安徽农业大学学报,2019,46(3):466-470 Journal of Anhui Agricultural University [DO]10.13610/cnki.1672-352x20190717014网络出版时间:2019/7/813:3446 UuRl]hTtp://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1162.s.20190717.1707.030.html 杨树组织培养研究进展 白玉娥,乌日罕,代金玲,鸟云塔娜 (内蒙古农业大学林学院,呼和浩特010019) 摘要:杨属树种具有分布广、适应性强、生长迅速、再生能力强、木质好及基因组相对较小等特性,是我 重要的造林树种。组织培养技术作为现代生物技术的重要组成部分,在杨属树种中应用广泛,为其遗传转化,产业 化繁殖提供了有效的途径。綜述杨树组织珸养的硏究概况和应用进展,提岀杨树组织珸养研究和应用过程中夺在的 问题和研究展望,以期为杨树的林业生产、园林绿化和有苗工作提供参考 关键词:杨树;植物组织培养;外植体;培养条件 中图分类号:S792.11 文献标识码:A 文章编号:1672-352X(2019)03-0466-05 Research progress on tissue culture of poplar BAI Yu'e. WU Rihan. DAI Jinling WUYUN Tana College of Forestry, Mongolia Agricultural University, Hohhot 010019) Abstract: Populus species are important afforestation tree species characterized by high suitability, rapid growth rate, strong regeneration, good woodiness and relatively small genome. As an important component of biotechnology, tissue culture is widely employed in cultivating populus species, which provide the possibility for their genetic improvement and industrializing propagation. The paper reviewed research overview and application progress, and pointed out problems in inducing process of tissue culture of poplar, so as to provide references for forestry production, landscaping and seedling breeding of poplar Key words: poplar; plant tissue culture; explants; culture conditions 杨树是杨柳科( Salicaceae)杨属( Populus l.)Duby)、白杨派( Sect Leuce Duby)、青杨派(Sect 树种的统称,具有分布广泛、生长迅速、适应性强、 tacamahaca Spech)、大叶杨派( Sect leucoides 再生能力强及基因组相对较小等特性。目前,我 Spech)和胡杨派( Sect Turanga Bag)中建立了多 国杨树人工林种植面积居世界首位,已有30个优良个树种的离体再生体系。为此,作者综述近年来 品种被规模化应用于全国26个省市。杨树己成为中杨树组织培养技术的研究概况及应用进展,以期为 国乃至世界上重要的造林绿化、工业用材树种2。杨树的林业生产、园林绿化和育苗工作提供参考 杨树组织培养技术萌芽于1934年,法国学者 Gautheret等最先通过培养欧洲黑杨( P nigra L.)形1外植体的选择 成层,成功获得了其愈伤组织。1964年,美国学1.1外植体的来源 者 Mathes通过接种美洲山杨( P tremuloides michx.) 杨树组织培养中,叶片、茎段、根、腋芽、顶 茎外植体获得了愈伤组织,并诱导出根和茎。1968芽、胚珠、原生质体等均可作为外植体材料。辛培 年,英国学者Woe和 Chalupa先后通过改良培尧等研究发现,以滇杨 P yunnanensis Dode)叶片 养基也成功诱导出美洲山杨的根和茎。20世纪70叶柄、嫩茎为外植体诱导不定芽时,叶柄所需诱导 年代中国开始了杨树组织培养的研究,目前该技术时间短且诱导率最高。张平冬等例用胡杨(Pcr 已达到一定水平,在五大派系黑杨派( Sect Aigeiros phratica Oliv)的茎段、叶片、嫩根和茎段愈伤组 收稿日期:2018-10-23 基金项目:西北地区杨树主栽品种高效、安全、规模化遗传转化体系研究(2018ZX08020002-005-05)项目资助。 共同第一作者简介:白玉娥,教授,博士生导师。 E-mail:bye6a163com乌日罕,硕士研究生。 E-mail:1609302811@qcom
