为红色。 （二）荚膜染色技术 1. 湿墨水法 （1）制备菌和墨水混合液 加一滴水于洁净的载玻片上，然后挑取少量菌体与其 混合均匀。 （2）加盖玻片 将一洁净的盖玻片盖在混合液上，然后在盖玻片上放一张滤 纸，轻轻按压以吸去多余的混合液。 （3）镜检 用低倍镜和高倍镜观察，若用相差显微镜观察，效果更好。 背景灰色，菌体较暗，在菌体周围呈现明亮的透明圈即为荚膜。 2. 干墨水法 （1）在载玻片一端滴一滴 6％葡萄糖水溶液，取少许培养了 72h 的圆褐固氮 菌在水滴中制成菌悬液，充分混匀。 （2）取一滴新配好的黑色素溶液（也可用绘图墨水）与菌悬液混合，另取一 块载玻片作为推片，将推片一端平整的边缘与菌悬液以 30°角接触后，顺势将菌 悬液推向前方，使其成匀薄的一层，风干。 （3）用纯甲醇固定 1min。 （4）加番红液数滴于涂片上，冲去残余的甲醇，并染 30s，以细水流适当冲 洗，吸干后油镜检查，背景黑色，荚膜无色，细胞红色。 3. Anthony 法 （1）涂片 按常规取菌涂片。 （2）固定 空气中自然干燥。不可加热干燥固定。 （3）染色 用 1％结晶紫水溶液染色 2min。 （4）脱色 以 20％硫酸铜水溶液冲洗，用吸水纸吸干残液。 （5）镜检 干后用油镜观察 菌体染成深紫色，菌体周围的荚膜呈淡紫色
实验三 鞭毛染色法及活细菌运动性的观察 一、目的要求 1. 学习并初步掌握鞭毛染色法，观察细菌鞭毛的形态特征。 2. 学习用压滴法和悬滴法观察细菌的运动性。 二、基本原理 鞭毛是细菌的运动“器官”，细菌是否具有鞭毛，以及鞭毛着生的位置和数目是细菌的一 项这要形态特征。细菌的鞭毛很纤细，其直径通常为0.01～0.02μm，所以，除了很少数能形成鞭 毛束(由许多根鞭毛构成)的细菌可以用相差显微镜直接观察到鞭毛束的存在外，一般细菌的鞭毛 均不能用光学显微镜直接观察到，而只能用电子显微镜观察。要用普通光学显微镜观察细菌的鞭 毛，必须用鞭毛染色法。 鞭毛染色的基本原理，是在染色前先用媒染剂处理，使它沉积在鞭毛上，使鞭毛直径加粗， 然后再进行染色。鞭毛染色方法很多，本实验介绍硝酸银染色法和改良的Leifson氏染色法，前 一种方法更容易掌握，但染色剂配制后保存期较短。 在显微镜下观察细菌的运动性，也可以初步判断细菌是否有鞭毛。细菌运动性的观察可用 压滴法和悬滴法。观察时，要适当减弱光强度以增强反差，若光线太强，细菌和周围的液体难以 区分。 三、器材 苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiengsis)，假单胞菌(Pseudomonas sp.)，金黄色葡萄球菌；硝酸 银鞭毛染色液，Leifson氏染色液，0.01％美蓝水溶液；载玻片，盖玻片，凹载玻片，无菌水，凡 士林，显微镜等。 四、操作步骤 （一）鞭毛染色技术 1. 硝酸银染色法 （1）菌种的准备 要求用活跃生长期菌种作鞭毛染色和运动性的观察。对于冰箱保存的菌 种，通常要连续移种1~2次，然后可选用下列方法接种培养作染色用菌种：a.取新配制的营养琼 脂斜面(表面较湿润、基部有冷凝水)接种，28~32℃培养18~30h，让菌种扩散生长，取菌落边缘 的菌苔(不要取菌落中央的菌苔)作染色观察的菌种材料。 良好的培养物，是鞭毛染色成功的基本条件，不宜用已形成芽孢或衰亡期培养物作鞭毛染色 的菌种材料，因为老龄细菌鞭毛容易脱落。 （2）载玻片的准备 将载玻片在含适量洗衣粉的水中煮约20min，取出用清水充分洗净， 沥干后置95％乙醇中，用时取出在火焰上烧去酒精及可能残留的油迹。 玻片要求光滑、洁净，尤其忌用带油迹的玻片（将水滴在玻片上，无油迹玻片水能均匀散开） （3）菌液的制备取斜面或平板菌种培养物数环于盛有1~2mL无菌水的试管中，制成轻度 混浊的菌悬液用于制片。也可用培养物直接制片，但效果往往不如先制备菌液。 挑菌时，尽可能不带培养基
