第34卷第5期 北京理工大学学报 Vol 34 2014年5月 Transactions of Beijing Institute of Technology May 2014 显微细胞图像分析方法的研究进展 刘志文,安兴,李衡,时永刚,黄亚丽,杨婷 (北京理工大学信息与电子学院,北京100081) 摘要:阐述了图像处理技术在显微细胞图像处理领域的发展现状,包括显微细胞图像预处理算法、细胞分割算 法、细胞跟踪算法、细胞形状变化分析、3D细胞图像分析等内容.指出了显微细胞图像处理研究中的难点,如非刚 体形状的描述,旋转、平移、尺度变化对形状描述影响的消除,3D形状信息的提取和压缩等.并探讨了显微细胞图 像处理由静态图像分析向动态图像分析,由2D图像分析向3D图像分析,由定性分析向定量分析的发展趋势 关键词:显微细胞图像;细胞分割;细胞跟踪;形状分析;3D细胞图像 中图分类号:TN911.73 文献标志码:A 文章编号:1001-0645(2014)05-0441-13 Progress in Cell Image processing and analysis LIU Zhi-wen, AN Xing, LI Heng, SHI Yong-gang, HUANG Ya-li, YANG Ting (School of Information and Electronics, Beijing Institute of Technology, Beijing 100081, China) Abstract: In the paper, the research status of the art of image processing algorithms in the field of :ll image analysis are presented, which including cell image preprocessing, cell segmentation cell tracking, cell shape analysis, and 3D cell image analysis. And the existing problems are pointed out, such as the non-rigid shape representation, the elimination of shape pose, 3D information extraction and compression. In addition, this paper also introduces the important tendency in the field, which is to quantitatively analyze dynamic images and 3D images. Key words: microscopic image; cell segmentation; cell tracking; shape analysis; 3D cell image 细胞是生物体最基本的结构和功能单元,在人和图像处理技术的日趋成熟,使得计算机图像处理 体内具有不同的形态,其大小、形状和密度等形态参技术在生物医学中的应用方兴未艾,极大地推动了 数均随其所处的生理、病理条件变化而变化.因此,显微细胞图像分析技术的发展.细胞图像处理技术 提取单个或多个细胞的形态特征参数来探究人体的与医学分析方法的结合能够取代医务人员在显微镜 生理或病理现象具有重要的意义和广泛的应用前下直接观察细胞从而做出主观判断的传统方法,具 景,并早已成为临床医学及生物研究中一个重要的有客观性强、工作效率高、准确性高、可靠性高等优 方向[-.在过去几十年中,为了研究细胞的形态变势7.这种定量分析的方法在临床诊断和治疗中 化,检测细胞的变异等,医务人员主要是通过显微镜起着越来越重要的作用;同时,它正成为生物医学研 对细胞样本直接进行观察.这种方法不仅耗时、繁究中的主要分析测试手段,并推动生物医学研究由 琐,同时还存在一定的主观性和不确定性 定性向定量方面发展 显微细胞图像处理是医学图像处理领域重要的 本文主要介绍了利用图像处理技术对细胞显微 分支之一,是利用计算机图像处理技术和模式识别图像进行分析的国内外研究进展,给出了对细胞显 技术进行显微细胞图像定量分析和病变识别的方微图像进行预处理、分割、跟踪、形态变化分析、分类 法[4.近年来,随着计算机及相关技术的迅速发展的典型算法,并对本领域的未来研究方向进行了 收稿日期:2014-03-20 基金项目:国家自然科学基金资助项目(61271112) 作者简介:刘志文(1962-),男,博士,教授,E-mail:zwliu@bit.edu.cn
收稿日期:2014 03 20 基金项目:国家自然科学基金资助项目(61271112) 作者简介:刘志文(1962—),男,博士,教授,E-mail:zwliu@bit.edu.cn. 第34卷 第5期 2014年5月 北 京 理 工 大 学 学 报 TransactionsofBeijingInstituteofTechnology Vol.34 No.5 May2014 显微细胞图像分析方法的研究进展 刘志文, 安兴, 李衡, 时永刚, 黄亚丽, 杨婷 (北京理工大学 信息与电子学院,北京 100081) 摘 要:阐述了图像处理技术在显微细胞图像处理领域的发展现状,包括显微细胞图像预处理算法、细胞分割算 法、细胞跟踪算法、细胞形状变化分析、3D细胞图像分析等内容.指出了显微细胞图像处理研究中的难点,如非刚 体形状的描述,旋转、平移、尺度变化对形状描述影响的消除,3D 形状信息的提取和压缩等.并探讨了显微细胞图 像处理由静态图像分析向动态图像分析,由2D图像分析向3D图像分析,由定性分析向定量分析的发展趋势. 关键词:显微细胞图像;细胞分割;细胞跟踪;形状分析;3D细胞图像 中图分类号:TN911.73 文献标志码:A 文章编号:1001-0645(2014)05-0441-13 ProgressinCellImageProcessingandAnalysis LIUZhi-wen, ANXing, LIHeng, SHIYong-gang, HUANGYa-li, YANGTing (SchoolofInformationandElectronics,BeijingInstituteofTechnology,Beijing100081,China) Abstract:Inthepaper,theresearchstatusoftheartofimageprocessingalgorithmsinthefieldof cellimageanalysisarepresented,whichincludingcellimagepreprocessing,cellsegmentation, celltracking,cellshapeanalysis,and3Dcellimageanalysis.Andtheexistingproblemsare pointedout,suchasthenon-rigidshaperepresentation,theeliminationofshapepose,3D informationextractionandcompression.Inaddition,thispaperalsointroducestheimportant tendencyinthefield,whichistoquantitativelyanalyzedynamicimagesand3Dimages. Keywords:microscopicimage;cellsegmentation;celltracking;shapeanalysis;3Dcellimage 细胞是生物体最基本的结构和功能单元,在人 体内具有不同的形态,其大小、形状和密度等形态参 数均随其所处的生理、病理条件变化而变化.因此, 提取单个或多个细胞的形态特征参数来探究人体的 生理或病理现象具有重要的意义和广泛的应用前 景,并早已成为临床医学及生物研究中一个重要的 方向[13].在过去几十年中,为了研究细胞的形态变 化,检测细胞的变异等,医务人员主要是通过显微镜 对细胞样本直接进行观察.这种方法不仅耗时、繁 琐,同时还存在一定的主观性和不确定性. 显微细胞图像处理是医学图像处理领域重要的 分支之一,是利用计算机图像处理技术和模式识别 技术进行显微细胞图像定量分析和病变识别的方 法[45].近年来,随着计算机及相关技术的迅速发展 和图像处理技术的日趋成熟,使得计算机图像处理 技术在生物医学中的应用方兴未艾,极大地推动了 显微细胞图像分析技术的发展.细胞图像处理技术 与医学分析方法的结合能够取代医务人员在显微镜 下直接观察细胞从而做出主观判断的传统方法,具 有客观性强、工作效率高、准确性高、可靠性高等优 势[67].这种定量分析的方法在临床诊断和治疗中 起着越来越重要的作用;同时,它正成为生物医学研 究中的主要分析测试手段,并推动生物医学研究由 定性向定量方面发展. 本文主要介绍了利用图像处理技术对细胞显微 图像进行分析的国内外研究进展,给出了对细胞显 微图像进行预处理、分割、跟踪、形态变化分析、分类 的典型算 法,并 对 本 领 域 的 未 来 研 究 方 向 进 行 了