收稿日期: 2018-10-23 基金项目: 西北地区杨树主栽品种高效、安全、规模化遗传转化体系研究（2018ZX08020002-005-005）项目资助。 共同第一作者简介: 白玉娥，教授，博士生导师。E-mail：bye666@163.com 乌日罕，硕士研究生。E-mail：1609302811@qq.com 安徽农业大学学报, 2019, 46(3): 466-470 Journal of Anhui Agricultural University [DOI] 10.13610/j.cnki.1672-352x.20190717.014 网络出版时间：2019/7/18 13:34:46 [URL] http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1162.S.20190717.1707.030.html 杨树组织培养研究进展 白玉娥，乌日罕，代金玲，乌云塔娜 (内蒙古农业大学林学院，呼和浩特 010019) 摘 要：杨属树种具有分布广、适应性强、生长迅速、再生能力强、木质好及基因组相对较小等特性，是我国 重要的造林树种。组织培养技术作为现代生物技术的重要组成部分，在杨属树种中应用广泛，为其遗传转化，产业 化繁殖提供了有效的途径。综述杨树组织培养的研究概况和应用进展，提出杨树组织培养研究和应用过程中存在的 问题和研究展望，以期为杨树的林业生产、园林绿化和育苗工作提供参考。 关键词：杨树；植物组织培养；外植体；培养条件 中图分类号：S792.11 文献标识码：A 文章编号：1672352X (2019)03046605 Research progress on tissue culture of poplar BAI Yu’e, WU Rihan, DAI Jinling, WUYUN Tana (College of Forestry, Mongolia Agricultural University, Hohhot 010019) Abstract: Populus species are important afforestation tree species characterized by high suitability, rapid growth rate, strong regeneration, good woodiness and relatively small genome. As an important component of biotechnology, tissue culture is widely employed in cultivating populus species, which provide the possibility for their genetic improvement and industrializing propagation. The paper reviewed research overview and application progress, and pointed out problems in inducing process of tissue culture of poplar, so as to provide references for forestry production, landscaping and seedling breeding of poplar. Key words: poplar; plant tissue culture; explants; culture conditions 杨树是杨柳科（Salicaceae）杨属（Populus L.） 树种的统称，具有分布广泛、生长迅速、适应性强、 再生能力强及基因组相对较小等特性[1]。目前，我 国杨树人工林种植面积居世界首位，已有 30 个优良 品种被规模化应用于全国 26 个省市。杨树已成为中 国乃至世界上重要的造林绿化、工业用材树种[2]。 杨树组织培养技术萌芽于 1934 年，法国学者 Gautheret 等最先通过培养欧洲黑杨（P. nigra L.）形 成层，成功获得了其愈伤组织[3]。1964 年，美国学 者Mathes通过接种美洲山杨（P. tremuloides Michx.） 茎外植体获得了愈伤组织，并诱导出根和茎[4]。1968 年，英国学者 Wolter[5]和 Chalupa[6]先后通过改良培 养基也成功诱导出美洲山杨的根和茎。20 世纪 70 年代中国开始了杨树组织培养的研究，目前该技术 已达到一定水平，在五大派系黑杨派（Sect Aigeiros Duby）、白杨派（Sect Leuce Duby）、青杨派（Sect Tacamahaca Spech）、大叶杨派（Sect Leucoides Spech）和胡杨派（Sect Turanga Bag）中建立了多 个树种的离体再生体系[7]。为此，作者综述近年来 杨树组织培养技术的研究概况及应用进展，以期为 杨树的林业生产、园林绿化和育苗工作提供参考。 1 外植体的选择 1.1 外植体的来源 杨树组织培养中，叶片、茎段、根、腋芽、顶 芽、胚珠、原生质体等均可作为外植体材料。辛培 尧等[8]研究发现，以滇杨(P. yvnnanensis Dode.)叶片、 叶柄、嫩茎为外植体诱导不定芽时，叶柄所需诱导 时间短且诱导率最高。张平冬等[9]用胡杨（P. euphratica Oliv.）的茎段、叶片、嫩根和茎段愈伤组
46卷3期 白玉娥等:杨树组织培养研究进展 织诱导不定芽,试验结果显示茎段诱导效果最佳, toids60/160× P. nigra'chil)叶柄为外植体接种到 诱导率为100%。邢亚娟等在中美山杨( p da- MS、1/2MS和WPM3种基本培养上,试验结果表 vidianⅹ P tremuloides)的芽分化研究中,发现带明,在3种培养基上不定芽的分化率差异极显著 腋芽的嫩茎是最佳的外植体,分化率高达975%。MS培养基分化率最高,为83.3%。赵清爽的研 也有研究发现,即使同一植株相同器官,由于其生究结果表明,2MS培养基上84K杨(PωbaⅹP 理状态及发育年龄不同,诱导分化的效果存在很大 glandulosa)生根效果好于l4MS和MS,其生根速 的差异,通常外植体越幼嫩,再生能力越强。而度快、生根率高且不定芽基部生根处愈伤组织块小 汪玲和项艳2的研究结果表明,725杨( p deltoides王春荣等研究发现培养基类型对枫杨( P tero cl.725)幼叶比刚抽出来的嫩叶产生愈伤组织的能 carya stenoptera CDC.)试管苗根诱导的影响非常 力强,可能是由于嫩叶发育不完全,易被消毒剂毒大,甚至大于生长素的影响,12DKW培养基的生 害,且容易褐化,导致了出愈率的降低。因此,外根率和根量均显著优于1/2MS培养基。 植体的选择需要从植物取材部位、外植体的生理状2.2培养条件 态及发育年龄等多方面加以考虑。 碳水化合物、光照、温度等培养条件对杨树再 1.2外植体的消毒 生系统建立有着重要影响。