饲草及畜牧基础研究 扁蓿豆育种研究进展 张雨桐,石凤翎 (内蒙古农业大学草原与资源环境学院,呼和浩特010020) 摘要:综述了扁蓿豆资源、组织培养、育种及相关基础研究进展,提出高效育种技术的基础需要 有充足的种质资源、优良突变体、完善的组培扩繁体系及遗传转化体系,并进一步开展多种育种途径 及相关基础研究,为苜蓿属牧草的高效育种奠定基础。 关键词:扁蓿豆;种质资源;组织培养;抗逆基因;育种 扁蓿豆( Medicago ruthenica)是豆科( Leguminosae)苜蓿属( Medicago)多年生草本植物。扁蓿豆抗性强, 具有耐寒、抗旱、耐贫瘠、耐践踏等特点,且其叶量大,茎叶柔软,营养价值较高,适口性好,不含皂 素,家畜过量采食不会发生鼓胀病,是一种优质的蛋白质饲料。在改良草场,建立人工草地,防治水 土流失等方面起了很大的作用。扁蓿豆在抗寒、抗旱能力及适应性上都优于紫花苜蓿,即可作为亲本 与紫花苜蓿杂交,从而改善紫花苜蓿的抗寒性,在牧草抗性育种方面具有重要利用价值4。但是扁蓿 豆的牧草产量和种子产量均较苜蓿低,经济效益差,针对该问题进行扁蓿豆品种改良。目前扁蓿豆品 种改良仍是采用传统育种方法,进展缓慢,因此,进一步将传统选择育种、诱变育种和现代分子育种技 术相结合,对培育扁蓿豆新品种,提高其牧草产量及改良苜蓿的抗性等均具有重要意义。 1扁蓿豆种质资源 1.1分类与分布 扁蓿豆别名扁豆子、花苜蓿、野苜蓿、网果葫芦巴、扁蓄豆、扁豆草。扁蓿豆最早记载于1753年 命名为 Trigonella ruthenica,1841年后改为 Mdicago ruthenica,1872年改为 Pocockia ruthenica,1945 年改为 Trigonella korshinsh,1955年改为 Trigonella emodi,1976年改为 Melissitus ruthenicus,1982年 改为 Meliotoides ruthenica;1953年,《中国主要植物图说》中对扁蓿豆有进一步的介绍。早期研究认为 不同地区扁蓿豆的形态差异较大,将其归为葫芦巴属或扁蓿豆属。近年来通过对其形态特征及DNA 水平的鉴定,发现扁蓿豆与紫花苜蓿( Medicago sativa L.)近缘,是苜蓿属的一个野生种,现在将其归为 苜蓿属的一种。扁蓿豆还有不同的变种,在内蒙古境内扁蓿豆属植物有1个正种,3个变种,即扁蓿 豆〔 M. ruthenica(L)Soak)、辽西扁蓿豆( W ruthenica var ligosiensis)、阴山扁蓿豆( M ruthenica var. inshanicus)和细叶扁蓿豆( Ruthenica var, oblongifolia) 扁蓿豆是一个分布广泛,而形态变异极大的种,随着地理环境及生态条件的不同,其植株的高矮 叶片的形状、大小、宽窄:荚果的大小、宽窄都存在很大的差异。扁蓿豆为广幅旱生植物,多为典型草 原和荒漠化草原的伴生种。其生长环境多在丘陵坡地、固定沙丘、平原、沟边及路旁η。扁蓿豆在我国 中国畜牧业协会草业分会81
饲草及畜牧基础研究 81 扁蓿豆育种研究进展 张雨桐，石凤翎 （内蒙古农业大学草原与资源环境学院，呼和浩特 010020） 摘 要：综述了扁蓿豆资源、组织培养、育种及相关基础研究进展，提出高效育种技术的基础需要 有充足的种质资源、优良突变体、完善的组培扩繁体系及遗传转化体系，并进一步开展多种育种途径 及相关基础研究，为苜蓿属牧草的高效育种奠定基础。 关键词：扁蓿豆；种质资源；组织培养；抗逆基因；育种 扁蓿豆(Medicago ruthenica)是豆科(Leguminosae)苜蓿属(Medicago)多年生草本植物。扁蓿豆抗性强， 具有耐寒、抗旱、耐贫瘠、耐践踏等特点，且其叶量大，茎叶柔软，营养价值较高，适口性好，不含皂 素，家畜过量采食不会发生鼓胀病，是一种优质的蛋白质饲料[1]。在改良草场，建立人工草地，防治水 土流失等方面起了很大的作用[2]。扁蓿豆在抗寒、抗旱能力及适应性上都优于紫花苜蓿，即可作为亲本 与紫花苜蓿杂交，从而改善紫花苜蓿的抗寒性，在牧草抗性育种方面具有重要利用价值[3,4]。但是扁蓿 豆的牧草产量和种子产量均较苜蓿低，经济效益差，针对该问题进行扁蓿豆品种改良。