实验三 鞭毛染色法及活细菌运动性的观察 一、目的要求 1. 学习并初步掌握鞭毛染色法，观察细菌鞭毛的形态特征。 2. 学习用压滴法和悬滴法观察细菌的运动性。 二、基本原理 鞭毛是细菌的运动“器官”，细菌是否具有鞭毛，以及鞭毛着生的位置和数目是细菌的一 项这要形态特征。细菌的鞭毛很纤细，其直径通常为0.01～0.02μm，所以，除了很少数能形成鞭 毛束(由许多根鞭毛构成)的细菌可以用相差显微镜直接观察到鞭毛束的存在外，一般细菌的鞭毛 均不能用光学显微镜直接观察到，而只能用电子显微镜观察。要用普通光学显微镜观察细菌的鞭 毛，必须用鞭毛染色法。 鞭毛染色的基本原理，是在染色前先用媒染剂处理，使它沉积在鞭毛上，使鞭毛直径加粗， 然后再进行染色。鞭毛染色方法很多，本实验介绍硝酸银染色法和改良的Leifson氏染色法，前 一种方法更容易掌握，但染色剂配制后保存期较短。 在显微镜下观察细菌的运动性，也可以初步判断细菌是否有鞭毛。细菌运动性的观察可用 压滴法和悬滴法。观察时，要适当减弱光强度以增强反差，若光线太强，细菌和周围的液体难以 区分。 三、器材 苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiengsis)，假单胞菌(Pseudomonas sp.)，金黄色葡萄球菌；硝酸 银鞭毛染色液，Leifson氏染色液，0.01％美蓝水溶液；载玻片，盖玻片，凹载玻片，无菌水，凡 士林，显微镜等。 四、操作步骤 （一）鞭毛染色技术 1. 硝酸银染色法 （1）菌种的准备 要求用活跃生长期菌种作鞭毛染色和运动性的观察。对于冰箱保存的菌 种，通常要连续移种1~2次，然后可选用下列方法接种培养作染色用菌种：a.取新配制的营养琼 脂斜面(表面较湿润、基部有冷凝水)接种，28~32℃培养18~30h，让菌种扩散生长，取菌落边缘 的菌苔(不要取菌落中央的菌苔)作染色观察的菌种材料。 良好的培养物，是鞭毛染色成功的基本条件，不宜用已形成芽孢或衰亡期培养物作鞭毛染色 的菌种材料，因为老龄细菌鞭毛容易脱落。 （2）载玻片的准备 将载玻片在含适量洗衣粉的水中煮约20min，取出用清水充分洗净， 沥干后置95％乙醇中，用时取出在火焰上烧去酒精及可能残留的油迹。 玻片要求光滑、洁净，尤其忌用带油迹的玻片（将水滴在玻片上，无油迹玻片水能均匀散开） （3）菌液的制备取斜面或平板菌种培养物数环于盛有1~2mL无菌水的试管中，制成轻度 混浊的菌悬液用于制片。也可用培养物直接制片，但效果往往不如先制备菌液。 挑菌时，尽可能不带培养基
（4）制片 取一滴菌液于载玻片上的一端，然后将玻片倾斜，使菌液缓缓流向另一端，用 吸水纸吸去玻片下端多余菌液，室温（或37℃）自然干燥。 干后应尽快染色，不宜放置时间过长。 （5）染色 涂片干燥后，滴加硝酸银染色A液覆盖3-5min，用蒸馏水充分洗去A液。用B 液冲去残水后，再加B液覆盖涂片染色约数秒至1min，当涂面出现明显褐色时，立即用蒸馏水 冲洗。若加B液后显色较慢，可用微火加热，直至显褐色时立即水洗。自然干燥。 配制合格的染色剂（尤其是B液）、充分洗去A液再加B液、掌握好B液的染色时间均是 鞭毛染色成败的重要环节。 （6）镜检 干后用油镜观察。观察时，可从玻片的一端逐渐移至另一端，有时只在涂片的 一定部位观察到鞭毛。 菌体呈深褐色，鞭毛显褐色、通常呈波浪形。 2. 改良的Leifson氏染色法 （1）载玻片的准备、菌种材料的准备用硝酸银染色法。 （2）制片 用记号笔在载玻片反面将玻片分成3-4个等分区，在每一小区的一端放一小滴菌 液。将玻片倾斜，让菌液流到小区的另一端，用滤纸吸去多余的菌液。室温或37℃自然干燥。 （3）染色 加Leifson氏染色液覆盖第一区的涂面，隔数min后，加染液于第二涂面，如此 继续染第三、四区。间隔时间自行议定，其目的是为了确定最佳染色时间。在染色过程中仔细观 察，当整个玻片都出现铁锈色沉淀、染料表面现出金色膜时，即直接用水轻轻冲洗（不要先倾去 染料再冲洗，否则背景不清）。染色时间大约10min。自然干燥。 （4）镜检干后用油镜观察。 菌体和鞭毛均呈红色。 （二）运动性观察 玻片的准备、菌种材料的准备同鞭毛染色法。 1. 压滴法 （1）制片在洁净载玻片上加一滴无菌水，挑取一环菌液与水混合，再加一环0.01％的美蓝 水溶液与其混合均匀。用镊子取一洁净的盖玻片，使其一边与菌液边缘接触，然后将盖玻片慢慢 放下盖在菌液上。