碳水化合物不仅为外植 组织培养过程中外植体的消毒是影响组织培养体提供能量,而且可以调节植物细胞的渗透势。刘 成败的一个关键环节。选择的消毒剂既要将表面的红梅在银中杨( P alba x p. berolinensis)的组织培 微生物彻底杀死,又要易于淸洗或能够自行分解 养试验中发现,在一定范围内,叶片的分化率随蔗 还要尽可能的保护外植体组织和表层细胞。常见的糖浓度的增加而升高,20gL蔗糖是银中杨生长的 消毒剂有酒精(π0%~75%,5~60s)、次氯酸钠溶最适碳源,而葡萄糖、麦芽糖均不利于不定芽的诱 液(2% Naclo,5~30min)、氯化汞溶液(0.1%~导。适宜的光照不仅可以延长愈伤组织的保存期, 1%HgCl2,2~10min)和双氧水(3%~10%HO,又可以防止继代苗玻璃化。在杨树的组织培养中, 5~15min)等。沈周高等对中林2001杨(P光照培养时间通常为16hd,而琼岛杨( P. giong deltoides cv. zhonglin')、南林95杨( p deltoids daoensis 7. Honget P. Luo)和箭胡毛杨( Populus x Bartr. cv. Lux x P euramericana(Dode) Guineir cv. Jianhumgo)适宜的光照时间为14hd1-2,四季杨 1-45/51)和南抗杨( P deltoides cl Nankang)3个品( P. canadensis spp)适宜的光照时间为12hd12 种的杨树用0.1%、0.2%及0.3%的HgCl2溶液分别有时候全黑或者弱光更有利于愈伤组织的形成和根 消毒2、4、6和8min,最后得出HgCh2浓度与材料的再生。贾小明等在新疆杨( p alba l var 的污染率、出愈率呈反比,使用0.1%HgCl2溶液, pyramidalis)叶片诱导不定芽时发现,暗培养3~5d 消毒4min效果最佳。黄枝英等4以台湾速生杨(P后再进行16hd光照培养比全程16hd光照培养 anam)嫩茎为材料,用0.1%和0.15%的HgCl2溶产生愈伤组织和不定芽的时间要早。培养温度过高 液分别消毒10和15min,最后得出使用0.%HgCl2过低都不利于组培苗生长,过高易产生玻璃化现象 溶液消毒10min时,消毒效果最好,此时污染率过低使组培苗生长缓慢,因此一般控制在25℃左右。 为23.3%,出芽率为75.3%。不同外植体材料对消 毒剂的敏感性不同,通常茎尖、茎段消毒时间比叶3植物生长调节剂对组织培养的影响 片所用时间长。因此,在实际操作过程中,要根 植物组织培养中,为了促进植物不同组织和器 据外植体大小、采集部位及发育年龄等因素选择适官的生长,需要在基本培养基中加入不同种类和浓 合的消毒剂和消毒时间 度的植物生长调节剂,如生长素、细胞分裂素等。 杨树组织培养基中常用的生长素有24-二氯苯氧乙 2培养基和培养条件的选择 酸(24-D)、萘乙酸(NAA)、吲哚乙酸(IAA) 2.1培养基 吲哚丁酸(IBA)等,细胞分裂素有6苄基氨基嘌 选择适合的培养基是组织培养成功的前提。李呤(6-BA)、激动素(KT)和塞苯隆(TDZ)等。 慧等在试验中比较了毛白杨(P. tomentosa) 3.1初代培养 号和02-9-22号在MS、1/2MS和1/4MS培养基上 在杨树初代培养中,多以茎尖或茎段为外植体 芽的诱导情况,结果显示MS培养基上两种毛白杨诱导芽。Han等四以山新杨( P davidiana dode x p 腋芽诱导率最高。付成华以南方常绿杨(P. del- bollena lauche)叶片为外植体诱导不定芽,研究表
46 卷 3 期 白玉娥等: 杨树组织培养研究进展 467 织诱导不定芽，试验结果显示茎段诱导效果最佳， 诱导率为 100%。邢亚娟等[10]在中美山杨（P. davidiana × P. tremuloides）的芽分化研究中，发现带 腋芽的嫩茎是最佳的外植体，分化率高达 97.5%。 也有研究发现，即使同一植株相同器官，由于其生 理状态及发育年龄不同，诱导分化的效果存在很大 的差异，通常外植体越幼嫩，再生能力越强[11]。而 汪玲和项艳[12]的研究结果表明，725 杨（P. deltoides cl.‘725’）幼叶比刚抽出来的嫩叶产生愈伤组织的能 力强，可能是由于嫩叶发育不完全，易被消毒剂毒 害，且容易褐化，导致了出愈率的降低。因此，外 植体的选择需要从植物取材部位、外植体的生理状 态及发育年龄等多方面加以考虑。 1.2 外植体的消毒 组织培养过程中外植体的消毒是影响组织培养 成败的一个关键环节。选择的消毒剂既要将表面的 微生物彻底杀死，又要易于清洗或能够自行分解， 还要尽可能的保护外植体组织和表层细胞。常见的 消毒剂有酒精（70%～75%，5～60 s）、次氯酸钠溶 液（2% NaClO，5～30 min）、氯化汞溶液（0.1%～ 1% HgCl2，2～10 min）和双氧水（3%～10% H2O2， 5～15 min）等。沈周高等[13]对中林 2001 杨（P. deltoides cv.‘zhonglin’)、南林 95 杨（P. deltoids Bartr.cv. Lux × P. euramericana（Dode）Guineir cv. I-45/51）和南抗杨（P.deltoides cl. Nankang）3 个品 种的杨树用 0.1%、0.2%及 0.3%的 HgCl2 溶液分别 消毒 2、4、6 和 8 min，最后得出 HgCl2 浓度与材料 的污染率、出愈率呈反比，使用 0.1% HgCl2 溶液， 消毒 4 min 效果最佳。黄枝英等[14]以台湾速生杨（P. Taiwan）嫩茎为材料，用 0.1%和 0.15%的 HgCl2溶 液分别消毒10和15 min ，最后得出使用0.1%HgCl2 溶液消毒 10 min 时，消毒效果最好，此时污染率 为 23.3%，出芽率为 75.3%。不同外植体材料对消 毒剂的敏感性不同，通常茎尖、茎段消毒时间比叶 片所用时间长[7]。因此，在实际操作过程中，要根 据外植体大小、采集部位及发育年龄等因素选择适 合的消毒剂和消毒时间。 2 培养基和培养条件的选择 2.1 培养基 选择适合的培养基是组织培养成功的前提。