北京理工大学学报 第34卷 展望 1显微细胞图像预处理 图像预处理是对质量不高的原始图像进行增强 和复原的处理手段,以便提取有用信息.在显微细 胞图像的获取过程中,通常会因成像设备、光学系统 (a)原图像 线性模型预处理结果图 等存在噪声及干扰使得图像模糊,难以获得细胞边图1利用相差显微镜成像原理的线性模型对细胞图像预处理示 缘等特征信息.所以预先对显微细胞图像进行去除Fg.1 Schematic diagram of cell image preprocessing based or 噪声和增强细节等处理,是整个细胞图像处理流程 the linear model using the optical properties of phas 中的关键.常见的预处理方法有平滑滤波、数学形 contrast microscopes 态学滤波、多分辨率小波变换、多光谱波段处理等算2显微细胞图像分割方法 法,这些算法都是将显微细胞图像当作“自然”图像 进行处理,并没有过多考虑显微镜成像原理所引起 细胞分割是根据彩色、灰度、几何形状、位置信 的“误差 息等特征把细胞图像划分成若干个互不相交的区 近几年,美国卡内基梅陇大学 Takeo Kanade域,使得这些特征在同一个区域中表现出一致性或 教授所在的课题组通过对相差显微镜( phase相似性,而在不同区域间表现出明显的不同.作为 contrast microscope)成像过程中光学性质的研究发医学图像处理中最为基础和重要的领域之一,细胞 现[,从相差显微镜中观察到的细胞并不是其真分割是对细胞图像进行识别、计数、跟踪、形态分析 实大小他们通过计算得到了光学显微镜成像的数的基本前提,是进行细胞信息提取、分析与定量研究 学模型,提出一种通过还原显微镜成像原理对细胞的关键,直接关系到诊断的可靠性,同时也是医学图 显微图像进行预处理的方法,并利用其对相差显微像处理领域的一个经典难题 图像进行了修复。根据成像过程的光学路径,相差2.1基于阈值的细胞分割方法 显微成像过程可定义为一个线性模型g=HJf,其中 基于阈值的细胞分割方法主要是根据细胞图像 g为观察得到的图像(显微镜成像),∫为经过修复的灰度直方图,通过设置阈值把像素点按灰度级分 后的图像(重构图像).通过求取此模型的二次最优为内部点集和外部点集,从而实现细胞的分割.对 约束方程的近似解即可得到修复后的图像,其约束于经过预处理得到的清晰细胞图像,可以通过以下 方程为 阈值分割公式定义出多个区域 O(f)=H-g+wL∫+nAf 1T≤f(x,y)≤T (2) (1) 0其他 式中L为相邻像素之间相似性的拉普拉斯矩阵,定式中:f(x,y)为原图像灰度值;g(x,y)为根据周值 义了图像的平滑度;A为稀疏正则化的正对角矩阵 T-1和T;所定义的第i个分割的区域的灰度值 定义了图像的稀疏度;,和xr为其相应的权重系 阈值分割方法的优势在于计算量小、性能稳定, 数;·‖。为l。范数. 适用于目标和背景的灰度范围差别较大的细胞图像 文献[9]中分别对人体肌肉干细胞和牛血管细此外,因为它仅仅考虑了图像的灰度信息而不利用图 胞进行了分析实验结果表明经过预处理后的分割像的空间信息,对噪声和灰度不均匀图像比较敏 精度明显高于直接分割的精度 感[,针对这些问题相继出现了双阈值分割法、自适 图1给出了利用相差显微镜成像原理对细胞图应阈值分割法、多尺度阈值法、基于过渡区的方法以 像进行预处理之后的结果图,从图1b)中可以看出及结合局部灰度和形状信息的阈值方法等[1 实际细胞形状与从原图像观察到的细胞形状是有 2.2基于边缘检测的细胞分割方法 定差别的 基于边缘检测的细胞分割方法是通过检测相邻 这也表明如果希望通过观察显微图像中的细胞像素灰度值的突变性来获得不同区域之间的边缘 形状信息进行辅助诊断或治疗,根据其成像原理对通常利用局部微分算子对图像中灰度的变化进行检 图像进行预处理是十分必要的 测.常见的边缘检测算子有 Roberts算子、 Prewitt
展望. 1 显微细胞图像预处理 图像预处理是对质量不高的原始图像进行增强 和复原的处理手段,以便提取有用信息.在显微细 胞图像的获取过程中,通常会因成像设备、光学系统 等存在噪声及干扰使得图像模糊,难以获得细胞边 缘等特征信息.所以预先对显微细胞图像进行去除 噪声和增强细节等处理,是整个细胞图像处理流程 中的关键.常见的预处理方法有平滑滤波、数学形 态学滤波、多分辨率小波变换、多光谱波段处理等算 法,这些算法都是将显微细胞图像当作“自然”图像 进行处理,并没有过多考虑显微镜成像原理所引起 的“误差”. 近几 年,美 国 卡 内 基 梅 陇 大 学 TakeoKanade 教授 所 在 的 课 题 组 通 过 对 相 差 显 微 镜 (phase contrastmicroscope)成像过程中光学性质的研究发 现[89],从相差显微镜中观察到的细胞并不是其真 实大小.他们通过计算得到了光学显微镜成像的数 学模型,提出一种通过还原显微镜成像原理对细胞 显微图像进行预处理的方法,并利用其对相差显微 图像进行了修复.根据成像过程的光学路径,相差 显微成像过程可定义为一个线性模型g=Hf,其中 g为观察得到的图像(显微镜成像),f 为经过修复 后的图像(重构图像).通过求取此模型的二次最优 约束方程的近似解即可得到修复后的图像,其约束 方程为 O(f)= Hf-g 2 2 +wsf TLf+wr Λf p p. (1) 式中:L 为相邻像素之间相似性的拉普拉斯矩阵,定 义了图像的平滑度;Λ 为稀疏正则化的正对角矩阵, 定义了图像的稀疏度;ws 和 wr 为其相应的权重系 数; · p 为lp 范数. 文献[9]中分别对人体肌肉干细胞和牛血管细 胞进行了分析,实验结果表明经过预处理后的分割 精度明显高于直接分割的精度. 图1给出了利用相差显微镜成像原理对细胞图 像进行预处理之后的结果图,从图1(b)中可以看出 实际细胞形状与从原图像观察到的细胞形状是有一 定差别的. 这也表明如果希望通过观察显微图像中的细胞 形状信息进行辅助诊断或治疗,根据其成像原理对 图像进行预处理是十分必要的. 图1 利用相差显微镜成像原理的线性模型对细胞图像预处理示 意图[8] Fig.1 Schematicdiagram ofcellimagepreprocessingbasedon thelinear modelusingtheopticalpropertiesofphase contrastmicroscopes 2 显微细胞图像分割方法 细胞分割是根据彩色、灰度、几何形状、位置信 息等特征把细胞图像划分成若干个互不相交的区 域,使得这些特征在同一个区域中表现出一致性或 相似性,而在不同区域间表现出明显的不同.作为 医学图像处理中最为基础和重要的领域之一,细胞 分割是对细胞图像进行识别、计数、跟踪、形态分析 的基本前提,是进行细胞信息提取、分析与定量研究 的关键,直接关系到诊断的可靠性,同时也是医学图 像处理领域的一个经典难题. 2.1 基于阈值的细胞分割方法 基于阈值的细胞分割方法主要是根据细胞图像 的灰度直方图,通过设置阈值把像素点按灰度级分 为内部点集和外部点集,从而实现细胞的分割.对 于经过预处理得到的清晰细胞图像,可以通过以下 阈值分割公式定义出多个区域. g(x,y)= Ii Ti-1 ≤f(x,y)≤Ti {0 其他 . (2) 式中:f(x,y)为原图像灰度值;g(x,y)为根据阈值 Ti-1和Ti 所定义的第i个分割的区域的灰度值. 阈值分割方法的优势在于计算量小、性能稳定, 适用于目标和背景的灰度范围差别较大的细胞图像. 此外,因为它仅仅考虑了图像的灰度信息而不利用图 像的空 间 信 息,对 噪 声 和 灰 度 不 均 匀 图 像 比 较 敏 感[10].针对这些问题相继出现了双阈值分割法、自适 应阈值分割法、多尺度阈值法、基于过渡区的方法以 及结合局部灰度和形状信息的阈值方法等[1114]. 2.2 基于边缘检测的细胞分割方法 基于边缘检测的细胞分割方法是通过检测相邻 像素灰度值的突变性来获得不同区域之间的边缘. 通常利用局部微分算子对图像中灰度的变化进行检 测.常见的边缘检测算子有 Roberts算子、Prewitt 442 北 京 理 工 大 学 学 报 第 34 卷
第5期 刘志文等:显微细胞图像分析方法的研究进展 443 算子、 Sobel算子、 Canny算子、 Laplacian算子等.对已检测的边缘点进行后续的跟踪、连接,从而勾勒 边缘检测算子能够利用微分特性获得灰度变化信出有实际意义的细胞边界 息,快速准确地找到边缘,但对噪声较为敏感,容易 图2给出了利用几种边缘检测算法对淋巴细胞 受到伪轮廓或边界空白的干扰.并且,边缘检测算进行分割的结果图,其中,视野中心的细胞为淋巴细 子获取的边缘信息往往会因为这些信息不够突出而胞,周围细胞是红细胞 产生间隙,不能形成包围细胞的封闭曲线,这就需要 a)原始图像 roberts算子 (d)Sole算子 Canny算子 Laplacian算子 图2基于不同边缘检测算子的淋巴细胞分割示意图 Fig 2 Lymphocyte segmentation based on several edge detection operators 2.3基于区域的细胞分割方法 性力及外部图像力、各种驱动力的作用下,曲线逐渐 基于区域的细胞分割方法是指连接具有相同或逼近目标的轮廓,当内部力和外部力达到平衡时曲 相似性质的邻近像素点而得到细胞分割图像的方线停止移动,最终分割、跟踪出目标.该曲线在图像 法.这类方法的优势在于利用了空间信息和像素间中移动主要是通过迭代来极小化能量函数完成 的关联,但是,通常需要一定的先验知识,如种子信 TEn (c(s))+E(c(s))ds. (3) 息.常见的基于区域的分割方法包括区域生长、区 域分裂和合并分割算法 式中:c(s)为参数化曲线,c(s)=[x(s),y(s)],s∈ 2.4基于活动轮廓的细胞分割方法 [0,1];Em为内部力,表示活动轮廓本身的能量,它 基于活动轮廓模型的细胞分割方法主要包括的作用是使轮廓曲线伸缩、弯曲;Eax表示由目标图 Spake3、 Level setl等一系列综合利用区域与边像的性质而产生的外部力量,使得轮廓曲线向着目 界信息,将图像数据、初始轮廓的选取、目标轮廓特标移动;Em由曲线的一阶导数和二阶导数组成,其 征以及知识的约束条件都集成在一个特征提取过程形式如下 中的方法.活动轮廓模型的方法综合利用了区域与 Ei(c(s)=(a(s)|c(s)|2+ 边界信息,从图像数据中获得约束信息和目标的位 置、大小和形状等先验知识,可以有效地对细胞这样 B(s)|c(s)|2),s∈[0,1] (4) 不规则的非刚体目标进行分割 式中:c(s)表示轮廓曲线长度的变化率,用于控制 Snake模型,又称为主动轮廓模型,由Kass于轮廓曲线的连续性;系数a称为弹力系数;二阶项 1988年提出,主要用于非刚体目标的分割及跟c(s)表示轮廓曲线曲率的变化率,用于控制曲线的 踪[.它是一条可移动的曲线,在内部弹性力、刚弯曲程度,可以使得轮廓在运动过程中保持光滑性