观察专性好氧菌时，可在放盖玻片时压入小气泡，以防止细菌因缺氧而停止运 动。 （2）镜检 先用低倍镜找到标本，再用高倍镜观察。也可用油镜观察，用油镜时，盖玻片厚 度不能超过0.17nm。观察时，要用略暗光线。 有鞭毛细菌可作直线、波浪式或翻滚运动，两个细菌之间出现明显的位移而与布朗运动或随 水流运动区别。 2. 悬滴法 （1）涂凡士林取洁净凹载玻片，在其四周涂少许凡士林。 （2）加菌液 在盖玻片中央滴一小滴菌液。为便于观察时寻找菌液位置，可用记号笔在菌 液周围画上记号。菌液不能加得太多，为了便于观察，也可用接种环挑取一环菌液于盖玻片中央。 （3）盖凹玻片 将凹玻片得凹槽对准盖玻片中心得菌液，并轻轻盖在盖玻片上。轻轻按压 使盖玻片与凹玻片粘合在一起，把液滴封闭在小室中。翻转凹玻片，使菌液滴悬在盖玻片下并位 于凹槽中央。 若菌液加得过多，此时菌液就会流到凹玻片上面影响观察。 （4）镜检 先用低倍镜找到标本，并将液滴移至视野中央，然后用高倍镜观察。若用油镜 观察，盖玻片厚度不能超过0.17nm，并要十分细心，以免压碎盖玻片、损伤镜头。 观察过程要在略暗的光线下进行。 实验四 酵母菌的形态观察及死、活细胞的鉴别
（4）制片 取一滴菌液于载玻片上的一端，然后将玻片倾斜，使菌液缓缓流向另一端，用 吸水纸吸去玻片下端多余菌液，室温（或37℃）自然干燥。 干后应尽快染色，不宜放置时间过长。 （5）染色 涂片干燥后，滴加硝酸银染色A液覆盖3-5min，用蒸馏水充分洗去A液。用B 液冲去残水后，再加B液覆盖涂片染色约数秒至1min，当涂面出现明显褐色时，立即用蒸馏水 冲洗。若加B液后显色较慢，可用微火加热，直至显褐色时立即水洗。自然干燥。 配制合格的染色剂（尤其是B液）、充分洗去A液再加B液、掌握好B液的染色时间均是 鞭毛染色成败的重要环节。 （6）镜检 干后用油镜观察。观察时，可从玻片的一端逐渐移至另一端，有时只在涂片的 一定部位观察到鞭毛。 菌体呈深褐色，鞭毛显褐色、通常呈波浪形。 2. 改良的Leifson氏染色法 （1）载玻片的准备、菌种材料的准备用硝酸银染色法。 （2）制片 用记号笔在载玻片反面将玻片分成3-4个等分区，在每一小区的一端放一小滴菌 液。将玻片倾斜，让菌液流到小区的另一端，用滤纸吸去多余的菌液。室温或37℃自然干燥。 （3）染色 加Leifson氏染色液覆盖第一区的涂面，隔数min后，加染液于第二涂面，如此 继续染第三、四区。间隔时间自行议定，其目的是为了确定最佳染色时间。在染色过程中仔细观 察，当整个玻片都出现铁锈色沉淀、染料表面现出金色膜时，即直接用水轻轻冲洗（不要先倾去 染料再冲洗，否则背景不清）。染色时间大约10min。自然干燥。 （4）镜检干后用油镜观察。 菌体和鞭毛均呈红色。 （二）运动性观察 玻片的准备、菌种材料的准备同鞭毛染色法。 1. 压滴法 （1）制片在洁净载玻片上加一滴无菌水，挑取一环菌液与水混合，再加一环0.01％的美蓝 水溶液与其混合均匀。用镊子取一洁净的盖玻片，使其一边与菌液边缘接触，然后将盖玻片慢慢 放下盖在菌液上。观察专性好氧菌时，可在放盖玻片时压入小气泡，以防止细菌因缺氧而停止运 动。 （2）镜检 先用低倍镜找到标本，再用高倍镜观察。也可用油镜观察，用油镜时，盖玻片厚 度不能超过0.17nm。观察时，要用略暗光线。 有鞭毛细菌可作直线、波浪式或翻滚运动，两个细菌之间出现明显的位移而与布朗运动或随 水流运动区别。 2. 悬滴法 （1）涂凡士林取洁净凹载玻片，在其四周涂少许凡士林。 （2）加菌液 在盖玻片中央滴一小滴菌液。为便于观察时寻找菌液位置，可用记号笔在菌 液周围画上记号。菌液不能加得太多，为了便于观察，也可用接种环挑取一环菌液于盖玻片中央。 （3）盖凹玻片 将凹玻片得凹槽对准盖玻片中心得菌液，并轻轻盖在盖玻片上。轻轻按压 使盖玻片与凹玻片粘合在一起，把液滴封闭在小室中。翻转凹玻片，使菌液滴悬在盖玻片下并位 于凹槽中央。 若菌液加得过多，此时菌液就会流到凹玻片上面影响观察。 （4）镜检 先用低倍镜找到标本，并将液滴移至视野中央，然后用高倍镜观察。若用油镜 观察，盖玻片厚度不能超过0.17nm，并要十分细心，以免压碎盖玻片、损伤镜头。 观察过程要在略暗的光线下进行。 实验四 酵母菌的形态观察及死、活细胞的鉴别