李 慧等[15]在试验中比较了毛白杨（P. tomentosa）30 号和 02-9-22 号在 MS、1/2 MS 和 1/4 MS 培养基上 芽的诱导情况，结果显示 MS 培养基上两种毛白杨 腋芽诱导率最高。付成华[16]以南方常绿杨(P. deltoids 60/160 × P. nigra ‘chile’）叶柄为外植体接种到 MS、1/2 MS 和 WPM 3 种基本培养上，试验结果表 明，在 3 种培养基上不定芽的分化率差异极显著， MS 培养基分化率最高，为 83.3%。赵清爽[17]的研 究结果表明，l/2 MS 培养基上 84K 杨（P. alba × P. glandulosa）生根效果好于 l/4 MS 和 MS，其生根速 度快、生根率高且不定芽基部生根处愈伤组织块小。 王春荣等[18]研究发现培养基类型对枫杨（P. terocarya stenoptera C.DC.）试管苗根诱导的影响非常 大，甚至大于生长素的影响，1/2 DKW 培养基的生 根率和根量均显著优于 1/2 MS 培养基。 2.2 培养条件 碳水化合物、光照、温度等培养条件对杨树再 生系统建立有着重要影响。碳水化合物不仅为外植 体提供能量，而且可以调节植物细胞的渗透势。刘 红梅[19]在银中杨（P. alba × P. berolinensis）的组织培 养试验中发现，在一定范围内，叶片的分化率随蔗 糖浓度的增加而升高，20 g·L-1蔗糖是银中杨生长的 最适碳源，而葡萄糖、麦芽糖均不利于不定芽的诱 导。适宜的光照不仅可以延长愈伤组织的保存期， 又可以防止继代苗玻璃化。在杨树的组织培养中， 光照培养时间通常为 16 h·d-1，而琼岛杨（P. qiongdaoensis T. Honget P. Luo）和箭胡毛杨（Populus × Jianhumao）适宜的光照时间为 14 h·d-1[21-22]，四季杨 （P. canadensis spp.）适宜的光照时间为 12 h·d-1[22]。 有时候全黑或者弱光更有利于愈伤组织的形成和根 的再生[23]。贾小明等[24]在新疆杨（P. alba L.var. pyramidalis）叶片诱导不定芽时发现，暗培养 3～5 d 后再进行 16 h·d-1光照培养比全程 16 h·d-1光照培养 产生愈伤组织和不定芽的时间要早。培养温度过高 过低都不利于组培苗生长，过高易产生玻璃化现象， 过低使组培苗生长缓慢，因此一般控制在 25℃左右。 3 植物生长调节剂对组织培养的影响 植物组织培养中，为了促进植物不同组织和器 官的生长，需要在基本培养基中加入不同种类和浓 度的植物生长调节剂，如生长素、细胞分裂素等。 杨树组织培养基中常用的生长素有 2,4-二氯苯氧乙 酸（2,4-D）、萘乙酸（NAA）、吲哚乙酸（IAA）、 吲哚丁酸（IBA）等，细胞分裂素有 6-苄基氨基嘌 呤（6-BA）、激动素（KT）和塞苯隆（TDZ）等。 3.1 初代培养 在杨树初代培养中，多以茎尖或茎段为外植体 诱导芽。Han 等[25]以山新杨（P. davidiana Dode × P. bollena Lauche）叶片为外植体诱导不定芽，研究表
安徽农业大学学报 2019 明添加0.3mgL6-BA和008 mgL NAA时诱导 率最高,为90%。付成华以常绿杨叶柄为外植体 4杨树组织培养中存在的问题 诱导不定芽,研究发现同时添加03mgL6BA和41污染 01 mgL NAA时诱导率最高,当6BA的浓度大 污染是组织培养中常见的一种问题。污染主要 于10mgL时,会出现畸形芽或玻璃化现象。Hai来自两个方面:一是由于外植体材料表面消毒不彻 等2在84K杨叶片诱导不定芽试验中发现,6BA底,由植物材料带入培养过程,或是植物的内生菌 和TDZ混合使用诱导效果最好,TDZ浓度以0002随培养材料带入培养过程;二是无菌操作过程中初代 ngL为宜。刘曦珏以西丰杨( p deltoides bar x p培养的外植体带菌、培养基和接种工具消毒不彻底 cathayana Rehd. cl. Xifeng25)25号茎段为外植体,因此,尽可能选择温室或人工气候室培养的材料、 添加002 mg-L- TDZ和005 mg.- INAA时腋芽诱选择适合的消毒方法严格消毒灭菌、按程序规范操 导率最高,为865%。说明细胞分裂素TDZ和低浓度作以降低污染率。郑进等在进行中嘉8号杨(P 的NAA配合使用,对腋芽的萌发和生长效果显著。 deltoides,L-63×L-69)的组织培养时,为了减少污染 3.2增殖培养 和快速获得无菌的繁殖材料,先从苗圃地里剪取健 在增殖培养过程中,一般细胞分裂素和生长素康的杨树枝条进行室内水培复幼,用枝条上长出的 配合使用。陈淑华等凹研究表明,银新杨( p alba x嫩枝和叶片作外植体,再进行消毒剂处理,可显著降 p. alba pyramidal)不定芽增殖时03mgL16-BA低外植体的污染率。 和0.5 mgL IAA I配合使用效果最佳。付成华研42褐化 究认为,在南方常绿杨增殖培养基中添加04mgLˉ 在林木组织培养过程中,外植体的褐化是普遍 GA3时增殖效果最好,丛生芽平均数为116个,苗存在的问题。在一定范围内,pH值越低(达到轻微 平均高28cm,但是GA3浓度过高时,会出现玻璃的酸性环境)越有利于抑制褐化的发生。李树丽3 化现象。王春荣等8研究结果表明,在同时添加10在研究中华红叶杨( P x euramericana cy. Zhonghua mgL6BA、1.0 mgL KT和03 mgL IBA的培 hongye)外植体褐变影响因素中发现,MsS培养基 养基上枫杨芽增殖效果高,说明6-BA与KT配合上的外植体褐化率比1/2MS培养基上的高,说明适 使用比单独使用的效果好。李开隆等凹在香杨(P当降低无机盐浓度可降低褐化率。在培养基中加入 koreana rehd)丛生芽增殖试验中发现,在添加10吸附剂活性炭可影响外植体的褐化率,在一定范围 mgLb6BA和0 I mgL NAA的培养基中,增殖芽内(0-3gL),加入的活性炭量越多,褐化率越 数平均达25倍。 Aggarwal等同在喜马拉雅杨(P低,但加入smgL活性炭时,褐化率反而上升 ciliate Wall.ex Royle)不定芽增殖试验中发现,在添琼脂的用量影响培养基的硬度,用量多时硬度大, 加0 mg.