实验一回收试验 、方法原理： 回收即分析方法正确测定加入常规分析样品中的纯分析物的能力 用于测定方法的比例系统误差。这种误差常随分析物浓度的增加而增加，常因样品中其他物质与分 析物质竞争分析试剂并与之发生反应而引起。 将纯品标准液加入病人样品中，成为分析样品，原病人样品加入相同量的无分析物的溶液作基础样 品，然后用实验方法分析， 设各仪器与用品 总蛋白试剂、70gL白蛋白标准液、半自动生化分析仪、试管、试管架、微量移液器、刻度吸管、吸 操作 (1)样品制备： ①基础血清：血清0.9ml+蒸馏水100ul ②回收样品 回收样 血清0.9ml+总蛋白标准液100u1 回收样品11：血清0.9ml+,总蛋白标准液50μ1+蒸馏水50μ1 (2)测定：按以下方法测定各制备血清中的总蛋白浓度 取试管5支，做好标记，按下表操作 测定营 加入物 空白管 标准管 基础血清 回收样品 回牧样品 待测样品() 25 四收样品山 25 25 蒸馏水() 35 B06试剂(m) 2 2 2 37℃10分钟，于半自动生化分析仪上检测(546m 1.检测血清总蛋白 2.加入浓度计算： 3.算回收量：回收量=回收样品测得值-一基础样品测得值 4.算回收率：回收率(%)=回收量/加入浓度×100% 5.回收试验的数据处理 样品 测得浓度加入浓度 回收浓度 回收率 (g/L) (g/L) (9/L) (%) 基础样品 回你 回收样已1 平均回收率 讨论：一股检验方法要求回收率在95-105%之间，若超过此范围，则说明该分析方法的比例系统误 差较大。 四、注意事项
实验一 回收试验 一、方法原理： 回收即分析方法正确测定加入常规分析样品中的纯分析物的能力。 用于测定方法的比例系统误差。这种误差常随分析物浓度的增加而增加，常因样品中其他物质与分 析物质竞争分析试剂并与之发生反应而引起。 将纯品标准液加入病人样品中，成为分析样品，原病人样品加入相同量的无分析物的溶液作基础样 品，然后用实验方法分析。 二、步骤： 1．设备仪器与用品 总蛋白试剂、70g/L白蛋白标准液、半自动生化分析仪、试管、试管架、微量移液器、刻度吸管、吸 耳球 2．操作 （1）样品制备： ①基础血清：血清0.9ml+蒸馏水100μl ②回收样品： 回收样品I： 血清0.9ml+总蛋白标准液100μl 回收样品II： 血清0.9ml+总蛋白标准液50μl+蒸馏水50μl （2）测定：按以下方法测定各制备血清中的总蛋白浓度 取试管5支，做好标记，按下表操作； 加入物 空白管 标准管 测 定 管 基础血清 回收样品I 回收样品II 待测样品（μl） 基础血清 回收样品I 回收样品II 25 25 25 白蛋白标准液 （μl） 25 蒸馏水（μl） 25 BCG试剂（ml） 2 2 2 2 2 37℃10分钟，于半自动生化分析仪上检测（546nm） 1．检测血清总蛋白 2．加入浓度计算： 3．算回收量：回收量=回收样品测得值--基础样品测得值 4．算回收率：回收率（%）=回收量/加入浓度×100% 5．回收试验的数据处理 样品 测得浓度 （g/L） 加入浓度 （g/L） 回收浓度 （g/L） 回收率 （%） 基础样品 回收样品I 回收样品II 平均回收率 讨论：一般检验方法要求回收率在95%-105%之间，若超过此范围，则说明该分析方法的比例系统误 差较大。 四、注意事项