一、 实验要求 1. 观察酵母菌的形态及出芽生殖方式，学习区分酵母菌死、活细胞的染色方法。 2. 掌握酵母菌的一般形态特征及其与细菌的区别。 二、基本原理 酵母菌是多形的、不运动的单细胞微生物，细胞核与细胞质已有明显的分化， 其大小通常比常见细菌大几倍甚至几十倍。繁殖方式也比较复杂，无性繁殖主要 是出芽生殖，仅裂殖酵母属是以分裂方式繁殖；有性繁殖是通过接合产生子囊孢 子。本实验通过用美蓝染色制成水浸片和水－碘水浸片来观察生活的酵母形态和 出芽生殖方式。 美蓝是一种无毒性染料，它的氧化型是蓝色的，而还原型是无色的，用它来 对酵母的活细胞进行染色，由于细胞中新陈代谢的作用，使细胞内具有较强的还 原能力，能使美蓝从蓝色的氧化型变为无色的还原型，所以酵母的活细胞无色， 而对于死细胞或代谢缓慢的老细胞，则因它们无此还原能力或还原能力极弱， 而被美蓝染成蓝色或淡蓝色。因此，用美蓝水浸片不仅可以观察酵母的形态，还 可以区分死、活细胞。但美蓝的浓度、作用时间等均有影响，应加注意。 三、器材 酿酒酵母(Saccharomyces cervisiae)或卡尔酵母（S. calsbergensis）；0.05%， 0.1%吕氏碱性美蓝染液，革兰氏染色用的碘液；显微镜，载玻片，盖玻片等。 四、操作步骤 1. 美蓝浸片观察 （1）在载玻片中央滴加 1 滴 0.1％吕氏碱性美蓝染液，液滴不可过多或过少， 以免盖上盖玻片时，溢出或留有气泡。然后按无菌操作法取在豆芽汁琼脂斜面上 培养 48h 的酿酒酵母少许，放在吕氏碱性美蓝染液中，使菌体与染液均匀混合。 （2）用镊子夹盖玻片一块，小心地盖在液滴上。盖片时应注意，不能将盖玻片平 放上去，应先将盖玻片地一边与液滴接触，然后将整个盖玻片慢慢放下，这样可以 避免产生气泡。 （3）将制好地水浸片放置 3min 后镜检。先用低倍镜观察，然后换用高倍镜观 察酿酒酵母的形态和出芽情况，同时可以根据是否染上颜色来区别死、活细胞。 （4）染色 0.5h 后，再观察一下死细胞数目是否增加。 （5）用 0.05％吕氏碱性美蓝染液重复上述的操作。 2. 水－碘浸片观察 在载玻片中央滴一滴革兰氏染色用的碘液，然后再在其上加三滴水，取酿酒 酵母少许，放在水－碘液滴中，使菌体与溶液混匀，盖上盖玻片后镜检。 实验五 细菌、放线菌、酵母及其它真菌菌落的比较及微观形态 观察 一、目的要求
一、 实验要求 1. 观察酵母菌的形态及出芽生殖方式，学习区分酵母菌死、活细胞的染色方法。 2. 掌握酵母菌的一般形态特征及其与细菌的区别。 二、基本原理 酵母菌是多形的、不运动的单细胞微生物，细胞核与细胞质已有明显的分化， 其大小通常比常见细菌大几倍甚至几十倍。繁殖方式也比较复杂，无性繁殖主要 是出芽生殖，仅裂殖酵母属是以分裂方式繁殖；有性繁殖是通过接合产生子囊孢 子。本实验通过用美蓝染色制成水浸片和水－碘水浸片来观察生活的酵母形态和 出芽生殖方式。 美蓝是一种无毒性染料，它的氧化型是蓝色的，而还原型是无色的，用它来 对酵母的活细胞进行染色，由于细胞中新陈代谢的作用，使细胞内具有较强的还 原能力，能使美蓝从蓝色的氧化型变为无色的还原型，所以酵母的活细胞无色， 而对于死细胞或代谢缓慢的老细胞，则因它们无此还原能力或还原能力极弱， 而被美蓝染成蓝色或淡蓝色。因此，用美蓝水浸片不仅可以观察酵母的形态，还 可以区分死、活细胞。但美蓝的浓度、作用时间等均有影响，应加注意。 三、器材 酿酒酵母(Saccharomyces cervisiae)或卡尔酵母（S. calsbergensis）；0.05%， 0.1%吕氏碱性美蓝染液，革兰氏染色用的碘液；显微镜，载玻片，盖玻片等。 四、操作步骤 1. 美蓝浸片观察 （1）在载玻片中央滴加 1 滴 0.1％吕氏碱性美蓝染液，液滴不可过多或过少， 以免盖上盖玻片时，溢出或留有气泡。然后按无菌操作法取在豆芽汁琼脂斜面上 培养 48h 的酿酒酵母少许，放在吕氏碱性美蓝染液中，使菌体与染液均匀混合。 （2）用镊子夹盖玻片一块，小心地盖在液滴上。盖片时应注意，不能将盖玻片平 放上去，应先将盖玻片地一边与液滴接触，然后将整个盖玻片慢慢放下，这样可以 避免产生气泡。 （3）将制好地水浸片放置 3min 后镜检。先用低倍镜观察，然后换用高倍镜观 察酿酒酵母的形态和出芽情况，同时可以根据是否染上颜色来区别死、活细胞。 （4）染色 0.5h 后，再观察一下死细胞数目是否增加。 （5）用 0.05％吕氏碱性美蓝染液重复上述的操作。 2. 水－碘浸片观察 在载玻片中央滴一滴革兰氏染色用的碘液，然后再在其上加三滴水，取酿酒 酵母少许，放在水－碘液滴中，使菌体与溶液混匀，盖上盖玻片后镜检。 实验五 细菌、放线菌、酵母及其它真菌菌落的比较及微观形态 观察 一、目的要求
1. 观察细菌、放线菌、酵母、青霉和平菇菌丝等代表种类的菌落形态特征。 2. 观察细菌、放线菌、酵母、青霉和平菇菌丝等代表种类的菌体的微观特征。 3. 学习描述菌落特征的方法。 二、基本原理 菌落形态是指某种微生物在一定的培养基上由单个菌体形成的群体形态。细菌、 放线菌、酵母、霉菌和食用菌，每一种微生物在一定的培养条件下形成的菌落各具有 某些相对的特征，利用观察这些特征，来区分各大类微生物及初步识别、鉴定微生物， 方法简便快速，在科研和生产中常被应用。 微观特征是鉴定微生物种类的主要依据，通过显微观察可以了解四大类微生物的主 要特征。 三、器材 圆褐固氮菌或大肠杆菌，枯草芽胞杆菌，灰色链霉菌，酿酒酵母，青霉或其 它霉菌，平菇或其它食用菌菌丝体。 载玻片，盖玻片，无菌水滴瓶，酒精灯，接种环、接种钩、显微镜等。 四、操作步骤 1. 菌落形态观察 观察比较圆褐固氮菌或大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、灰色链霉菌、酿酒酵母、 青霉或其它霉菌、平菇或其它食用菌菌丝体在平板培养基上形成的菌落特征，按 照下列菌落描述的方法记录结果。 （1）大小：大、中、小。或用十字交叉法测量菌落直径。 （2）形态：圆形、不规则形。 （3）干湿：干燥、湿润、粘稠。 （4）高度：扁平、隆起、凹下。 （5）透明度：透明、半透明、不透明。 （6）颜色：白色、乳白色、黄色、金黄色、绿色、红色、褐色等。中间与边缘有无 区别。 （7）边缘：整齐、不整齐。 2. 菌落微观形态观察 （1）取细菌固定玻片，用油镜观察细菌的形态。 （2）取放线菌固定玻片，用低倍镜和高倍镜观察放线菌的形态。 （3）取酵母菌固定玻片，用低倍镜和高倍镜观察放线菌的形态。 （4）取青霉或黑曲霉固定玻片，用低倍镜和高倍镜观察其菌丝和分生孢子梗的 形态。 （5）挑取少量平菇或其它食用菌的菌丝体，用低倍镜和高倍镜观察其形态， 观察有无锁状联合。 边观察，边用铅笔绘图。左眼观察视野，右眼观察图纸。 实验六 细菌和放线菌培养基的制备 培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，用 以培养、分离、鉴定、保存各种微生物或积累代谢产物。在自然界中，微生物种 类繁多，营养类型多样，加之实验和研究目的不同，所以培养基种类很多。培养
1. 观察细菌、放线菌、酵母、青霉和平菇菌丝等代表种类的菌落形态特征。 2. 观察细菌、放线菌、酵母、青霉和平菇菌丝等代表种类的菌体的微观特征。 3. 学习描述菌落特征的方法。 二、基本原理 菌落形态是指某种微生物在一定的培养基上由单个菌体形成的群体形态。细菌、 放线菌、酵母、霉菌和食用菌，每一种微生物在一定的培养条件下形成的菌落各具有 某些相对的特征，利用观察这些特征，来区分各大类微生物及初步识别、鉴定微生物， 方法简便快速，在科研和生产中常被应用。 微观特征是鉴定微生物种类的主要依据，通过显微观察可以了解四大类微生物的主 要特征。 三、器材 圆褐固氮菌或大肠杆菌，枯草芽胞杆菌，灰色链霉菌，酿酒酵母，青霉或其 它霉菌，平菇或其它食用菌菌丝体。 载玻片，盖玻片，无菌水滴瓶，酒精灯，接种环、接种钩、显微镜等。 四、操作步骤 1. 