- TDZ和002 mg-L-INAA的培养基中,则褐化率小,但硬度过大,不利于外植体吸收营养, 增殖效果最好,增殖率为69.28%。 造成生长不良。许继飞在欧美杨108(P 33生根培养 euramericana' Guariento’)再生体系建立的试验中发 杨树生根培养过程中选择适当的生长调节剂是现,浓度较低的蔗糖,有利于减轻外植体的褐化现 根系生长的关键因子杜晓艳研究了IBA和NA象。因此,防止材料的褐化应从外植体的选择、消 对青海青杨( P. cathayana Rehd. Var. Qinghai)无菌毒、培养基以及培养条件等多方面考虑。 苗生根的影响,结果表明IBA的生根效果好于4.3玻璃化 NAA,生根率可达100%张瑞芝等2在欧美杨( 培养基中无机盐、激素种类及比例不适,蔗糖 nigra X P. deltoides)生根的研究中发现,NAA浓度和琼脂浓度低,培养条件不适宜均会导致组培苗玻 为025mgL时,生根率最高为85%。有些研究则璃化的产生。TDZ虽然对腋芽的萌发和生长效果较 表明,两种生长素配合使用要比单一使用效果好。好,但浓度过高会导致玻璃化现象。因此,在使用 Wei等門在毛白杨生根培养试验中发现,10mgL1时浓度最好低于002mgL。赵鑫闻在甜杨 IBA和05mg11NAA混合使用比单独使用诱导出( Suaveolens fisch)组织培养中通过增加光照强 的根粗壮,生根率可达100%。黄枝英等叫在台湾度和琼脂浓度逆转了玻璃化苗,从而获得了健壮的 速生杨生根培养试验中研究发现,在生根培养基中组培苗。秦静远等报道,琼脂浓度与玻璃化苗发 添加适当浓度的活性炭或者矮壮素(CCC)生根效生率呈极显著负相关,提高琼脂浓度是控制玻璃化 果更好 的有效途径。另外,继代次数过多、幼苗营养不良
468 安 徽 农 业 大 学 学 报 2019 年 明添加 0.3 mg·L-1 6-BA 和 0.08 mg·L-1 NAA 时诱导 率最高，为 90%。付成华[16]以常绿杨叶柄为外植体 诱导不定芽，研究发现同时添加 0.3 mg·L-1 6-BA 和 0.1 mg·L-1 NAA 时诱导率最高，当 6-BA 的浓度大 于 1.0 mg·L-1 时，会出现畸形芽或玻璃化现象。Hai 等[26]在 84K 杨叶片诱导不定芽试验中发现，6-BA 和 TDZ 混合使用诱导效果最好，TDZ 浓度以 0.002 mg·L-1 为宜。刘曦珏[27]以西丰杨（P. deltoldes Bar × P. cathayana Rehd.Cl.‘Xifeng-25’）25 号茎段为外植体， 添加 0.02 mg·L-1 TDZ 和 0.05 mg·L-1 NAA 时腋芽诱 导率最高，为 86%。说明细胞分裂素 TDZ 和低浓度 的 NAA 配合使用，对腋芽的萌发和生长效果显著。 3.2 增殖培养 在增殖培养过程中，一般细胞分裂素和生长素 配合使用。陈淑华等[28]研究表明，银新杨（P. alba × p. alba pyramidali）不定芽增殖时 0.3 mg·L-1 6-BA 和 0.5 mg·L-1 IAA 配合使用效果最佳。付成华[16]研 究认为，在南方常绿杨增殖培养基中添加 0.4 mg·L-1 GA3 时增殖效果最好，丛生芽平均数为 11.6 个，苗 平均高 2.8 cm，但是 GA3 浓度过高时，会出现玻璃 化现象。王春荣等[18]研究结果表明，在同时添加 1.0 mg·L-1 6-BA、1.0 mg·L-1 KT 和 0.3 mg·L-1 IBA 的培 养基上枫杨芽增殖效果高，说明 6-BA 与 KT 配合 使用比单独使用的效果好。李开隆等[29]在香杨（P. koreana Rehd.）丛生芽增殖试验中发现，在添加 1.0 mg·L-16-BA 和 0.1 mg·L-1NAA 的培养基中，增殖芽 数平均达 25 倍。Aggarwal 等[30]在喜马拉雅杨（P. ciliate Wall.ex Royle）不定芽增殖试验中发现，在添 加 0.1 mg·L-1TDZ 和 0.02 mg·L-1NAA 的培养基中， 增殖效果最好，增殖率为 69.28%。 3.3 生根培养 杨树生根培养过程中选择适当的生长调节剂是 根系生长的关键因子。杜晓艳[31]研究了 IBA 和 NAA 对青海青杨（P. cathayana Rehd.Var. Qinghai）无菌 苗生根的影响，结果表明 IBA 的生根效果好于 NAA，生根率可达 100%。张瑞芝等[32] 在欧美杨（P. nigra × P. deltoides）生根的研究中发现，NAA 浓度 为 0.25 mg·L-1 时，生根率最高为 85%。有些研究则 表明，两种生长素配合使用要比单一使用效果好。 Wei 等[33]在毛白杨生根培养试验中发现，1.0 mg·L-1 IBA 和 0.5 mg·L-1 NAA 混合使用比单独使用诱导出 的根粗壮，生根率可达 100%。黄枝英等[14]在台湾 速生杨生根培养试验中研究发现，在生根培养基中 添加适当浓度的活性炭或者矮壮素（CCC）生根效 果更好。 4 杨树组织培养中存在的问题 4.1 污染 污染是组织培养中常见的一种问题。污染主要 来自两个方面：一是由于外植体材料表面消毒不彻 底，由植物材料带入培养过程，或是植物的内生菌 随培养材料带入培养过程；二是无菌操作过程中初代 培养的外植体带菌、培养基和接种工具消毒不彻底[34]。 因此，尽可能选择温室或人工气候室培养的材料、 选择适合的消毒方法严格消毒灭菌、按程序规范操 作以降低污染率。郑进等[35]在进行中嘉 8 号杨(P. deltoides, I-63 × I-69)的组织培养时，为了减少污染 和快速获得无菌的繁殖材料，先从苗圃地里剪取健 康的杨树枝条进行室内水培复幼，用枝条上长出的 嫩枝和叶片作外植体，再进行消毒剂处理,可显著降 低外植体的污染率。 4.2 褐化 在林木组织培养过程中，外植体的褐化是普遍 存在的问题。在一定范围内，pH 值越低（达到轻微 的酸性环境）越有利于抑制褐化的发生。李树丽[36-37] 在研究中华红叶杨（P. × euramericana cv. ‘Zhonghuahongye’）外植体褐变影响因素中发现，MS 培养基 上的外植体褐化率比 1/2 MS 培养基上的高，说明适 当降低无机盐浓度可降低褐化率。