算子、Sobel算 子、Canny 算 子、Laplacian 算 子 等. 边缘检测算子能够利用微分特性获得灰度变化信 息,快速准确地找到边缘,但对噪声较为敏感,容易 受到伪轮廓或边界空白的干扰.并且,边缘检测算 子获取的边缘信息往往会因为这些信息不够突出而 产生间隙,不能形成包围细胞的封闭曲线,这就需要 对已检测的边缘点进行后续的跟踪、连接,从而勾勒 出有实际意义的细胞边界. 图2给出了利用几种边缘检测算法对淋巴细胞 进行分割的结果图,其中,视野中心的细胞为淋巴细 胞,周围细胞是红细胞. 图2 基于不同边缘检测算子的淋巴细胞分割示意图 Fig.2 Lymphocytesegmentationbasedonseveraledgedetectionoperators 2.3 基于区域的细胞分割方法 基于区域的细胞分割方法是指连接具有相同或 相似性质的邻近像素点而得到细胞分割图像的方 法.这类方法的优势在于利用了空间信息和像素间 的关联,但是,通常需要一定的先验知识,如种子信 息.常见的基于区域的分割方法包括区域生长、区 域分裂和合并分割算法. 2.4 基于活动轮廓的细胞分割方法 基于活动轮廓模型的细胞分割方法主要包括 Snake [15]、LevelSet [16]等一系列综合利用区域与边 界信息,将图像数据、初始轮廓的选取、目标轮廓特 征以及知识的约束条件都集成在一个特征提取过程 中的方法.活动轮廓模型的方法综合利用了区域与 边界信息,从图像数据中获得约束信息和目标的位 置、大小和形状等先验知识,可以有效地对细胞这样 不规则的非刚体目标进行分割. Snake模型,又称为主动轮廓模型,由 Kass于 1988 年 提 出,主 要 用 于 非 刚 体 目 标 的 分 割 及 跟 踪[15].它是一条可移动的曲线,在内部弹性力、刚 性力及外部图像力、各种驱动力的作用下,曲线逐渐 逼近目标的轮廓,当内部力和外部力达到平衡时曲 线停止移动,最终分割、跟踪出目标.该曲线在图像 中移动主要是通过迭代来极小化能量函数完成, Esnake =∫ 1 0 [Eint(c(s))+Eext(c(s))]ds. (3) 式中:c(s)为参数化曲线,c(s)=[x(s),y(s)],s∈ [0,1];Eint为内部力,表示活动轮廓本身的能量,它 的作用是使轮廓曲线伸缩、弯曲;Eext表示由目标图 像的性质而产生的外部力量,使得轮廓曲线向着目 标移动;Eint由曲线的一阶导数和二阶导数组成,其 形式如下: Eint(c(s))= 1 2 (α(s)|c′ (s)|2+ β(s)|c″ (s)|2),s∈[0,1]. (4) 式中:c′ (s)表示轮廓曲线长度的变化率,用于控制 轮廓曲线的连续性;系数α 称为弹力系数;二阶项 c″ (s)表示轮廓曲线曲率的变化率,用于控制曲线的 弯曲程度,可以使得轮廓在运动过程中保持光滑性, 第5期 刘志文等:显微细胞图像分析方法的研究进展 443
444 北京理工大学学报 第34卷 并且长度不发生变化;系数β称为强度系数.如果 为了降低能量最小化过程的复杂度,将分水岭 能够恰当地调整弹力系数和强度系数,则轮廓曲线变换应用其中,对于骨髓图像中白细胞的分割具有 在形变过程中可以很好地保持其连续性与光滑性.较好的效果.法国巴斯特研究所的 Zimmer提出 正是基于上述优点,众多学者十分关注此算法使用参数化主动轮廓模型对细胞进行分割 并将其应用于细胞分割、跟踪领域.Meas- Yedid Thevenaz[201提出一种称之为 Snakuscule的算法 提出应用改进的 Snake模型,即 Gradient vector该算法以节省 Snake的运算时间从而提高效率为目 Field Snake(GVF- Snake),来扩大 Snake的边界搜的,通过利用两个控制点而不是传统算法中的曲线 索范围,使细胞轮廓可以形变到理想的位置.来实现分割.但是,主动轮廓模型算法最大的缺陷 Jaesang Park给出一种新的目标边界提取的方在于需要经过大量的迭代运算,因此运算量大、耗时 法—— Watersnake,算法基于 Snake,其中能量函数长;同时不适用于细胞跟踪中会发生拓扑变化的目 的最小化通过动态规划算法实现,因为能够搜索整标(如细胞分裂) 个区域的能量场,所以鲁棒性更强 a)初始轮廓 (b)迭代过程 (e)分割结果 图3基于 Snake模型的淋巴细胞分割示意图 Fig 3 Lymphocyte segmentation based on Snake model 2.5基于特定理论的细胞分割方法 max{k∈[0,N-1]1p∈Pr,(n(T(D) 基于特定理论的细胞分割方法主要包括基于数 (5) 学形态学的分割方法、基于小波变换的方法、基于神式中:p()为用标记图像J对掩模图像r的二值形 经网络的分割方法等。其中,数学形态学理论以其态重构;T()表示对灰度图像以阈值k进行二值化 运算简单、效率高、且数学理论严格而具有广泛应得到的图像 用.它以图像的形态特征作为研究对象,主要内容 Kenong Wu等2提出一种结合变异数图像、阈 是设计一整套概念、变换和算法用以描述图像的基值分割等处理方法先求出细胞初始轮廓,然后再结合 本特征和基本结构,即描述一副图像中元素与元素、数学形态学图像处理方法判断图像特征对细胞显微 部分与部分之间的关系.数学形态学处理可以简化图像中单一细胞进行分割. Anoraganingrum wil2 图像数据并保持它们的基本形状特征,并除去不相提出利用简单的中值滤波结合数学形态学图像处理 干的结构.图像的膨胀、腐蚀、开运算、闭运算是数方法找出细胞边界.清华大学的康维等21提出分水 学形态学中基本的操作,形态学灰度重构算法是其岭结合形态学滤波的细胞分割方法,先利用k均值聚 中较为复杂的元素,也是其中的代表作 类和直方图上的分水岭变换对像素进行聚类,得到细 灰度图像形态重构的定义如下:设J和I是同胞图像背景、细胞质和细胞核的粗略估计,然后利用 定义域D1上的两个灰度图像,取值范围为离散形态学滤波和分水岭变换提取细胞核、细胞质的边 集合10,1,…N-1},且J≤I(即,对于每一个像素界,重点解决邻接或者重叠的细胞核或者细胞质之间 p∈D1,J(p)≤I(p),则用J(标记图像 marker)对的分割问题. Chuangfeng lu等【2利用数学形态学灰 I(掩膜图像mask)的灰度图像形态重构可由式(5)度重构的方法对细胞视频图像进行预处理,然后基于 给出[21: 灰度直方图进行阈值分割,从而提取淋巴细胞.图 vp∈D1,p1()(p)= 4给出了基于此方法的分割过程示意图
并且长度不发生变化;系数β称为强度系数.如果 能够恰当地调整弹力系数和强度系数,则轮廓曲线 在形变过程中可以很好地保持其连续性与光滑性. 正是基于上述优点,众多学者十分关注此算法 并将其应用于细胞分割、跟踪领域.Meas-Yedid [17] 提出应 用 改 进 的 Snake模 型,即 GradientVector FieldSnake(GVF-Snake),来扩大 Snake的边界搜 索 范 围,使 细 胞 轮 廓 可 以 形 变 到 理 想 的 位 置. JaesangPark [18]给出一种新的目标边界提 取 的 方 法———Watersnake,算法基于 Snake,其中能量函数 的最小化通过动态规划算法实现,因为能够搜索整 个区域的能量场,所以鲁棒性更强. 为了降低能量最小化过程的复杂度,将分水岭 变换应用其中,对于骨髓图像中白细胞的分割具有 较好的效果.法国巴斯特研究所的 Zimmer [19]提出 使用 参 数 化 主 动 轮 廓 模 型 对 细 胞 进 行 分 割. Thevenaz [20]提出一种称之为 Snakuscule的算法, 该算法以节省Snake的运算时间从而提高效率为目 的,通过利用两个控制点而不是传统算法中的曲线 来实现分割.但是,主动轮廓模型算法最大的缺陷 在于需要经过大量的迭代运算,因此运算量大、耗时 长;同时不适用于细胞跟踪中会发生拓扑变化的目 标(如细胞分裂). 图3 基于Snake模型的淋巴细胞分割示意图 Fig.3 LymphocytesegmentationbasedonSnakemodel 2.5 基于特定理论的细胞分割方法 基于特定理论的细胞分割方法主要包括基于数 学形态学的分割方法、基于小波变换的方法、基于神 经网络的分割方法等.其中,数学形态学理论以其 运算简单、效率高、且数学理论严格而具有广泛应 用.它以图像的形态特征作为研究对象,主要内容 是设计一整套概念、变换和算法用以描述图像的基 本特征和基本结构,即描述一副图像中元素与元素、 部分与部分之间的关系.数学形态学处理可以简化 图像数据并保持它们的基本形状特征,并除去不相 干的结构.图像的膨胀、腐蚀、开运算、闭运算是数 学形态学中基本的操作,形态学灰度重构算法是其 中较为复杂的元素,也是其中的代表作. 灰度图像形态重构的定义如下:设J 和I 是同 一定义域DI 上的两个灰度图像,取值范围为离散 集合{0,1,…,N-1},且J≤I(即,对于每一个像素 p∈DI,J(p)≤I(p)),则用J(标记图像 marker)对 I(掩膜图像 mask)的灰度图像形态重构可由式(5) 给出[21]: ∀p ∈DI,ρI(J)(p)= max{k∈ [0,N -1]|p ∈ρTk (I)(Tk(J))}. (5) 式中:ρI(J)为用标记图像J 对掩模图像I 的二值形 态重构;Tk()表示对灰度图像以阈值k进行二值化 得到的图像. KenongWu等[22]提出一种结合变异数图像、阈 值分割等处理方法先求出细胞初始轮廓,然后再结合 数学形态学图像处理方法判断图像特征对细胞显微 图像中单一细胞进行分割.Anoraganingrum Dwi [23] 提出利用简单的中值滤波结合数学形态学图像处理 方法找出细胞边界.清华大学的康维等[24]提出分水 岭结合形态学滤波的细胞分割方法,先利用k均值聚 类和直方图上的分水岭变换对像素进行聚类,得到细 胞图像背景、细胞质和细胞核的粗略估计,然后利用 形态学滤波和分水岭变换提取细胞核、细胞质的边 界,重点解决邻接或者重叠的细胞核或者细胞质之间 的分割问题.ChuangfengLü等[25]利用数学形态学灰 度重构的方法对细胞视频图像进行预处理,然后基于 灰度直方图进行阈值分割,从而提取淋巴细胞.图 4给出了基于此方法的分割过程示意图. 444 北 京 理 工 大 学 学 报 第 34 卷