菌落形态观察 观察比较圆褐固氮菌或大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、灰色链霉菌、酿酒酵母、 青霉或其它霉菌、平菇或其它食用菌菌丝体在平板培养基上形成的菌落特征，按 照下列菌落描述的方法记录结果。 （1）大小：大、中、小。或用十字交叉法测量菌落直径。 （2）形态：圆形、不规则形。 （3）干湿：干燥、湿润、粘稠。 （4）高度：扁平、隆起、凹下。 （5）透明度：透明、半透明、不透明。 （6）颜色：白色、乳白色、黄色、金黄色、绿色、红色、褐色等。中间与边缘有无 区别。 （7）边缘：整齐、不整齐。 2. 菌落微观形态观察 （1）取细菌固定玻片，用油镜观察细菌的形态。 （2）取放线菌固定玻片，用低倍镜和高倍镜观察放线菌的形态。 （3）取酵母菌固定玻片，用低倍镜和高倍镜观察放线菌的形态。 （4）取青霉或黑曲霉固定玻片，用低倍镜和高倍镜观察其菌丝和分生孢子梗的 形态。 （5）挑取少量平菇或其它食用菌的菌丝体，用低倍镜和高倍镜观察其形态， 观察有无锁状联合。 边观察，边用铅笔绘图。左眼观察视野，右眼观察图纸。 实验六 细菌和放线菌培养基的制备 培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，用 以培养、分离、鉴定、保存各种微生物或积累代谢产物。在自然界中，微生物种 类繁多，营养类型多样，加之实验和研究目的不同，所以培养基种类很多。培养
基可以为微生物生长、繁殖提供充足的水分、碳源、氮源、能源、无机盐和生长 因子等，不同微生物对 pH 要求不同，酵母和霉菌一般的培养基一般是偏酸性的， 而细菌和放线菌的培养基一般是偏碱性的，所以配制培养基时需要调整 pH 值。 根据培养基的成分不同，培养基可以分为天然培养基、合成培养基和半合成 培养基；根据培养基的物理状态可以分为固体培养基、半固体培养基和液体培养 基；根据培养基的用途可以分为基础培养基、加富培养基、鉴别培养基和选择培 养基。本实验主要学习制备培养细菌和放线菌的 2 种培养基。 一、牛肉膏蛋白胨培养基（培养细菌用） （一）目的要求 1. 明确培养基的配制原理。 2. 掌握配制培养基的一般方法和步骤。 （二）基本原理 牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普遍的细菌基础培养基，由于 这种培养基中含有一般细菌生长繁殖所需要的最基本的营养物质，培养基中的牛 肉膏主要为微生物生长提供碳源、能源、磷酸盐和维生素，蛋白胨主要提供氮源 和维生素，而 NaCl 提供无机盐，琼脂作凝固剂。琼脂在常用浓度下（1.5%~2%） 下 96℃时溶化，在 45℃时凝固，通常不被微生物分解利用。 由于这种培养基多用于培养细菌，因此要用稀酸或稀碱将其 pH 调至中性或 微碱性，以利于细菌的生长繁殖。 牛肉膏蛋白胨培养基的配方如下： 牛肉膏 3.0g 蛋白胨 10.0g NaCl 5.0g 琼脂 20g 水 1000mL pH 7.4～7.6 （三）器材 1、溶液或试剂：牛肉膏，蛋白胨，NaCl，琼脂，1mol/LNaOH，1mol/LHCl。 2、仪器或其它用具：试管，三角瓶，烧杯，量筒，玻棒，培养基分装装置， 天平，药匙，高压蒸汽灭菌锅，pH 试纸（pH5.5～9.0），棉花，报纸或牛皮纸， 记号笔，线绳或尼龙绳，纱布等。 （四）操作步骤 1. 称量 按照培养基配方比例依次称取牛肉膏、蛋白胨、NaCl 放入烧杯中。 注意牛肉膏常用玻棒挑取，放在小烧杯或培养皿中称量，用热水溶化后倒入烧杯； 蛋白胨易吸潮，在称取时动作要迅速；严防药品混杂，一把药匙用于一种药品， 或称取一种药品后，洗净插干，再称取另一种药品。瓶盖也不要盖错。 2. 溶化 在上述烧杯中先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然好在石棉 网上加热使其溶解，或在磁力搅拌器上加热溶解。将药品完全溶解后，补充水到 所需总体积，将称好的琼脂加入后，再加热溶化。加热时要用玻棒不断搅拌，防 止糊锅或溢出。最后补足所损失的水分。如果是制备三角瓶盛固体培养基时，可 以先将一定量的液体培养基装入三角瓶，再按比例加入琼脂，不必加热溶化，而 是加热和溶化同步进行，节省时间
