叶绿体色素的提取、分离、 理化性质和定量测定 制作人：刘洪庆 单 位： 植物生理学教研室
叶绿体色素的提取、分离、 理化性质和定量测定 制作人：刘洪庆 单 位： 植物生理学教研室
一、实验目的 1. 掌握叶绿素的理化性质及其定量测定方法， 加深学生对光合色素的理性、感性认识。 2. 熟练掌握分光光度计的使用原理及其方法
一、实验目的 1. 掌握叶绿素的理化性质及其定量测定方法， 加深学生对光合色素的理性、感性认识。 2. 熟练掌握分光光度计的使用原理及其方法
二、实验原理 1. 叶绿体色素提取、分离及理化性质 ◼ 提取：叶绿体色素不易溶于水而溶于有机溶剂特性 -丙酮等有机溶剂提取。 ◼ 色素分离：纸层析法分离。 ◼ 荧光现象：观察荧光。 ◼ 取代反应： 叶绿素中镁可被H +取代而形成褐色去镁叶绿素。 去镁叶绿素遇铜则成为铜代叶绿素。 ◼ 皂化反应： 叶绿素可与碱起皂化反应而形成醇（甲醇和叶绿 醇）和叶绿酸的盐，产生的盐能溶于水-分开叶绿素 与类胡萝卜素
二、实验原理 1. 叶绿体色素提取、分离及理化性质 ◼ 提取：叶绿体色素不易溶于水而溶于有机溶剂特性 -丙酮等有机溶剂提取。 ◼ 色素分离：纸层析法分离。 ◼ 荧光现象：观察荧光。 ◼ 取代反应： 叶绿素中镁可被H +取代而形成褐色去镁叶绿素。 去镁叶绿素遇铜则成为铜代叶绿素。 ◼ 皂化反应： 叶绿素可与碱起皂化反应而形成醇（甲醇和叶绿 醇）和叶绿酸的盐，产生的盐能溶于水-分开叶绿素 与类胡萝卜素
2. 定量测定 ◼ 根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分 光光度计在某一特定波长下测定其光密度，即可用 公式计算出提取液中各色素的含量。 ◼ Ca=12.72D663 - 2.59D645 （1） ◼ Cb=22.88D645 - 4.67D663 （2） ◼ 将Ca与Cb相加即得叶绿素总量（CT）： ◼ CT=Ca+Cb=20.2D645+8.05D663（3） ◼ 或： ◼ CT=(D652×1000)/34.5 (4)
2. 定量测定 ◼ 根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分 光光度计在某一特定波长下测定其光密度，即可用 公式计算出提取液中各色素的含量。 ◼ Ca=12.72D663 - 2.59D645 （1） ◼ Cb=22.88D645 - 4.67D663 （2） ◼ 将Ca与Cb相加即得叶绿素总量（CT）： ◼ CT=Ca+Cb=20.2D645+8.05D663（3） ◼ 或： ◼ CT=(D652×1000)/34.5 (4)
三、实验材料 ◼ 新鲜的菠菜
三、实验材料 ◼ 新鲜的菠菜
四、 实验步骤 1. 提取叶绿素 研磨法提取光合色素 研磨法 材料剪碎 加入有机溶剂 研磨、匀浆 过滤 提取液
四、 实验步骤 1. 提取叶绿素 研磨法提取光合色素 研磨法 材料剪碎 加入有机溶剂 研磨、匀浆 过滤 提取液
（2）纸层析分离现象观察 （3）叶绿素荧光现象观察 （4）H+和Cu2+对叶绿素 中Mg2+的取代作用 （5）皂化反应现象观察 绿黄色素分层现象 去镁叶绿素 铜代叶绿素 荧光现象
（2）纸层析分离现象观察 （3）叶绿素荧光现象观察 （4）H+和Cu2+对叶绿素 中Mg2+的取代作用 （5）皂化反应现象观察 绿黄色素分层现象 去镁叶绿素 铜代叶绿素 荧光现象
五、定量测定 ◼ （1）定量用叶绿素提取液制备 ◼ （2）分光光度计测定 ◼ （3）实验数据及其处理 分光光度计测定
五、定量测定 ◼ （1）定量用叶绿素提取液制备 ◼ （2）分光光度计测定 ◼ （3）实验数据及其处理 分光光度计测定
六、实验结果观察及计算 ◼ （1）实验结果观察描述 ◼ （2）计算组织中叶绿体色素含量 ◼ （用mg/g鲜重或干重表示） 公式 叶绿素的浓度（C）提取液体积 稀释倍数 样品鲜重（或干重） 叶绿体色素含量=
六、实验结果观察及计算 ◼ （1）实验结果观察描述 ◼ （2）计算组织中叶绿体色素含量 ◼ （用mg/g鲜重或干重表示） 公式 叶绿素的浓度（C）提取液体积 稀释倍数 样品鲜重（或干重） 叶绿体色素含量=
七、思考题 ◼ （1）叶绿素a、b在蓝光区也有吸收峰，能否 用这一吸收峰波长进行叶绿素a、b的定量分析？ 为什么？ ◼ （2）用不含水的有机溶剂如无水乙醇、无水 丙酮等提取植物材料，特别是干材料的叶绿体 色素往往效果不佳，原因何在？ ◼ （3）研磨提取叶绿素时加入CaCO3 . 石英砂 各有什么作用？
七、思考题 ◼ （1）叶绿素a、b在蓝光区也有吸收峰，能否 用这一吸收峰波长进行叶绿素a、b的定量分析？ 为什么？ ◼ （2）用不含水的有机溶剂如无水乙醇、无水 丙酮等提取植物材料，特别是干材料的叶绿体 色素往往效果不佳，原因何在？ ◼ （3）研磨提取叶绿素时加入CaCO3 . 石英砂 各有什么作用？