第5期 刘志文等:显微细胞图像分析方法的研究进展 原始图像 b)灰度重构 (c)二值化分割 (e)分割结果 图4基于数学形态学灰度重构淋巴细胞分割示意图 Fig. 4 Lymphocyte segmentation based on morphological gray-scale reconstruction 3细胞图像序列分析方法 文献[36-41]对活动轮廓模型方法做了一系列 改进:在能量函数中加入形状和尺寸限制、加入 对显微细胞图像进行分割之后,通常会进行细血流方向信息、采用VFC( vector field 胞计数细胞识别与分类、细胞形态学参数的度量等 convolution)外力场;还采用了水平集方法[吗、梯 相关研究,这些基于静态细胞图像的研究是早期细度倒系数方差方法、仿射变换不变性方法对 胞图像处理领域的研究重点.然而,活细胞中白细胞进行分割和跟踪研究.此外,文献[42]还针 蕴含着生命体大量的信息,细胞的动态特性尤其是对图像序列中细胞的跟踪问题, 形态变化在机体的病理、生理过程中,如免疫反应 将其转化为逐帧分割每幅图像:首先使用边界 伤口愈合、癌细胞扩散转移等,更能反映机体的健康方向敏感的非线性滤波器进行检测,然后利用 状况匚.因此,定量分析细胞的形变、能动性、运GVF-Sake进行逐帧分割从而实现跟踪.文献[43] 动性对于了解生物体最基本的生物、生理现象具有提出一种移动视野中细胞跟踪的算法,主要是形态 更为重要的意义.这也是越来越多的研究者将关注学图像处理的方法进行背景的提取,然后利用主动 点投向了细胞图像序列分析中的主要原因 轮廓方法进行细胞的跟踪,能够寻找视野抖动时的 3.1细胞跟踪方法 细胞 目标跟踪算法一直是计算机视觉领域的重要研 Level set算法能够有效分辨出细胞分裂时的 究方向,主要包括基于相关( correlation based)的跟拓扑变化,即同时分析多个细胞目标,也常用于细胞 踪方法、基于特征( feature based)的跟踪方法、基于跟踪领域.文献[44]中在获得荧光标记的细胞模糊 模型的跟踪方法(活动轮廓模型、 mean shift模型、边界之后,利用水平集方法实现全自动的初始化,并 光流算法、差分跟踪方法等).前文中也曾提到,在能够检测图像序列中分裂的细胞以及后续进入视野 细胞图像序列分析领域中,活动轮廓模型算法、的细胞 Level set算法一直是大家关注的热点 尽管 Level set算法适用性强,但随着生物图像 活动轮廓模型对于细胞这样的非刚体形变物体采集的多样化,还是存在一些问题,文献[45]针对相 具有良好的适应性.图5给出了应用活动轮廓模型应问题给出了多种基于耦合主动曲面的算法,提高 对视频图像中细胞进行跟踪的结果图. 了算法的鲁棒性及适用性
图4 基于数学形态学灰度重构淋巴细胞分割示意图 Fig.4 Lymphocytesegmentationbasedonmorphologicalgray-scalereconstruction 3 细胞图像序列分析方法 对显微细胞图像进行分割之后,通常会进行细 胞计数、细胞识别与分类、细胞形态学参数的度量等 相关研究,这些基于静态细胞图像的研究是早期细 胞图像处理领域的研究重点[2629].然而,活细胞中 蕴含着生命体大量的信息,细胞的动态特性尤其是 形态变化在机体的病理、生理过程中,如免疫反应、 伤口愈合、癌细胞扩散转移等,更能反映机体的健康 状况[3035].因此,定量分析细胞的形变、能动性、运 动性对于了解生物体最基本的生物、生理现象具有 更为重要的意义.这也是越来越多的研究者将关注 点投向了细胞图像序列分析中的主要原因. 3.1 细胞跟踪方法 目标跟踪算法一直是计算机视觉领域的重要研 究方向,主要包括基于相关(correlationbased)的跟 踪方法、基于特征(featurebased)的跟踪方法、基于 模型的跟踪方法(活动轮廓模型、meanshift模型、 光流算法、差分跟踪方法等).前文中也曾提到,在 细胞 图 像 序 列 分 析 领 域 中,活 动 轮 廓 模 型 算 法、 LevelSet算法一直是大家关注的热点. 活动轮廓模型对于细胞这样的非刚体形变物体 具有良好的适应性.图5给出了应用活动轮廓模型 对视频图像中细胞进行跟踪的结果图. 文献[36 41]对活动轮廓模型方法做了一系列 改进:在能量函数中加入形状和尺寸限制[36]、加入 血 流 方 向 信 息[37]、采 用 VFC (vector field convolution)外力场[38];还采用了水平集方法[39]、梯 度倒系数方差方法[40]、仿射变换不变性方法[41]对 白细胞进行分割和跟踪研究.此外,文献[42]还针 对图像序列中细胞的跟踪问题, 将其转化为逐帧分割每幅图像:首先使用边界 方 向 敏 感 的 非 线 性 滤 波 器 进 行 检 测,然 后 利 用 GVF-Sake进行逐帧分割从而实现跟踪.文献[43] 提出一种移动视野中细胞跟踪的算法,主要是形态 学图像处理的方法进行背景的提取,然后利用主动 轮廓方法进行细胞的跟踪,能够寻找视野抖动时的 细胞. LevelSet算法能够有效分辨出细胞分裂时的 拓扑变化,即同时分析多个细胞目标,也常用于细胞 跟踪领域.文献[44]中在获得荧光标记的细胞模糊 边界之后,利用水平集方法实现全自动的初始化,并 能够检测图像序列中分裂的细胞以及后续进入视野 的细胞. 尽管 LevelSet算法适用性强,但随着生物图像 采集的多样化,还是存在一些问题,文献[45]针对相 应问题给出了多种基于耦合主动曲面的算法,提高 了算法的鲁棒性及适用性. 第5期 刘志文等:显微细胞图像分析方法的研究进展 445
北京理工大学学报 第34卷 (a)I s (b)8 c)16s o666o 图5基于 Snake模型的淋巴细胞视频跟踪结果图 Fig 5 Lymphocyte tracking based on Snake model 细胞形状描述方法 细胞边界的最长弦(称为边界的长轴)是表示边 经过细胞分割、跟踪后,即可得到图像序列中细界的有效特征描述子.细胞边界的短轴定义为与长 胞的边界及区域,在进行形状、形变定量分析之前,轴垂直的最长弦.其中,长轴与短轴的比值叫做边 需要对细胞的形状进行描述.在计算机视觉和图像界线的离心率,也是一个刻画细胞形状的特征 处理领域中,目标的轮廓曲线和区域是研究目标形 离心率在一定程度上描述了目标外形关于中心 状的最直观、常用、有效的方式,同时,这也是人类观对称的程度,它不受平移、旋转和尺度变换的影响 察物体时视觉感受最为重要的两个方面.由此,形但是,它只能粗略描述目标的基本形状和中心的情 状描述通常可分为基于边界的和基于区域的两种方况,并不能精确地区分目标的形状,比如对于正方形 法.这种分类主要是依据形状特征的提取是只与边和圆形这两个截然不同的形状,其离心率均为1 界信息有关还是与整个区域信息有关 ③曲率C 基于边界的形状描述 曲率定义为斜率的变化率.对于用链码表示的 基于边界的方法只考虑形状的边界信息,常见细胞边界,链码实际上是曲线上点的方向矢量,具有 的基于边界的形状描述方法主要包括周长、离心率、位移不变性,而链码上相邻链码之差,反映该点的 曲率、 Hausdorff距离和傅里叶描述子 曲率性质,具有旋转不变性.文献[46]中给出了 ①周长P. 种利用链码单位向量计算曲率的方法.设链码曲线 周长是基于细胞边界的最简单的形状特征,在中第k个点的单位向量为V,则该点的斜率定义为 得到细胞轮廓边界之后,可以从其链码表示中直接L4(x,y)=V+V+V,斜率的方向角为 得到.假设垂直的和水平的步幅为单位长度,在 LE(y) 8连通情况下的对角步幅的长度为√2,于是有 ata LE(x) L(x)|≥|L(y) Lk(y) L(x)|<|L(y) (6) 式中:P为细胞细胞周长值;a1,a2,…,a为细胞的此时,第k点的曲率为 边界链码;dk为每个链码ak表示的线段长度 Ck=10+1-04-1 (8) ②离心率Ec ④ Hausdorf距离
图5 基于Snake模型的淋巴细胞视频跟踪结果图 Fig.5 LymphocytetrackingbasedonSnakemodel 3.2 细胞形状描述方法 经过细胞分割、跟踪后,即可得到图像序列中细 胞的边界及区域.在进行形状、形变定量分析之前, 需要对细胞的形状进行描述.在计算机视觉和图像 处理领域中,目标的轮廓曲线和区域是研究目标形 状的最直观、常用、有效的方式,同时,这也是人类观 察物体时视觉感受最为重要的两个方面.由此,形 状描述通常可分为基于边界的和基于区域的两种方 法.这种分类主要是依据形状特征的提取是只与边 界信息有关还是与整个区域信息有关. 3.2.1 基于边界的形状描述 基于边界的方法只考虑形状的边界信息,常见 的基于边界的形状描述方法主要包括周长、离心率、 曲率、Hausdorff距离和傅里叶描述子. ① 周长P. 周长是基于细胞边界的最简单的形状特征,在 得到细胞轮廓边界之后,可以从其链码表示中直接 得到.假 设 垂 直 的 和 水 平 的 步 幅 为 单 位 长 度,在 8 连通情况下的对角步幅的长度为 2,于是有 P=∑ Q k=1 dk =∑ Q k=1 1+ æ 2-1 è ç ö ø ÷ 2 (1- (-1)ak é ë ê ê ù û ú )ú . (6) 式中:P 为细胞细胞周长值;a1,a2,…,aQ 为细胞的 边界链码;dk 为每个链码ak 表示的线段长度. ② 离心率Ec. 细胞边界的最长弦(称为边界的长轴)是表示边 界的有效特征描述子.细胞边界的短轴定义为与长 轴垂直的最长弦.其中,长轴与短轴的比值叫做边 界线的离心率,也是一个刻画细胞形状的特征. 离心率在一定程度上描述了目标外形关于中心 对称的程度,它不受平移、旋转和尺度变换的影响. 但是,它只能粗略描述目标的基本形状和中心的情 况,并不能精确地区分目标的形状,比如对于正方形 和圆形这两个截然不同的形状,其离心率均为1. ③ 曲率C. 曲率定义为斜率的变化率.对于用链码表示的 细胞边界,链码实际上是曲线上点的方向矢量,具有 位移不变性.而链码上相邻链码之差,反映该点的 曲率性质,具有旋转不变性.文献[46]中给出了一 种利用链码单位向量计算曲率的方法.设链码曲线 中第k个点的单位向量为Vak,则该点的斜率定义为 Lk(x,y)=Vak +Vak+1 +Vak+2 ,斜率的方向角为 θk = atan Lk(y) Lk(x æ è ç ö ø ÷ ) |Lk(x)|≥|Lk(y)| π-atan Lk(y) Lk(x æ è ç ö ø ÷ ) |Lk(x)|<|Lk(y) ì î í ï ï ï ï | . (7) 此时,第k点的曲率为 Ck =|θk+1 -θk-1|. (8) ④ Hausdorff距离. 446 北 京 理 工 大 学 学 报 第 34 卷