基可以为微生物生长、繁殖提供充足的水分、碳源、氮源、能源、无机盐和生长 因子等，不同微生物对 pH 要求不同，酵母和霉菌一般的培养基一般是偏酸性的， 而细菌和放线菌的培养基一般是偏碱性的，所以配制培养基时需要调整 pH 值。 根据培养基的成分不同，培养基可以分为天然培养基、合成培养基和半合成 培养基；根据培养基的物理状态可以分为固体培养基、半固体培养基和液体培养 基；根据培养基的用途可以分为基础培养基、加富培养基、鉴别培养基和选择培 养基。本实验主要学习制备培养细菌和放线菌的 2 种培养基。 一、牛肉膏蛋白胨培养基（培养细菌用） （一）目的要求 1. 明确培养基的配制原理。 2. 掌握配制培养基的一般方法和步骤。 （二）基本原理 牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普遍的细菌基础培养基，由于 这种培养基中含有一般细菌生长繁殖所需要的最基本的营养物质，培养基中的牛 肉膏主要为微生物生长提供碳源、能源、磷酸盐和维生素，蛋白胨主要提供氮源 和维生素，而 NaCl 提供无机盐，琼脂作凝固剂。琼脂在常用浓度下（1.5%~2%） 下 96℃时溶化，在 45℃时凝固，通常不被微生物分解利用。 由于这种培养基多用于培养细菌，因此要用稀酸或稀碱将其 pH 调至中性或 微碱性，以利于细菌的生长繁殖。 牛肉膏蛋白胨培养基的配方如下： 牛肉膏 3.0g 蛋白胨 10.0g NaCl 5.0g 琼脂 20g 水 1000mL pH 7.4～7.6 （三）器材 1、溶液或试剂：牛肉膏，蛋白胨，NaCl，琼脂，1mol/LNaOH，1mol/LHCl。 2、仪器或其它用具：试管，三角瓶，烧杯，量筒，玻棒，培养基分装装置， 天平，药匙，高压蒸汽灭菌锅，pH 试纸（pH5.5～9.0），棉花，报纸或牛皮纸， 记号笔，线绳或尼龙绳，纱布等。 （四）操作步骤 1. 称量 按照培养基配方比例依次称取牛肉膏、蛋白胨、NaCl 放入烧杯中。 注意牛肉膏常用玻棒挑取，放在小烧杯或培养皿中称量，用热水溶化后倒入烧杯； 蛋白胨易吸潮，在称取时动作要迅速；严防药品混杂，一把药匙用于一种药品， 或称取一种药品后，洗净插干，再称取另一种药品。瓶盖也不要盖错。 2. 溶化 在上述烧杯中先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然好在石棉 网上加热使其溶解，或在磁力搅拌器上加热溶解。将药品完全溶解后，补充水到 所需总体积，将称好的琼脂加入后，再加热溶化。加热时要用玻棒不断搅拌，防 止糊锅或溢出。最后补足所损失的水分。如果是制备三角瓶盛固体培养基时，可 以先将一定量的液体培养基装入三角瓶，再按比例加入琼脂，不必加热溶化，而 是加热和溶化同步进行，节省时间
3. 调 pH 先用精密试纸测量培养基的原始 pH，如果偏酸，用滴管向培养基 中逐滴加入 1mol/LNaOH，边加边搅拌，并随时用 pH 试纸测其 pH，直至 pH 达 到 7.6。反之，用 1mol/LHCl 进行调节。 对于有些要求 pH 较精确的微生物或实验，其 pH 的调节可以用酸度计进行。 4. 过滤 趁热用 4 层纱布过滤，以利某些实验结果的观察。一般没有特殊要 求的情况下，这一步可以省去（本实验不需过滤）。 5. 分装 按实验要求，可将配制的培养基装入三角瓶或试管内。分装试管时， 分装量为试管总长的 1/5～1/4，灭菌后制成斜面。分装三角瓶的量以不超过三角 瓶容积的一半为宜。注意分装速度要迅速，防止培养基凝固；不要将培养基溅到 管（瓶）口，以免沾污棉塞而引起污染。 6. 加棉塞 培养基分装完毕后，在试管口或三角瓶口塞上棉塞（或泡沫塑料 塞及试管帽等）。棉塞要求松紧适度，既能阻止外界微生物进入而引起污染，又 能够保证有良好的通气性能。 正确地棉塞要求形状、大小、 松紧与试管口（或三角瓶口）完 全适合，过紧则妨碍空气流通， 操作也不便；过松则达不到滤菌 的目的。加塞时，大头朝外，试 管内塞入 2/3，试管外留 1/3。手 提棉塞，试管不下落为不松，拔 掉棉塞时不发出较大声响为不 紧。