在培养基中加入 吸附剂活性炭可影响外植体的褐化率，在一定范围 内（0～3 g·L-1），加入的活性炭量越多，褐化率越 低，但加入 5 mg·L-1 活性炭时，褐化率反而上升。 琼脂的用量影响培养基的硬度，用量多时硬度大， 则褐化率小，但硬度过大，不利于外植体吸收营养， 造成生长不良[37]。许继飞[38]在欧美杨 108（P. euramericana ‘Guariento’）再生体系建立的试验中发 现，浓度较低的蔗糖，有利于减轻外植体的褐化现 象。因此，防止材料的褐化应从外植体的选择、消 毒、培养基以及培养条件等多方面考虑。 4.3 玻璃化 培养基中无机盐、激素种类及比例不适，蔗糖 和琼脂浓度低，培养条件不适宜均会导致组培苗玻 璃化的产生。TDZ 虽然对腋芽的萌发和生长效果较 好，但浓度过高会导致玻璃化现象。因此，在使用 时浓度最好低于 0.02 mg·L-1 [28]。赵鑫闻[39]在甜杨 （P.suaveolens Fisch.) 组织培养中通过增加光照强 度和琼脂浓度逆转了玻璃化苗，从而获得了健壮的 组培苗。秦静远等[40]报道，琼脂浓度与玻璃化苗发 生率呈极显著负相关，提高琼脂浓度是控制玻璃化 的有效途径。另外，继代次数过多、幼苗营养不良
46卷3期 白玉娥等:杨树组织培养研究进展 及呈饥饿状态也会导致组培苗的玻璃化。 [MATHES M C. The in vitro formation of pianlets from solated aspen tissues[J]. Phyton, 1964, 21: 137-141 5杨树组织培养的应用及展望 5 WOLTER KE Root and shoot initiation in aspen callus cultures]. Nature,1968,2195153):509-510 随着组织培养技术的发展,通过离体组织培养 6 CHALUPA V. Control of root and shoot formation and 的方式来诱导植物染色体加倍技术变得越来越成 production of trees from poplar callus[]. Biol Plant, 1974, 熟。而杨树多倍体品种在林业生产中具有巨大的潜 16(4)316-320. 力。蔡肖以小青杨( P. pseudo-simonii Kitag)离⑦刘岩,周军,段安安,等杨树组织培养的研究进展 体叶片为材料,在建立离体再生体系和悬浮细胞培 安徽农业科学,2011,394):2116-2119 [8]辛培尧,刘岩,段安安,等,滇杨不同外植体分化培养 养体系的基础上,诱导染色体加倍,成功培育了小 研究门云南农业大学学报(自然科学版),2011,26(6 青杨四倍体植株,并且其倍性水平表现稳定。陈 828-832,860 杰以滇杨叶柄为材料,以秋水仙素结合组织培养凹]张平冬,康向阳,高鹏,等胡杨离体培养分化增殖途 的方法进行多倍体诱导,最终得到四倍体植株。王 径的比较研究[北京林业大学学报,2003,25(6 沛琦采用秋水仙碱浸泡法处理白杨杂种三倍体 50-54 北林雄株1号”和“北林雄株2号”离体叶片,进行[邢亚娟,杨传平,白卉中美山杨组织培养芽分化影响 染色体加倍,成功获得六倍体植株,为创造白杨六 因素研究林业科技,2005,30(51-4 [!]l朱大保.国外杨树组培微繁技术的进展门]北京林业大 倍体新种质奠定了理论和实践基础 学学报,1990,12(1):284-91 杨树作为林木基因工程的模式植物,在2004[12]汪玲,项艳725杨组培繁殖技术研究叮安徽农业大学 年全基因组测序完成后,基因转化方面的研究已成 学报,2013,40(4):612-617 为杨树育种的热点,特别是在耐盐碱、抗虫、抗病[3]沈周高,项艳,蔡诚,等.3个杨树品种叶片再生体系的 等抗性育种方面。Zuo等利用CyAc和Cry3A 建立门中国农学通报,2006,22(11):90-96 基因构建表达载体,通过农杆菌介导的方法转化到[141黄枝英,庄卫东,汤红玲,等台湾速生杨树离体再生 741杨树[ P. alba l.x( p davidiana Dode+P. sImonII 体系的建立[福建农业学报,2018,33(4)386-390 Car)xP. tomentosa Carr. I克隆体中,经过一系列筛I5]李慧两个白杨派树种组织培养快繁技术研究[D杨凌 西北农林科技大学,2012 选,获得了对鳞翅目和鞘翅目害虫具有高度抗性的 [6】付成华.黑杨派杨树再生体系建立的研究[D]武汉 转基因品系,命名为Pb29和CC84。研究杨树开花 华中农业大学,2005 时间的控制能力和特定花相关基因的鉴定具有重要17赵清爽84K杨组织培养及基因转化的研究D]西安 的意义。Yang等以小叶杨和欧洲黑杨杂种(P 陕西师范大学,200 sImonⅱ× P. nigra)中后期无核花粉粒为外植体,对[l8]王春荣,毕君,张往祥,等.枫杨组织培养快繁技术研 单倍体杨树早期开花API基因转化进行了研究,结 究门中国农学通报,2013,29(25)42-48 果显示,转AP1基因杨树的开花期与对照相比显著[9刘红梅.银中杨的组织培养与遗传转化研究D哈尔 提前。这是关于AP1转基因杨树开花时间变化的首 滨:东北林业大学,2008 次报道,这些结果为杨树的遗传改良和育种开辟了 [20]周双清,梁居红.琼岛杨愈伤组织培养的初步研究即 热带林业,2014,42(2):15-17 新的可能性。 [21]李毅,邸利,洪涛,等.箭胡毛杨愈伤组织诱导、保存 杨树组织培养的建立与完善为其在短时间内繁 与再分化门西北植物学报,2002,2(3)656-660 殖大量优质种苗提供了可能性,在此基础上利用基[22]沈迪玉四季杨茎段组织培养初步研究卩安徽农业科 因工程和分子技术,可进行杨树抗性育种与品种改 学,2010,38(11)5549-5550,5573 良等相关研究,这将极大地促进杨树的生产应用,[23]李慧,陈晓阳,李云,等银白杨叶片不定芽再生影响 继而为推动林业的可持续发展做出更大贡献。 