第5期 刘志文等:显微细胞图像分析方法的研究进展 447 Hausdorf距离是描述两组点集之间相似程度 归一化的FD具有平移、尺度和旋转不变性,可 (最大距离)的一种度量,常用于图形相似度的测量用来测量形状的相似度.传统FD方法仅用来描述 和形状匹配[7].对于两个用序列表达的形状A=闭合曲线,后被用于描述局部形状051.经过多年 an]和B=[b1b2…b],AB间的发展,引入了仿射不变FD描述仿射形状[、傅 的 Hausdorf距离定义为 里叶不变量描述旋转对称形状[等. H(A,B)=max(h(A,B),h(B,A)).(9)3.2.2基于区域的形状描述 h(A, B)=max min a-b (10) 基于边界的方法有一定的局限性,比如对噪声 式中·‖为点A、B的距离范数,一般为欧氏距离 和变化敏感,形状边界有时难以获得等,且在一些应 但这种距离度量方法对噪声和异常值过于敏感.所用中形状内部信息比边界信息更重要.而基于区域 以一种改良的 Hausdorff距离由 Rucklidge的方法将区域内所有像素点都用于表达形状,具有 提出 更好的鲁棒性和准确性 h(A,B)= fuhe min a-b‖ (11) 常见的基于细胞区域的形状描述方法主要有面 积、高度、宽度、圆形度、矩形度、伸长度、矩描述子 其中,f出xg(x)表示相对于g(x)(x∈X),f的分 网格法等 位值,通常f的值为1/2. Hausdorf距离在形状匹 ①面积S 配方面有很好的应用,但是不具有平移、尺度和旋转 面积是基于区域形态参数中较为简单的 不变性 不同的区域表示法给出的区域可以有不同的计算区 ⑤傅里叶描述子( Fourier descriptor,FD) 域面积的方法.针对分割后具有灰度一致性的区 傅里叶描述子是形状描述中被广泛应用的方域,可以统计这一灰度值的像素个数作为区域的 法,该方法将傅里叶变换理论应用到形状描述中,是面积 对目标形状边界的频率分析.其基本思想是:假设 ②高度H和宽度W 形状边界为一条闭合的曲线,对于该曲线上的某个 针对分割得到的细胞二值图像∫(i,j),定义其 动点的坐标变化可以看成是以该边界曲线的周长为水平的和垂直的区域投影p()和B、()为 周期的函数,此函数可以展成傅里叶级数.这些傅 p(i)=∑∫(,),p.(i)=∑∫(i,j).(15) 里叶级数的系数与形状边界信息直接相关,即为描 述边界形状的描述子.当描述物体轮廓上所有点的 由此可定义细胞的宽度为其水平投影p(i)的 坐标被表征为傅里叶系数时,其低频部分为形状的最大值,高度为其垂直投影p(i)的最大值 整体部分,高频部分为形状的细节部分. ③圆形度C 设目标边界表示为坐标序列z(n)=[x(n) C=4TS (16) y(n)],n=0,1,…,N-1.每一对坐标可表示为 对于圆形区域来说,圆形度会达到最大值1,随 复数 着区域形状与圆的差别越来越大,圆形度会越来越 (n)=x(n)+jy(n). (12) 小.对细胞来说,圆形度在某种程度上反映了细胞 它将二维的坐标点简化成了一维序列,z(n)的离散的光滑度或规则度 傅里叶变换( discrete fourier transform,DFT)形 ④矩形度R0 式为 (17) m)e-2h(N,k=0,1,…,N-1. 对于一个矩形区域来说,矩形度的值为1.而对 于圆形细胞而言,矩形度值为π/4. (13) ⑤伸长度EA 这些系数a(k)即称之为目标边界的傅里叶描述 通过对它们反变换,即可求取原边界z(n) E,=min(Ho, w) (18) ⑥矩描述子和通用傅里叶描述子 a(k)emb/N 前文介绍的面积、圆形度、伸长度等参数通常只 (14)能区分不同形状之间较大的差异,所以一般不能用
Hausdorff距离是描述两组点集之间相似程度 (最大距离)的一种度量,常用于图形相似度的测量 和形状匹配[4749].对于两个用序列表达的形状A= [a1 a2 … ap]和B=[b1 b2 … bp],AB 间 的 Hausdorff距离定义为 H(A,B)=max(h(A,B),h(B,A)). (9) h(A,B)=maxa∈A minb∈B a-b . (10) 式中 · 为点A、B 的距离范数,一般为欧氏距离. 但这种距离度量方法对噪声和异常值过于敏感.所 以 一 种 改 良 的 Hausdorff 距 离 由 Rucklidge [49] 提出: hf (A,B)=f th a∈A minb∈B a-b . (11) 其中,f th x∈Xg(x)表示相对于g(x)(x∈X),f th的分 位值,通常f 的值为1/2.Hausdorff距离在形状匹 配方面有很好的应用,但是不具有平移、尺度和旋转 不变性. ⑤ 傅里叶描述子(Fourierdescriptor,FD). 傅里叶描述子是形状描述中被广泛应用的方 法,该方法将傅里叶变换理论应用到形状描述中,是 对目标形状边界的频率分析.其基本思想是:假设 形状边界为一条闭合的曲线,对于该曲线上的某个 动点的坐标变化可以看成是以该边界曲线的周长为 周期的函数,此函数可以展成傅里叶级数.这些傅 里叶级数的系数与形状边界信息直接相关,即为描 述边界形状的描述子.当描述物体轮廓上所有点的 坐标被表征为傅里叶系数时,其低频部分为形状的 整体部分,高频部分为形状的细节部分. 设目标边 界 表 示 为 坐 标 序 列z(n)= [x(n), y(n)],n=0,1,…,N -1.每 一 对 坐 标 可 表 示 为 复数 z(n)=x(n)+jy(n). (12) 它将二维的坐标点简化成了一维序列,z(n)的离散 傅里 叶 变 换 (discretefouriertransform,DFT)形 式为 a(k)= 1 N∑ N-1 n=0 z(n)e-j2πkn/N , k=0,1,…,N -1. (13) 这些系数a(k)即称之为目标边界的傅里叶描述子. 通过对它们反变换,即可求取原边界z(n). z(n)=∑ N-1 k=0 a(k)ej2πkn/N , n=0,1,…,N -1. (14) 归一化的 FD 具有平移、尺度和旋转不变性,可 用来测量形状的相似度.传统 FD 方法仅用来描述 闭合曲线,后被用于描述局部形状[5051].经过多年 的发展,引入了仿射不变 FD描述仿射形状[5253]、傅 里叶不变量描述旋转对称形状[54]等. 3.2.2 基于区域的形状描述 基于边界的方法有一定的局限性,比如对噪声 和变化敏感,形状边界有时难以获得等,且在一些应 用中形状内部信息比边界信息更重要.而基于区域 的方法将区域内所有像素点都用于表达形状,具有 更好的鲁棒性和准确性. 常见的基于细胞区域的形状描述方法主要有面 积、高度、宽度、圆形度、矩形度、伸长度、矩描述子、 网格法等. ① 面积S. 面积是基于区域形态参数中较为简单的一个. 不同的区域表示法给出的区域可以有不同的计算区 域面积的方法.针对分割后具有灰度一致性的区 域,可以统 计 这 一 灰 度 值 的 像 素 个 数 作 为 区 域 的 面积. ② 高度 H0 和宽度W . 针对分割得到的细胞二值图像f(i,j),定义其 水平的和垂直的区域投影ph(i)和pv(i)为 ph(i)=∑ j f(i,j), pv(i)=∑i f(i,j).(15) 由此可定义细胞的宽度为其水平投影ph(i)的 最大值,高度为其垂直投影pv(i)的最大值. ③ 圆形度Ci. Ci =4πS/P2. (16) 对于圆形区域来说,圆形度会达到最大值 1,随 着区域形状与圆的差别越来越大,圆形度会越来越 小.对细胞来说,圆形度在某种程度上反映了细胞 的光滑度或规则度. ④ 矩形度R0. R0 = S H0W . (17) 对于一个矩形区域来说,矩形度的值为1.而对 于圆形细胞而言,矩形度值为π/4. ⑤ 伸长度El. El = min(H0,W) max(H0,W). (18) ⑥ 矩描述子和通用傅里叶描述子. 前文介绍的面积、圆形度、伸长度等参数通常只 能区分不同形状之间较大的差异,所以一般不能用 第5期 刘志文等:显微细胞图像分析方法的研究进展 447