棉塞制作过程如图 2.1 所示。 三角瓶封口可以用棉塞，也 可以用 8 层纱布重叠而成。 7. 包扎 加塞后，取 7 支同样规 格的试管，棉塞顶端用双层报纸或 1 层牛皮纸覆盖，再用线绳或尼龙绳扎好。用记号笔注明培养基名称、组别、日期 等。三角瓶加塞后直接覆盖双层报纸或 1 层牛皮纸，用同样的方法扎好。 8. 灭菌 将上述培养基在在压力 0.11MPa，温度 121℃条件下灭菌 20~30min。 如因特殊情况不能及时灭菌，则应放入冰箱内暂存。 9. 摆放斜面 灭菌结束后，应使压力自然降低至 0 时，打开锅盖，将锅盖错 开一条 10 几 cm 的缝隙，利用锅体余热将报纸和棉塞烘干，然后去掉锅盖，当 培养基温度降至 50~60℃时取出，摆放斜面。将有棉塞的一端搁在玻棒或小木条 上，斜面长度以不超过试管总长的一半为宜。 10. 无菌检查 随机抽取几把冷却凝固后的培养基，放在 37℃的温箱中培养 24~48h，以检查灭菌是否彻底。 二、高氏(Gause)1 号培养基（培养放线菌用） （一）目的要求 1. 明确培养基的配制原理。 2. 掌握配制培养基的一般方法和步骤。 （二）基本原理 高氏 1 号培养基是分离和培养放线菌的合成培养基。这种培养基是由可溶性 淀粉（作为碳源），KNO3（作为氮源）、NaCl、K2HPO4?3H2O、MgSO4?7H2O 图 2.1 棉塞的制作过程示意图
3. 调 pH 先用精密试纸测量培养基的原始 pH，如果偏酸，用滴管向培养基 中逐滴加入 1mol/LNaOH，边加边搅拌，并随时用 pH 试纸测其 pH，直至 pH 达 到 7.6。反之，用 1mol/LHCl 进行调节。 对于有些要求 pH 较精确的微生物或实验，其 pH 的调节可以用酸度计进行。 4. 过滤 趁热用 4 层纱布过滤，以利某些实验结果的观察。一般没有特殊要 求的情况下，这一步可以省去（本实验不需过滤）。 5. 分装 按实验要求，可将配制的培养基装入三角瓶或试管内。分装试管时， 分装量为试管总长的 1/5～1/4，灭菌后制成斜面。分装三角瓶的量以不超过三角 瓶容积的一半为宜。注意分装速度要迅速，防止培养基凝固；不要将培养基溅到 管（瓶）口，以免沾污棉塞而引起污染。 6. 加棉塞 培养基分装完毕后，在试管口或三角瓶口塞上棉塞（或泡沫塑料 塞及试管帽等）。棉塞要求松紧适度，既能阻止外界微生物进入而引起污染，又 能够保证有良好的通气性能。 正确地棉塞要求形状、大小、 松紧与试管口（或三角瓶口）完 全适合，过紧则妨碍空气流通， 操作也不便；过松则达不到滤菌 的目的。加塞时，大头朝外，试 管内塞入 2/3，试管外留 1/3。手 提棉塞，试管不下落为不松，拔 掉棉塞时不发出较大声响为不 紧。棉塞制作过程如图 2.1 所示。 三角瓶封口可以用棉塞，也 可以用 8 层纱布重叠而成。 7. 包扎 加塞后，取 7 支同样规 格的试管，棉塞顶端用双层报纸或 1 层牛皮纸覆盖，再用线绳或尼龙绳扎好。用记号笔注明培养基名称、组别、日期 等。三角瓶加塞后直接覆盖双层报纸或 1 层牛皮纸，用同样的方法扎好。 8. 灭菌 将上述培养基在在压力 0.11MPa，温度 121℃条件下灭菌 20~30min。 如因特殊情况不能及时灭菌，则应放入冰箱内暂存。 9. 摆放斜面 灭菌结束后，应使压力自然降低至 0 时，打开锅盖，将锅盖错 开一条 10 几 cm 的缝隙，利用锅体余热将报纸和棉塞烘干，然后去掉锅盖，当 培养基温度降至 50~60℃时取出，摆放斜面。将有棉塞的一端搁在玻棒或小木条 上，斜面长度以不超过试管总长的一半为宜。 10. 无菌检查 随机抽取几把冷却凝固后的培养基，放在 37℃的温箱中培养 24~48h，以检查灭菌是否彻底。 二、高氏(Gause)1 号培养基（培养放线菌用） （一）目的要求 1. 明确培养基的配制原理。 2. 掌握配制培养基的一般方法和步骤。 （二）基本原理 高氏 1 号培养基是分离和培养放线菌的合成培养基。这种培养基是由可溶性 淀粉（作为碳源），KNO3（作为氮源）、NaCl、K2HPO4?3H2O、MgSO4?7H2O 图 2.1 棉塞的制作过程示意图