因素的研究北京林业大学学报,2004,26(3):46-50 [24]贾小明,樊军锋,王娟娟,等.河北杨和新疆杨离体叶 参考文献: 片诱导不定芽研究[西北农林科技大学学报(自然科 ]马丽,沈昕,陈少良,等.群众杨组培体系的研究门河 学版),2006,34(12:110-114,120 北林果研究,2005,202):114-116,119 [25 HAN X, MASR, KONG X H, et al. Efficient Agrobacte [2]赵自成,韩一凡,苏雪辉,等.杨树抗虫速生新品种特 rium-mediated transformation of hybrid poplar Populus avidiana dode x populus bollena lauche[ J]. IJMS, 2013 异性及其功能中国林业产业,2006(1):30-32. 14(2):2515-2528 3] GAUTHERETR J Plant tissue culture: A history[]. Bot [26] HAI G H, JIA Z G XU w J, et al. Characterization of the Mag Tokyo,1983,96(4):393-410. Populus PtrCesA4 promoter in transgenic Populus alba x
46 卷 3 期 白玉娥等: 杨树组织培养研究进展 469 及呈饥饿状态也会导致组培苗的玻璃化[16]。 5 杨树组织培养的应用及展望 随着组织培养技术的发展，通过离体组织培养 的方式来诱导植物染色体加倍技术变得越来越成 熟。而杨树多倍体品种在林业生产中具有巨大的潜 力。蔡肖[41]以小青杨（P. pseudo-simonii Kitag.）离 体叶片为材料，在建立离体再生体系和悬浮细胞培 养体系的基础上，诱导染色体加倍，成功培育了小 青杨四倍体植株，并且其倍性水平表现稳定。陈 杰[42]以滇杨叶柄为材料，以秋水仙素结合组织培养 的方法进行多倍体诱导，最终得到四倍体植株。王 沛琦[43]采用秋水仙碱浸泡法处理白杨杂种三倍体 “北林雄株 1 号”和“北林雄株 2 号”离体叶片，进行 染色体加倍，成功获得六倍体植株，为创造白杨六 倍体新种质奠定了理论和实践基础。 杨树作为林木基因工程的模式植物，在 2004 年全基因组测序完成后，基因转化方面的研究已成 为杨树育种的热点，特别是在耐盐碱、抗虫、抗病 等抗性育种方面。 Zuo 等[44]利用 Cry1Ac 和 Cry3A 基因构建表达载体，通过农杆菌介导的方法转化到 741 杨树[P. alba L. × (P. davidiana Dode + P. simonii Carr.) × P. tomentosa Carr.]克隆体中，经过一系列筛 选，获得了对鳞翅目和鞘翅目害虫具有高度抗性的 转基因品系，命名为 Pb29 和 CC84。研究杨树开花 时间的控制能力和特定花相关基因的鉴定具有重要 的意义。Yang 等[45]以小叶杨和欧洲黑杨杂种（P. simonii × P. nigra）中后期无核花粉粒为外植体，对 单倍体杨树早期开花 AP1 基因转化进行了研究，结 果显示，转 AP1 基因杨树的开花期与对照相比显著 提前。这是关于 AP1 转基因杨树开花时间变化的首 次报道，这些结果为杨树的遗传改良和育种开辟了 新的可能性。 杨树组织培养的建立与完善为其在短时间内繁 殖大量优质种苗提供了可能性，在此基础上利用基 因工程和分子技术，可进行杨树抗性育种与品种改 良等相关研究，这将极大地促进杨树的生产应用， 继而为推动林业的可持续发展做出更大贡献。 参考文献： [1] 马丽, 沈昕, 陈少良, 等. 群众杨组培体系的研究[J].河 北林果研究, 2005, 20(2):114-116, 119. [2] 赵自成, 韩一凡, 苏雪辉, 等. 杨树抗虫速生新品种特 异性及其功能[J].中国林业产业, 2006(11): 30-32. [3] GAUTHERET R J. Plant tissue culture: A history[J]. Bot Mag Tokyo, 1983, 96(4): 393-410. [4] MATHES M C. The in vitro formation of pianlets from isolated aspen tissues[J]. Phyton, 1964, 21:137-141. [5] WOLTER K E. Root and shoot initiation in aspen callus cultures[J]. Nature, 1968, 219(5153): 509-510. [6] CHALUPA V. Control of root and shoot formation and production of trees from poplar callus[J]. Biol Plant, 1974, 16(4): 316-320. [7] 刘岩, 周军, 段安安, 等. 杨树组织培养的研究进展[J]. 安徽农业科学, 2011, 39(4): 2116-2119. [8] 辛培尧, 刘岩, 段安安, 等. 滇杨不同外植体分化培养 研究[J].云南农业大学学报(自然科学版), 2011, 26(6): 828-832, 860. [9] 张平冬, 康向阳, 高鹏, 等.胡杨离体培养分化增殖途 径的比较研究[J].北京林业大学学报, 2003, 25(6): 50-54. [10] 邢亚娟, 杨传平, 白卉.中美山杨组织培养芽分化影响 因素研究[J].林业科技, 2005, 30(5):1-4. [11] 朱大保. 国外杨树组培微繁技术的进展[J].北京林业大 学学报, 1990, 12(1): 84-91. [12] 汪玲, 项艳.725 杨组培繁殖技术研究[J].安徽农业大学 学报, 2013, 40(4): 612-617. [13] 沈周高, 项艳, 蔡诚, 等. 3 个杨树品种叶片再生体系的 建立[J]. 中国农学通报, 2006, 22(11): 90-96. [14] 黄枝英, 庄卫东, 汤红玲, 等.台湾速生杨树离体再生 体系的建立[J].