1、准确加样是最主要的关健技术。 2、纯标准品溶液的加入体积不得超过血清样品的10%，避免将血液稀释过度，引起误差的改变或消 失。 实验二蛋白质检验 一原理： 血清中各种蛋白质的等电点大都低于7.0，在pH8.6的缓冲液中，他们都电离成负离子，在电场 中向正极移动。因各种蛋白质等电点不同，在同一pH下带电荷量有差异，同时各蛋白质的分子大小 与分子形状也不相同，因此在同一电场中泳动速度也不同。带电荷多，分子量小者，泳动较快；反 之由较慢 CAM电泳可将血清蛋白分离为5条区带，从正极端起依次为白蛋白、 α1-球蛋白、2球蛋白、阝球蛋白、Y-球蛋白。由于染色时染料与蛋白质的结合与蛋白质的量成正 比，因此将各蛋白区带剪下，经脱色、比色或经透明驳处理后直接用光密度计扫描，即可计算出血清 蛋白组分的相对百分数。如同时测定出血清总蛋白浓度，带可计算出各蛋白组分的绝对浓度。 二操作步骤 1.准备： ()电泳槽的准备：将电泳槽置于水平平台上，两侧注入等量的巴比妥缓冲液，使其在同一水平 面，液面与支架距离约2-2.5cm,支架宽度调节在5.5-6cm,用三层滤纸或双层纱布搭桥。 (2)CAM的准备：选择厚薄一致，透水性能好的CAM,在无光泽面一端1.5cm处用铅笔轻划一横线 作点样标记。然后将CAM无光泽面朝下，漂浮于盛有巴比妥缓冲的平皿中，使之自然浸湿下沉，待 充分浸透后（约20分钟）用镊子取出。 2.点样 (1)将薄膜条置于洁净滤纸中间，无光泽面朝上，用滤纸轻按吸去CAM上多余的缓冲液。 品空铁高票，均与涂布于点群用香片上，重直c无光男面处待 3.电泳 (1)将加样后的薄膜平直架于支架两端，无光泽面朝下，点样侧置于阴极端，用滤纸或纱布将膜的 两端与缓冲液连通，平衡5分钟。 (2)将电泳槽的正极和负极分别与电泳仪的正极和负极联结，打开电源，调电压为8-15Vcm膜长或 电流0.3-0.5mA/cm膜宽。通电50分钟左右，待电泳区带展开约3.5-4.0cm,即可关闭电源。 4.染色 用镊子取出薄膜条直接投入氨基黑10B染色液中染色5-10分钟。染色过程中不时轻轻晃动染色皿，使 染色充分。薄膜条较多时，应避免彼此紧贴致染色不良
1、准确加样是最主要的关键技术。 2、纯标准品溶液的加入体积不得超过血清样品的10%，避免将血液稀释过度，引起误差的改变或消 失。 实验二 蛋白质检验 一 原理： 血清中各种蛋白质的等电点大都低于7.0，在pH8.6的缓冲液中，他们都电离成负离子，在电场 中向正极移动。因各种蛋白质等电点不同，在同一pH下带电荷量有差异，同时各蛋白质的分子大小 与分子形状也不相同，因此在同一电场中泳动速度也不同。带电荷多，分子量小者，泳动较快；反 之由较慢。 CAM电泳可将血清蛋白分离为5条区带，从正极端起依次为白蛋白、 α1 -球蛋白、α2 -球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白。由于染色时染料与蛋白质的结合与蛋白质的量成正 比，因此将各蛋白区带剪下，经脱色、比色或经透明处理后直接用光密度计扫描，即可计算出血清 蛋白组分的相对百分数。如同时测定出血清总蛋白浓度，带可计算出各蛋白组分的绝对浓度。 二 操作步骤： 1．准备： （1）电泳槽的准备：将电泳槽置于水平平台上，两侧注入等量的巴比妥缓冲液，使其在同一水平 面，液面与支架距离约2-2.5cm，支架宽度调节在5.5-6cm，用三层滤纸或双层纱布搭桥。 （2）CAM的准备：选择厚薄一致，透水性能好的CAM，在无光泽面一端1.5cm处用铅笔轻划一横线 作点样标记。然后将CAM无光泽面朝下，漂浮于盛有巴比妥缓冲的平皿中，使之自然浸湿下沉，待 充分浸透后（约20分钟）用镊子取出。 2．点样 （1）将薄膜条置于洁净滤纸中间，无光泽面朝上，用滤纸轻按吸去CAM上多余的缓冲液。 （2）用加样枪吸取待测血清3-5μL，均匀涂布于点样用薄片上，垂直印在CAM无光滑面划线处，待 血清完全渗入薄膜后移开。 3．电泳 （1）将加样后的薄膜平直架于支架两端，无光泽面朝下，点样侧置于阴极端，用滤纸或纱布将膜的 两端与缓冲液连通，平衡5分钟。 （2）将电泳槽的正极和负极分别与电泳仪的正极和负极联结，打开电源，调电压为8-15V/cm膜长或 电流0.3-0.5mA/cm膜宽。通电50分钟左右，待电泳区带展开约3.5-4.0cm，即可关闭电源。 4．染色 用镊子取出薄膜条直接投入氨基黑10B染色液中染色5-10分钟。染色过程中不时轻轻晃动染色皿，使 染色充分。薄膜条较多时，应避免彼此紧贴致染色不良
