植物组织或器官中 丙二醛含量的测定 制作人：刘新 单 位：生命科学学院 植物生理学教研室
植物组织或器官中 丙二醛含量的测定 制作人：刘新 单 位：生命科学学院 植物生理学教研室
一、实验目的 1.掌握植物体内丙二醛含量测定的原理及 方法。 2.了解丙二醛积累对细胞的伤害
一、实验目的 1.掌握植物体内丙二醛含量测定的原理及 方法。 2.了解丙二醛积累对细胞的伤害
二、实验原理： + 100 CO HN S N H O O O H H HN N HS H O O HO O H N N H S 2 O 硫代巴比妥酸 TBA 丙二醛 3,5,5´-三甲基恶唑2,4-二酮 （三甲川） 逆境 膜脂的过氧化作用 丙二醛 酸性 粉红色
二、实验原理： + 100 CO HN S N H O O O H H HN N HS H O O HO O H N N H S 2 O 硫代巴比妥酸 TBA 丙二醛 3,5,5´-三甲基恶唑2,4-二酮 （三甲川） 逆境 膜脂的过氧化作用 丙二醛 酸性 粉红色
三、实验材料： 受干旱、高温、低温等逆境胁迫的植物叶片或衰 老的植物器官（以正常条件下的作为对照）：
三、实验材料： 受干旱、高温、低温等逆境胁迫的植物叶片或衰 老的植物器官（以正常条件下的作为对照）：
实验仪器： 紫外可见分光光度计 离心机
实验仪器： 紫外可见分光光度计 离心机
四、实验步骤： ⚫ 1 MDA的提取 称2g叶片，加入5ml 磷酸缓 冲液（50mmol，pH值为7.8）及少量石英砂， 于冰浴中研磨提取，匀浆液以12000g 离心力 作用下（4度）离心10min，其上清液即为 MDA提取液。 ⚫ 2 MDA的测定 取1ml MDA提取液，加3ml 27％三氯乙酸和 1ml 2%TBA。混和液在95度 水浴中保温30min后，立即置于冰浴中冷却， 然后离心10min，于波长532nm和600nm下 测定OD值
四、实验步骤： ⚫ 1 MDA的提取 称2g叶片，加入5ml 磷酸缓 冲液（50mmol，pH值为7.8）及少量石英砂， 于冰浴中研磨提取，匀浆液以12000g 离心力 作用下（4度）离心10min，其上清液即为 MDA提取液。 ⚫ 2 MDA的测定 取1ml MDA提取液，加3ml 27％三氯乙酸和 1ml 2%TBA。混和液在95度 水浴中保温30min后，立即置于冰浴中冷却， 然后离心10min，于波长532nm和600nm下 测定OD值
五、结果计算 ⚫ 以测得的OD532减去OD600的非特异吸收值，按155mmol-1cm-1 消光系数计算MDA含量。 分别计算衰老和对照组的值。 MDA浓度(μmol/L)=6.45(D532-D600)-0.56D450 MDA含量(μmol/g FW)＝ D450、D532、D600分别代表450nm、532nm和600nm波长下的光 密度值。 植物组织鲜重（ ） 浓度（μ ） 提取液体积（ ） g MDA mol / L ml
五、结果计算 ⚫ 以测得的OD532减去OD600的非特异吸收值，按155mmol-1cm-1 消光系数计算MDA含量。 分别计算衰老和对照组的值。 MDA浓度(μmol/L)=6.45(D532-D600)-0.56D450 MDA含量(μmol/g FW)＝ D450、D532、D600分别代表450nm、532nm和600nm波长下的光 密度值。 植物组织鲜重（ ） 浓度（μ ） 提取液体积（ ） g MDA mol / L ml
六、注意事项： 1. 0.1-0.5％的三氯乙酸对MDA—TBA反应较合适，若高于 此浓度，其反应液的非专一性吸收偏高； 2. MDA-TBA显色反应的加热时间，最好控制沸水浴10- 15min之间。时间太短或太长均会引起532nm下的光吸 收值下降； 3. 如待测液浑浊，可适当增加离心力及时间，最好使用低 温离心机离心。 4. 低浓度的铁离子能增强MDA与TBA的显色反应，当植 物组织中铁离子浓度过低时应补充Fe3+（最终浓度为0.5 nmol·L-1） 5. 可溶性糖与TBA显色反应的产物在532 nm也有吸收（最 大吸收在450 nm），当植物处于干旱、高温、低温等逆 境时可溶性糖含量会增高，必要时要排除可溶性糖的干 扰
六、注意事项： 1. 0.1-0.5％的三氯乙酸对MDA—TBA反应较合适，若高于 此浓度，其反应液的非专一性吸收偏高； 2. MDA-TBA显色反应的加热时间，最好控制沸水浴10- 15min之间。时间太短或太长均会引起532nm下的光吸 收值下降； 3. 如待测液浑浊，可适当增加离心力及时间，最好使用低 温离心机离心。 4. 低浓度的铁离子能增强MDA与TBA的显色反应，当植 物组织中铁离子浓度过低时应补充Fe3+（最终浓度为0.5 nmol·L-1） 5. 可溶性糖与TBA显色反应的产物在532 nm也有吸收（最 大吸收在450 nm），当植物处于干旱、高温、低温等逆 境时可溶性糖含量会增高，必要时要排除可溶性糖的干 扰
思考题： 1. 通过丙二醛含量测定能够解决什么理论和实际问题？ 2. 说明膜脂过氧化作用的对植物的影响。 3. TBA为什么要溶解在三氯乙酸中？ 4. 为什么要测定反应液在600nm下的吸光度？ 5. 丙二醛反应液为什么加热时间过长会影响测定结果？ 6. 如果可溶性糖含量影响丙二醛含量的测定，你有什么 办法消除其影响？ 7. 正常植物与衰老时相比丙二醛含量有什么变化，分析 其原因
思考题： 1. 通过丙二醛含量测定能够解决什么理论和实际问题？ 2. 说明膜脂过氧化作用的对植物的影响。 3. TBA为什么要溶解在三氯乙酸中？ 4. 为什么要测定反应液在600nm下的吸光度？ 5. 丙二醛反应液为什么加热时间过长会影响测定结果？ 6. 如果可溶性糖含量影响丙二醛含量的测定，你有什么 办法消除其影响？ 7. 正常植物与衰老时相比丙二醛含量有什么变化，分析 其原因