福建农业学报, 2018, 33(4): 386-390. [15] 李慧.两个白杨派树种组织培养快繁技术研究[D]. 杨凌: 西北农林科技大学, 2012. [16] 付成华. 黑杨派杨树再生体系建立的研究[D]. 武汉: 华中农业大学, 2005. [17] 赵清爽. 84K 杨组织培养及基因转化的研究[D]. 西安: 陕西师范大学, 2003. [18] 王春荣, 毕君, 张往祥, 等. 枫杨组织培养快繁技术研 究[J].中国农学通报, 2013, 29(25):42-48. [19] 刘红梅. 银中杨的组织培养与遗传转化研究[D]. 哈尔 滨: 东北林业大学, 2008. [20] 周双清, 梁居红. 琼岛杨愈伤组织培养的初步研究[J]. 热带林业, 2014, 42(2): 15-17. [21] 李毅, 邸利, 洪涛, 等. 箭胡毛杨愈伤组织诱导、保存 与再分化[J].西北植物学报, 2002, 22(3): 656-660. [22] 沈迪玉.四季杨茎段组织培养初步研究[J].安徽农业科 学, 2010, 38(11): 5549-5550, 5573. [23] 李慧, 陈晓阳, 李云, 等. 银白杨叶片不定芽再生影响 因素的研究[J].北京林业大学学报, 2004, 26(3):46-50. [24] 贾小明, 樊军锋, 王娟娟, 等. 河北杨和新疆杨离体叶 片诱导不定芽研究[J].西北农林科技大学学报(自然科 学版), 2006, 34(12):110-114, 120 [25] HAN X, MA S R, KONG X H, et al. Efficient Agrobacterium-mediated transformation of hybrid poplar Populus davidiana dode × Populus bollena lauche[J]. IJMS, 2013, 14(2): 2515-2528. [26] HAI G H, JIA Z G, XU W J, et al. Characterization of the Populus PtrCesA4 promoter in transgenic Populus alba ×
安徽农业大学学报 2019 P. glandulosa]. Plant Cell Tiss Organ Cult,2016,124(3)[36]李树丽。中华红叶杨无菌繁殖体系建立的影响因素研 495-505 究[D]济南:山东师范大学,2008 27]刘曦珏三种杨树再生体系的建立及三倍体银中杨转[37李树丽培养基中不同因素对中华红叶杨外植体褐变 YUCCAl基因的研究[D重庆:西南大学,2010 的影响[江苏农业科学,2014,42(1):44-46 28]陈淑华,王彦,刘晓慧,等银新杨组织培养快繁技术138许继飞.欧美杨108再生体系的优化及转天花粉蛋白 的研究门吉林林业科技,201140(4)46. 基因的研究[D哈尔滨:东北林业大学,2006 29]李开隆,靳春莲,李明德,等.香杨的组织培养和植株9]赵鑫闻甜杨叶片高频率植株再生体系的建立中国 再生门植物生理通讯,2009,45(3)281. 农学通报,2015,31(34)6-9 [30 AGGARWAL G GAUR A, SRIVASTAVA D K Estab lishment of high frequency shoot regeneration system in[40秦静远,王军利,王富容.植物组织培养中的玻璃化现 象门杨凌职业技术学院学报,2004,3(2).51-53. Himalayan poplar(Populus ciliata Wall. ex Royle)from petiole explants using Thidiazuron cytokinin as plant4l蔡肖,青杨原生质体培养及叶片离体染色体加倍研究 growth regulator[J]. J For Res, 2015, 26(3): 651-656 D]北京:北京林业大学,2011 31]杜晓艳.三种杨树再生体系的建立及青海青杨遗传转42]陈杰滇杨多倍体种质的诱导及鉴定D]昆明:西南林 化的研究D]重庆:西南大学,2010 业大学,2013 [32]张瑞芝,王峰,李丹蕾,等.欧美杨再生体系的建立43]王沛琦.白杨杂种三倍体离体快繁与六倍体诱导D 中国农学通报,2017,33(4):48-3 北京:北京林业大学,2014 [33]WEI F, ZHAO FF, TIAN B M In vitro regeneration of [44] Z0oL H, YANG R L, Zhen ZX, et al. A 5-year field Populus tomentosa from petioles. J For Res, 2017, study showed no apparent effect of the Bt transgenic 741 28(3):465-471 poplar on the arthropod community and soil bacterial di 34]ORLIKOWSKA T, NOWAK K, REED B Bacteria versity[J]. Sci Rep, 2018, 8: 1956 plant tissue culture environment]. Plant Cell Tiss [45 YANG JL, LI K, LIC Y, et al. In vitro anther culture and Cult,2017,128(3):487-508 Agrobacterium-mediated transformation of the API [35]郑进,康薇,洪华珠,等.中嘉8号杨的组织培养和植 genefrom Salix integra Linn. in haploid poplar(Populu 株再生[]黄石理工学院学报,2007,23(5):19-23 simonii x P nigra]J For Res, 2018, 29(2): 321-330
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