5.漂洗 准备漂洗皿，装入漂洗液，从染色液中取出薄膜条并尽量沥去染色液，直至背景无色为止。 6.定量：洗脱比色法 氨基黑10B染色法：将各蛋白区带仔细剪下，分别置于各试管中，另从空白背景剪一块平均大小的膜 条置于空白管中，在白蛋白管内加入0.4mol/LNaOH溶液6ml(计算时吸光度乘以2)，其余各管中加 入3ml,于37℃水浴20分钟，并不断摇动，待颜色脱净后，取出冷却。用620nm处比色，以空白管调 零，读取各管吸光度。 三参考范围 白蛋白：57.45-71.73% α1-球蛋白：1.76-4.48% 2-球蛋白：4.04-8.28% B-球蛋白：6.79-11.39% Y-球蛋白：11.18-22.97% 四注意事项 1.通电时，不得接触槽内缓冲液或CAM,以防触电。 2.CAM在电泳前，必须浸泡在巴比妥缓冲液中，使薄膜浸泡透彻。 3.缓冲液液面要保证一定高度，同时电泳槽两侧的液面应保持同一水平，否则通过薄膜时有虹 吸现象，会影响蛋白质分子的泳动速度。 4.电泳常见的缓冲液为巴比妥液。 5.电泳后区带应无拖尾，各区带明显分开，如果电泳图谱分离不清或不整齐，最常见的原因 有 (1)点样过多 (2)点样不均匀，不整齐，样品触及薄膜边缘 (3)薄膜过湿，样品扩散 (4)薄膜未完全浸透或温度过高导致局干燥或水分蒸发 (5)薄膜与滤纸桥接触不良 (6)薄膜位置歪斜，弯曲，与电流方向不平行 (7)缓冲液变质 (8)样品不新鲜 (9)CAM质量不高等。 6.染料问题：在血清蛋白浓度范围内，氨基黑10对白蛋白染色过深，导致白蛋白结果偏高，球 蛋白偏低。 7.血清加量：标本应新鲜，不得溶血
5．漂洗 准备漂洗皿，装入漂洗液，从染色液中取出薄膜条并尽量沥去染色液，直至背景无色为止。 6．定量：洗脱比色法 氨基黑10B染色法：将各蛋白区带仔细剪下，分别置于各试管中，另从空白背景剪一块平均大小的膜 条置于空白管中，在白蛋白管内加入0.4mol/LNaOH溶液6ml（计算时吸光度乘以2），其余各管中加 入3ml，于37℃ 水浴20分钟，并不断摇动，待颜色脱净后，取出冷却。用620nm处比色，以空白管调 零，读取各管吸光度。 三 参考范围 白蛋白：57.45-71.73% α1 -球蛋白：1.76-4.48% α2 -球蛋白：4.04-8.28% β-球蛋白：6.79-11.39% γ-球蛋白：11.18-22.97% 四 注意事项 1．通电时，不得接触槽内缓冲液或CAM，以防触电。 2．CAM在电泳前，必须浸泡在巴比妥缓冲液中，使薄膜浸泡透彻。 3．缓冲液液面要保证一定高度，同时电泳槽两侧的液面应保持同一水平，否则通过薄膜时有虹 吸现象，会影响蛋白质分子的泳动速度。 4．电泳常见的缓冲液为巴比妥液。 5．电泳后区带应无拖尾，各区带明显分开，如果电泳图谱分离不清或不整齐，最常见的原因 有： （1）点样过多 （2）点样不均匀，不整齐，样品触及薄膜边缘 （3）薄膜过湿，样品扩散 （4）薄膜未完全浸透或温度过高导致局干燥或水分蒸发 （5）薄膜与滤纸桥接触不良 （6）薄膜位置歪斜，弯曲，与电流方向不平行 （7）缓冲液变质 （8）样品不新鲜 （9）CAM质量不高等。 6．染料问题：在血清蛋白浓度范围内，氨基黑10B对白蛋白染色过深，导致白蛋白结果偏高，球 蛋白偏低。 7．血清加量：标本应新鲜，不得溶血