448 北京理工大学学报 第34卷 作单独的参数来进行复杂的形状描述.可用简单参3.3细胞形变分析 数来进行图形的筛选,再结合其他的形状描述方法 目前,国内外有关细胞分割、跟踪方面的文献较 常用的有矩描述法和通用傅里叶 多,而对其形状、运动特性及能动性方面的研究相对 矩描述法易于计算、匹配,且具有良好的鲁棒较少,也有一些针对细胞形变特性进行定量分析的 性.几何不变矩[3具有良好的平移、尺度和旋转研究.其中,针对细胞形态变化进行分析的研究,主 不变性,可用低阶矩来描述简单形状,但对于复杂形要是对细胞的形态学参数进行时间轴上的统计分 状的描述效果不是很好.代数不变矩5可以用来析.形态特征参数的提取对细胞形态分析具有重要 构造任意矩,对像素分布的描述效果较好,但不能很的意义,参数的定量计算提高了统计分析结果的准 好地描述形状边界.正交矩包括 Legendre矩和确性、客观性前文介绍的形态参数常应用于静态 Zernike矩,其中 Zernike矩描述子n具有较好的图像的分类中,也可以应用于细胞形态变化的分析 鲁棒性,计算时须使目标图像的重心为坐标原点将文献[64-65中通过显微镜及摄像设备对细胞培养 图像像素映射到单位圆内.定义为 皿中的细胞进行观察并录制视频图像,然后利用图 像处理系统进行分割、跟踪,并分析面积、周长、圆形 ∑∑vn(x,y)∫( 度、矩形度等变化情况,从而绘制各参数随时间变化 (19)的曲线.文献[66]中研究了基于仿射变换的二维细 其中Vm(x,y)=Vm(p,0)=Rm(p)exp(jm0), 胞图像形变和运动变化的时空分析,利用 Optical flw及 Multi- resolution estimation来估计细胞序 Rn(p)=∑(-1)× 列图像中的 Affine形变参数,之后计算由该参数组 成矩阵的特征值,并根据特征值的不同将细胞形变 (+m⊥,(=m_, 运动分为4类.文献[34中对视频图像中的淋巴细 胞进行分割,提取10个形态学参数,如面积、周长 (20)等,然后计算相邻帧之间的对应参数的差值,从而进 p和θ分别是像素点(x,y)相对于形状重心的行不同视频中淋巴细胞形态变化的比较.文献[67 半径和角度,虽然 Zernike矩有很好的效果,但仍存中提出一种定量描述细胞形态变化的参数,该方法 在一些缺点.例如核函数计算复杂;计算时必须将主要对细胞的轮廓边界进行分析,通过求取细胞边 图形归一化到单位圆;获得的径向特征和切向特征界上的点到细胞质心的距离,并对整个细胞图像序 不一致,一个在空间域另一个在频域;各阶的圆频谱列中所有径向距离进行均值、方差的计算,从而定量 特征不是均匀获得的,会丢失一些用于描述形状的刻画视频中单个细胞形状变化的大小.文献[2]中 重要特征等[62 提出一种基于弹性曲线的细胞动态形变的建模方 为了克服 Zernike矩的缺点, Zhang和Lu提法,首先将分割之后细胞边界表示为平移、旋转、尺 出了通用傅里叶描述子( generic Fourier度不变的形式,然后将其映射至切向量形状空间求 descriptor,GFD).GFD通过对在极坐标下展开的取不同细胞形状间的测地线距离,最后通过动态时 样本图像做2D傅里叶变换获得: 间规整算法对不同细胞图像序列进行匹配进而分析 F2(p,中)= 细胞图像序列中细胞的形状变化 ∑∑∫(r,) expli2x(p (21)4细胞分类方法 其中:0≤r<R,0=i(2x/T)(0≤<T);0≤p<R, 根据提取的参数对细胞形态特征进行分类,可 0≤<T;R和T分别是径频率分辨率和角频率分以更好地进行形态分析、分级和模式识别.一般地 辨率.GFD为归一化的系数,两个形状间的相似性分类算法可分为无监督( unsupervised)分类和有监 是根据它们GFD间的街区距离衡量的.相比于督( supervised)分类 Zernike矩,GFD更易于计算,特征全部是频谱特4.1无监督分类 征,且在半径和切向量方向上的多分辨率分析有更 无监督分类是没有训练学习过程的分类,如k 好的重构效果 means算法和 Spectral Clustering(谱聚类)算法.k-
作单独的参数来进行复杂的形状描述.可用简单参 数来进行图形的筛选,再结合其他的形状描述方法, 常用的有矩描述法和通用傅里叶. 矩描述法易于计算、匹配,且具有良好的鲁棒 性.几何不变矩[5556]具有良好的平移、尺度和旋转 不变性,可用低阶矩来描述简单形状,但对于复杂形 状的描述效果不是很好.代数不变矩[5758]可以用来 构造任意矩,对像素分布的描述效果较好,但不能很 好地描述形状边界.正交矩[59]包括 Legendre矩和 Zernike矩,其中Zernike矩描述子[6061]具有较好的 鲁棒性,计算时须使目标图像的重心为坐标原点,将 图像像素映射到单位圆内.定义为 Anm = n+1 π ∑x ∑y V* nm (x,y)f(x,y), x2 +y 2 ≤1. (19) 其中Vnm (x,y)=Vnm (ρ,θ)=Rnm (ρ)exp(jmθ), Rnm (ρ)= ∑ n-|m| 2 s=0 (-1)s × (n-s)! s! n+|m| 2 - æ è ç ö ø s÷ ! n-|m| 2 - æ è ç ö ø s÷ ! ρ n-2s. (20) ρ和θ分别是像素点(x,y)相对于形状重心的 半径和角度.虽然Zernike矩有很好的效果,但仍存 在一些缺点.例如核函数计算复杂;计算时必须将 图形归一化到单位圆;获得的径向特征和切向特征 不一致,一个在空间域另一个在频域;各阶的圆频谱 特征不是均匀获得的,会丢失一些用于描述形状的 重要特征等[62]. 为了克服Zernike矩的缺点,Zhang和 Lu [63]提 出 了 通 用 傅 里 叶 描 述 子 (generic Fourier descriptor,GFD).GFD 通过对在极坐标下展开的 样本图像做2D傅里叶变换获得: PF2(ρ,ϕ)= ∑r ∑i f(r,θi)expj2π r Rρ+ 2πi T æ è ç ö ø ÷ é ë êê ù û ú ϕ ú . (21) 其中:0≤r<R,θi=i(2π/T)(0≤i<T);0≤ρ<R, 0≤ϕ<T;R 和T 分别是径频率分辨率和角频率分 辨率.GFD为归一化的系数,两个形状间的相似性 是根 据 它 们 GFD 间 的 街 区 距 离 衡 量 的.相 比 于 Zernike矩,GFD 更 易 于 计 算,特 征 全 部 是 频 谱 特 征,且在半径和切向量方向上的多分辨率分析有更 好的重构效果. 3.3 细胞形变分析 目前,国内外有关细胞分割、跟踪方面的文献较 多,而对其形状、运动特性及能动性方面的研究相对 较少,也有一些针对细胞形变特性进行定量分析的 研究.其中,针对细胞形态变化进行分析的研究,主 要是对细胞的形态学参数进行时间轴上的统计分 析.形态特征参数的提取对细胞形态分析具有重要 的意义,参数的定量计算提高了统计分析结果的准 确性、客观性.前文介绍的形态参数常应用于静态 图像的分类中,也可以应用于细胞形态变化的分析. 文献[64 65]中通过显微镜及摄像设备对细胞培养 皿中的细胞进行观察并录制视频图像,然后利用图 像处理系统进行分割、跟踪,并分析面积、周长、圆形 度、矩形度等变化情况,从而绘制各参数随时间变化 的曲线.文献[66]中研究了基于仿射变换的二维细 胞图像形变和运动变化的时空分析,利用 Optical flow 及 Multi-resolutionEstimation来估计细胞序 列图像中的 Affine形变参数,之后计算由该参数组 成矩阵的特征值,并根据特征值的不同将细胞形变 运动分为4类.文献[34]中对视频图像中的淋巴细 胞进行分割,提取10个形态学参数,如面积、周长 等,然后计算相邻帧之间的对应参数的差值,从而进 行不同视频中淋巴细胞形态变化的比较.文献[67] 中提出一种定量描述细胞形态变化的参数,该方法 主要对细胞的轮廓边界进行分析,通过求取细胞边 界上的点到细胞质心的距离,并对整个细胞图像序 列中所有径向距离进行均值、方差的计算,从而定量 刻画视频中单个细胞形状变化的大小.文献[2]中 提出一种基于弹性曲线的细胞动态形变的建模方 法,首先将分割之后细胞边界表示为平移、旋转、尺 度不变的形式,然后将其映射至切向量形状空间求 取不同细胞形状间的测地线距离,最后通过动态时 间规整算法对不同细胞图像序列进行匹配进而分析 细胞图像序列中细胞的形状变化. 4 细胞分类方法 根据提取的参数对细胞形态特征进行分类,可 以更好地进行形态分析、分级和模式识别.一般地, 分类算法可分为无监督(unsupervised)分类和有监 督(supervised)分类. 4.1 无监督分类 无监督分类是没有训练学习过程的分类,如kmeans算法和SpectralClustering(谱聚类)算法.k- 448 北 京 理 工 大 学 学 报 第 34 卷
第5期 刘志文等:显微细胞图像分析方法的研究进展 means算法是一种基于距离的经典聚类算法,基本 思想是把n个样本数据划分成k簇,使得每一簇内5三维细胞图像分析方法 的相似度最大,簇间的相似度最小,该算法运算简 随着显微镜成像技术的发展,对细胞图像分析 单、快速,但对初始中心点较为敏感.因此,选取合的研究不再局限于二维(2D)图像,而是开始向三维 适的初始中心点能够有效改善聚类效果6.(3D)细胞图像演进.3D细胞图像相对于2D细胞 Spectral Clustering算法是选取样本数据的相似矩图像具有以下优势:①细胞是一个三维的实体, 阵的特征值和特征向量进行聚类,能够识别任意形因此3D细胞比2D细胞更加“真实”,能更加准确反 状的样本空间并收敛于全局最优解L69 应出细胞的实际形状及变化情况;②2D细胞图像 4.2有监督分类 只是3D细胞在某个平面的投影;③3D细胞不会像 有监督分类是有训练学习过程的分类,常用的2D细胞图像那样受以下因素的影响:焦平面的位 方法有最大似然法、最小距离、贝叶斯( Bayes)、人工置、采样时细胞的方向细胞重叠、图像空间分辨率 神经网络(ANN、支持向量机SVM等,贝叶斯分各向异性等.然而,现有的三维细胞显微镜成像技 类算法是基于贝叶斯定理的概率分类器,根据贝叶 术中,比如常用的共聚焦显微镜( confocal 斯公式算出样本数据属于各类别的概率,选择概率 mIcroscopy),其3D细胞图像主要是通过对多个焦 最大的一类为最终类别.该算法能应用于大型平面所成图像进行连续切片叠加所得(平行的2D 数据中,且运算简单,准确率高.由于贝叶斯定理的图像沿x轴堆叠).这种3D细胞图像的轴向分辨率 (κ轴)比横向分辨率(x、y轴)要低 成立前提是各属性间具有很强的独立性,但是在实 际情况中一般不满足此条件,因此会影响分类的准 计算机断层成像技术( computed tomography, 确性.为此就出现了许多降低独立性假设的贝叶斯 CT)是70年代发展起来在医学影像领域具有重要 分类算法,如TAN( tree augmented naive Bayes)算地位的方法.其基本原理是单一轴面的X射线照射 法,它是在贝叶斯网络结构的基础上增加属性对之体,由于不同组织对X射线的吸收能力不同而得 间的关联来实现的.人工神经网络方法采用了 到断层图像,利用电脑三维技术将这些断层图像进 行层叠重建即可得到人体的三维影像.正是基于这 大量的非线性单元广泛互联而成的网络来模仿人脑 样的思路,美国亚利桑那州的 Visiongate公司开发 神经的结构和功能,旨在研究如何利用计算机来模了称之为ClCT的光学投影层析显微镜( optical 拟人类的思维活动学习矢量量化( earning proiection tomography microscope, OPTM).与现 tor quantization,LVQ)是一种结构简单、功能有的显微镜成像技术相比,该设备所成的3D细胞 强大的神经网络分类方法,通过计算输入样本和权图像比传统2D细胞图像更能反映真实细胞形状 向量之间欧氏距离的大小来选取获胜神经元,同时,由于此成像设备能够得到各向同性的空间分 RLvQ(relevance learning vector quantization )[73J 辨率(350nm),不会出现共聚焦显微镜中轴向分辨 算法在欧氏距离计算公式中添加了表征属性重要度率低于横向分辨率的问题. Nature杂志于 的相关因子,解决了传统LVQ没有体现出各维属2012年11月份对ClCT进行了相关的报道,并称 性在分类过程中重要程度不同的问题.支持向量机它能够真实呈现出细胞的三维结构.图6给出了 SVM( super vector machine)是目前常用的有监督clCT系统成像原理的示意图.染色后的细胞悬 分类方法0,在模式识别中也得到了很好的应用浮于凝胶上从左端通过压力注入到内径为50m SVM将样本空间映射到一个更高维的空间里,使样毛细管该毛细管通过光学耦合与显微镜物镜相连 本数据具有线性可分性.在这个空间里建立一个最凝胶保证了细胞在通过毛细管时不会发生滚动及平 大间隔超平面,即使两类数据的平行超平面的距离移等,压力推动细胞到图像采集区域,随着毛细管 最大化.但该方法也存在一定的缺陷,如忽略了同的旋转,一张张细胞图像以均匀的时间间隔被采集 类内数据的分布.一种改进的方法SSVM由于显微镜物镜的焦平面能够“扫过”整个细胞,所 ( structural super vector machine)首先使用无监督以采集到的细胞图像与显微镜物镜焦点是无关的 方法分析了同类数据结构,然后将这些结构信息加( focus- Invriantimages),也可称之为伪投影图像 入到SVM的目标方程中,实现更好的分类 ( pseudo-projectionsimages).这些伪投影图像的采
means算法是一种基于距离的经典聚类算法,基本 思想是把n个样本数据划分成k 簇,使得每一簇内 的相似度最大,簇间的相似度最小.该算法运算简 单、快速,但对初始中心点较为敏感.因此,选取合 适的 初 始 中 心 点 能 够 有 效 改 善 聚 类 效 果[68]. SpectralClustering算法是选取样本数据的相似矩 阵的特征值和特征向量进行聚类,能够识别任意形 状的样本空间并收敛于全局最优解[69]. 4.2 有监督分类 有监督分类是有训练学习过程的分类,常用的 方法有最大似然法、最小距离、贝叶斯(Bayes)、人工 神经网络(ANN)、支持向量机 SVM 等.贝叶斯分 类算法是基于贝叶斯定理的概率分类器,根据贝叶 斯公式算出样本数据属于各类别的概率,选择概率 最大的一类为最终类别[70].该算法能应用于大型 数据中,且运算简单,准确率高.由于贝叶斯定理的 成立前提是各属性间具有很强的独立性,但是在实 际情况中一般不满足此条件,因此会影响分类的准 确性.为此就出现了许多降低独立性假设的贝叶斯 分类算法,如 TAN(treeaugmentednaiveBayes)算 法,它是在贝叶斯网络结构的基础上增加属性对之 间的关联来实现的[71].人工神经网络方法采用了 大量的非线性单元广泛互联而成的网络来模仿人脑 神经的结构和功能,旨在研究如何利用计算机来模 拟 人 类 的 思 维 活 动[72].学 习 矢 量 量 化 (learning vectorquantization,LVQ)是一种 结 构 简 单、功 能 强大的神经网络分类方法,通过计算输入样本和权 向 量 之 间 欧 氏 距 离 的 大 小 来 选 取 获 胜 神 经 元. RLVQ(relevancelearningvectorquantization)[73] 算法在欧氏距离计算公式中添加了表征属性重要度 的相关因子,解决了传统 LVQ 没有体现出各维属 性在分类过程中重要程度不同的问题.支持向量机 SVM (supervectormachine)是目前常用的有监督 分类方法[74],在模式识别中也得到了很好的应用. SVM 将样本空间映射到一个更高维的空间里,使样 本数据具有线性可分性.在这个空间里建立一个最 大间隔超平面,即使两类数据的平行超平面的距离 最大化.但该方法也存在一定的缺陷,如忽略了同 一类 内 数 据 的 分 布. 一 种 改 进 的 方 法 SSVM (structuralsupervectormachine)首先使用无监督 方法分析了同类数据结构,然后将这些结构信息加 入到SVM 的目标方程中[75],实现更好的分类. 5 三维细胞图像分析方法 随着显微镜成像技术的发展,对细胞图像分析 的研究不再局限于二维(2D)图像,而是开始向三维 (3D)细胞图像演进.3D 细胞图像相对于2D 细胞 图像具有以下优势[76]:① 细胞是一个三维的实体, 因此3D细胞比2D细胞更加“真实”,能更加准确反 应出细胞的实际形状及变化情况;② 2D 细胞图像 只是3D细胞在某个平面的投影;③ 3D细胞不会像 2D 细胞图像那样受以下因素的影响:焦平面的位 置、采样时细胞的方向、细胞重叠、图像空间分辨率 各向异性等.然而,现有的三维细胞显微镜成像技 术 中,比 如 常 用 的 共 聚 焦 显 微 镜 (confocal microscopy),其3D细胞图像主要是通过对多个焦 平面所成图像进行连续切片叠加所得(平行的 2D 图像沿z轴堆叠).这种3D细胞图像的轴向分辨率 (z轴)比横向分辨率(x、y轴)要低. 计算机断层成像技术(computedtomography, CT)是70年代发展起来在医学影像领域具有重要 地位的方法.其基本原理是单一轴面的 X射线照射 人体,由于不同组织对 X 射线的吸收能力不同而得 到断层图像,利用电脑三维技术将这些断层图像进 行层叠重建即可得到人体的三维影像.正是基于这 样的思路,美国亚利桑那州的 VisionGate公司开发 了称之为 CellCT 的光学投 影 层 析 显 微 镜 (optical projectiontomographymicroscope,OPTM).与现 有的显微镜成像技术相比,该设备所成的3D 细胞 图像比传统2D 细胞图像更能反映真实细胞形状; 同时,由于此成像设备能够得到各向同性的空间分 辨率(350nm),不会出现共聚焦显微镜中轴向分辨 率低 于 横 向 分 辨 率 的 问 题[7778].Nature 杂 志 于 2012年11月份对 CellCT 进行了相关的报道,并称 它能够真实呈现出细胞的三维结构[79].图6给出了 CellCT 系统成像原理的示意图.染色后的细胞悬 浮于凝胶上从左端通过压力注入到内径为 50μm 毛细管,该毛细管通过光学耦合与显微镜物镜相连. 凝胶保证了细胞在通过毛细管时不会发生滚动及平 移等.压力推动细胞到图像采集区域,随着毛细管 的旋转,一张张细胞图像以均匀的时间间隔被采集. 由于显微镜物镜的焦平面能够“扫过”整个细胞,所 以采集到的细胞图像与显微镜物镜焦点是无关的 (focus-invriantimages),也 可 称 之 为 伪 投 影 图 像 (pseudo-projectionsimages).这些伪投影图像的采 第5期 刘志文等:显微细胞图像分析方法的研究进展 449
北京理工大学学报 第34卷 集速度比毛细管旋转速度快,因此图像的运动模糊的自动、精确、快速、自适应性等作为研究目标 是可以忽略的.图中给出了0°,90°,180°3个角度采 集到的伪投影图像.当采集大量细胞图像之后就可 参考文献 以通过后投影算法进行断层重建了.文献[80]中给[1] Alberts B. Johnson A., Roberts J. Molecular biology of 出了一种基于曲面共形映射的3D断层细胞图像中 the cell [M]. 4th ed. [S.I. ] Garland Science, 2002 细胞形状分析方法,首先对3D细胞图像进行分割,[2] An Xin, Liu Zhiwen, Shi Yonggang,etal. Modeling 之后对所得二值图像进行曲面化建模,通过计算对 dynamic cellular morphology in images [C] 应细胞三维形状的球谐函数,并对形状描述子的不 Proceedings of 2012 International Conference on Medical 同分量进行统计分析,从而比较了两种不同类别癌 Image Computing and Computer Assisted Intervention (MICCAI). Nice, France: Springer, 2012, 7510: 细胞三维形状之间的差异性 fluorescence microscopy in single cells [J].Annual Review of Cell and Developmental Biology, 2009 毛细管与物 [4] Eils R, Athale C. Computational imaging in cell biology 折射率匹配的凝胶、镜光学合 [J]. The Journal of Cell Biology, 2003, 161(3) 外力推动 [5] Bhaskar H, Singh S. Live cell imaging: a computational 定位置 perspective]. Journal of Real-Time Image Processing 2007,1(3):195-212. 6OPTM成像原理示意图[7 [6] Acton S. Biomedical image analysis at the cellular level Fig. 6 The principle of OPTM [c]// Proceedings of 2008 International Machine Vision and Image Processing Conference, IMVIP'08. [S L]: 结束语 IEEE:2008:27-27 [7] Meyer M G, Fauver M, Rahn J R, et al. Automated 显微细胞图像分析技术采用计算机和模式识别 cell analysis in 2D and 3D: a comparative study [J] 技术进行细胞显微图像的定量分析和病变识别是医 Pattern Recognition, 2009,42(1): 141-146 学图像处理领域的重要方向之一,具有广泛的应用8] Yin Zhaozheng, Li Kang, Kanade takeo,etal. Under 前景.早期的研究主要集中在静态细胞图像的增 cosco 强、去噪、分割、计数、分类等方面,随着图像处理算 segmentation [C]//Proceedings of 2010 International 法的发展、研究的深入,针对细胞图像序列中细胞形 Conference on Medical Image Computing and Computer Assisted Intervention( MICCAI). Beijing: Springer 变及能动性分析逐渐成为一个重要的发展方向.同 2010:209-217 时,针对细胞分割、跟踪、形状分析等算法的研究,已[91 Yin Zhaozhen, Kanade Takeo, Chen Mei 不再局限于仅使用某一种方法,而趋向于多种方法 Understanding the phase contrast optics to restore 的结合,并加入采样设备的原理、细胞的形状信息等 artifact-free microscopy images for segmentation [J] 先验知识.此外,随着成像设备及计算机技术的发 Medical Image Analysis, 2012. 16: 1047-1062 展,显微细胞分析的研究内容也逐渐从2D单通道[101 Weszka J S. A survey of threshold selection techniqe 图像向多通道细胞图像以及3D细胞图像发展 [J]. Computer Graphics and Image Processing, 1978 总之,随着图像处理算法的日趋成熟、成像设备 7(2):259-265 的发展以及人们对于细胞研究的关注度逐渐升温, [11] Ostu N. A threshold selection method from gray-level histograms[J]. IEEE Transactions on Systems, Man 显微细胞图像分析必定由多个细胞分析逐步发展至 nd Cybernetics, 1979(9): 62-66. 单细胞的形态及功能分析,由2D细胞图像分析向[12] Jain A K, Smith Sp, Backer F. Segmentation of 3D细胞图像分析发展,由定性分析向定量分析发 muscle cell pictures: a preliminary study [J]. IEEE 展,由静态图像分析向动态图像分析发展,并以算法 Transactions on Pattern Analysis and Machine
集速度比毛细管旋转速度快,因此图像的运动模糊 是可以忽略的.图中给出了0°,90°,180°3个角度采 集到的伪投影图像.当采集大量细胞图像之后就可 以通过后投影算法进行断层重建了.文献[80]中给 出了一种基于曲面共形映射的3D 断层细胞图像中 细胞形状分析方法,首先对3D 细胞图像进行分割, 之后对所得二值图像进行曲面化建模,通过计算对 应细胞三维形状的球谐函数,并对形状描述子的不 同分量进行统计分析,从而比较了两种不同类别癌 细胞三维形状之间的差异性. 图6 OPTM 成像原理示意图[77] Fig.6 TheprincipleofOPTM 6 结束语 显微细胞图像分析技术采用计算机和模式识别 技术进行细胞显微图像的定量分析和病变识别是医 学图像处理领域的重要方向之一,具有广泛的应用 前景.早期的研究主要集中在静态细胞图像的增 强、去噪、分割、计数、分类等方面,随着图像处理算 法的发展、研究的深入,针对细胞图像序列中细胞形 变及能动性分析逐渐成为一个重要的发展方向.同 时,针对细胞分割、跟踪、形状分析等算法的研究,已 不再局限于仅使用某一种方法,而趋向于多种方法 的结合,并加入采样设备的原理、细胞的形状信息等 先验知识.此外,随着成像设备及计算机技术的发 展,显微细胞分析的研究内容也逐渐从2D 单通道 图像向多通道细胞图像以及3D细胞图像发展. 总之,随着图像处理算法的日趋成熟、成像设备 的发展以及人们对于细胞研究的关注度逐渐升温, 显微细胞图像分析必定由多个细胞分析逐步发展至 单细胞的形态及功能分析,由2D 细胞图像分析向 3D 细胞图像分析发展,由定性分析向定量分析发 展,由静态图像分析向动态图像分析发展,并以算法 的自动、精确、快速、自适应性等作为研究目标. 参考文献: [1]AlbertsB,JohnsonA,RobertsJ.Molecularbiologyof thecell[M].4thed.[S.l.]:GarlandScience,2002. [2]AnXing,LiuZhiwen,ShiYonggang,etal.Modeling dynamic cellular morphology in images [C ] ∥ Proceedingsof2012InternationalConferenceonMedical ImageComputingandComputerAssistedIntervention (MICCAI). Nice, France: Springer,2012,7510: 340 347. [3]MuzzeyD,vanOudenaardenA.Quantitativetime-lapse fluorescence microscopyin single cells[J]. Annual Review of Cell and Developmental Biology,2009, 25:301. [4]EilsR,AthaleC.Computationalimagingincellbiology [J].The Journalof Cell Biology,2003,161(3): 477 481. [5]BhaskarH,SinghS.Livecellimaging:acomputational perspective[J].JournalofReal-TimeImageProcessing, 2007,1(3):195 212. [6]ActonS.Biomedicalimageanalysisatthecellularlevel [C]∥Proceedingsof2008InternationalMachineVision andImageProcessingConference,IMVIP’08.[S.l.]: IEEE,2008:27 27. [7]MeyerM G,FauverM,RahnJR,etal.Automated cellanalysisin2Dand3D:acomparativestudy[J]. PatternRecognition,2009,42(1):141 146. [8]YinZhaozheng,LiKang,KanadeTakeo,etal.Understanding the optics to aid microscopy image segmentation[C]∥Proceedingsof2010International Conferenceon MedicalImageComputingandComputer AssistedIntervention(MICCAI).Beijing:Springer, 2010:209 217. [9]Yin Zhaozheng, Kanade Takeo, Chen Mei. Understanding the phase contrast optics to restore artifact-free microscopyimagesforsegmentation[J]. MedicalImageAnalysis,2012,16:1047 1062. [10]WeszkaJS.Asurveyofthresholdselectiontechniques [J].ComputerGraphicsandImageProcessing,1978, 7(2):259 265. [11]OstuN.Athresholdselectionmethodfromgray-level histograms[J].IEEE TransactionsonSystems,Man andCybernetics,1979(9):62 66. [12]Jain A K,Smith S P,BackerE.Segmentationof musclecellpictures:apreliminarystudy[J].IEEE Transactions on Pattern Analysis and Machine 450 北 京 理 工 大 学 学 报 第 34 卷