目前扁蓿豆品 种改良仍是采用传统育种方法，进展缓慢，因此，进一步将传统选择育种、诱变育种和现代分子育种技 术相结合，对培育扁蓿豆新品种，提高其牧草产量及改良苜蓿的抗性等均具有重要意义。 1 扁蓿豆种质资源 1.1 分类与分布 扁蓿豆别名扁豆子、花苜蓿、野苜蓿、网果葫芦巴、扁蓄豆、扁豆草。扁蓿豆最早记载于 1753 年， 命名为 Trigonella ruthenica，1841 年后改为 Mdicago ruthenica，1872 年改为 Pocockia ruthenica，1945 年改为 Trigonella korshinskii，1955 年改为 Trigonella emodi，1976 年改为 Melissitus ruthenicus，1982 年 改为 Meliotoides ruthenica；1953 年《中国主要植物图说》中对扁蓿豆有进一步的介绍 , 。早期研究认为， 不同地区扁蓿豆的形态差异较大，将其归为葫芦巴属或扁蓿豆属[5]。近年来通过对其形态特征及 DNA 水平的鉴定，发现扁蓿豆与紫花苜蓿(Medicago sativa L.)近缘，是苜蓿属的一个野生种，现在将其归为 苜蓿属的一种[6]。扁蓿豆还有不同的变种，在内蒙古境内扁蓿豆属植物有 1 个正种，3 个变种，即扁蓿 豆 〔 M. ruthenica(L.) Sojak 〕、 辽 西扁 蓿 豆 (M.ruthenica var.liaosiensis) 、阴山扁蓿豆 (M.ruthenica var.inshanicus)和细叶扁蓿豆(M.ruthenica var.oblongifolia) [6]。 扁蓿豆是一个分布广泛，而形态变异极大的种，随着地理环境及生态条件的不同，其植株的高矮； 叶片的形状、大小、宽窄；荚果的大小、宽窄都存在很大的差异。扁蓿豆为广幅旱生植物，多为典型草 原和荒漠化草原的伴生种。其生长环境多在丘陵坡地、固定沙丘、平原、沟边及路旁[7]。扁蓿豆在我国
第七届(2017)中国苜蓿发展大会 东北、内蒙古、河北、山西、宁夏、甘肃、青海及新疆等省区均有分布,国外在朝鲜、蒙古、俄罗斯也 有分布。在内蒙古境内,扁蓿豆多分布于内蒙古高原的中东部、西辽河平原、南部的黄土高原、阴山山 脉及贺兰山。其中正种分布最广,遍及整个分布范围,但另三个变种的分布不同。辽西扁蓿豆主要分布 于我国东北,在大兴安岭西麓的宝格达山、阿尔山及南部的一些山地,生长于林缘草地;细叶扁蓿豆主 要分布在小腾格里沙地及科尔沁沙地,生长于固定沙丘上;阴山扁蓿豆则集中分布在阴山山脉中部的 大青山,生长于山坡下草地[。世界上共有扁蓿豆70余种,多数为多年生,少数为一年生,主要分布 于温带和寒温带的小亚细亚至远东的广阔地域内 12种质资源 牧草种质资源( forage germplasm resources)又称牧草遗传资源,是牧草遗传育种的原始材料,是 选育新品种所需的所有可利用的遗传材料,包括牧草栽培种、野生驯化种、地方品种、育成品种、栽培 种的同种野生种和同属近缘野生种,以及可能有栽培价值和育种潜力的野生种等。我国有丰富的扁蓿 豆种质资源,特别是内蒙古和西北地区。20世纪90年代初兴起了对扁蓿豆的研究热潮,1990年美国 农业部派学者到中国考察扁蓿豆资源,并相继设立了中美合作研究扁蓿豆课题:新西兰草地研究所也 立项进行了研究。 Campbell包贵平等門在1991年将内蒙古15个不同生态区域收集的50多份扁蓿豆 材料引种到美国东部,对其进行了农艺性状的评价,随后 Campbell1u扁蓿豆的生长发育、生长习 性、开花习性、种子活力以及苜蓿和扁蓿豆之间的遗传变异等进行了硏究,认为扁蓿豆的抗逆基因是 用于紫花苜蓿基因改良的优质资源。我国学者在日本鸟取大学农学部也对我国的扁蓿豆种质资源开展 了评价研究21314,进一步证明了扁蓿豆是抗逆性极强的优良牧草在种子贮藏蛋白和形态方面均具有 丰富的遗传多样性。中国农业科学院国家牧草中期库现已搜集并保存扁蓿豆种质资源258份,并对扁 蓿豆种质资源进行了较为系统地研究,包括形态学、农艺性状、抗性鉴定、细胞学特性以及遗传多样性 等方面,为我国扁蓿豆种质资源的充分开发与利用、种质创新、新品种培育等提供了极为有利的科学 支撑。 2扁蓿豆组织培养 扁蓿豆的组织培养始于20世纪90年代,以茎、叶为外植体,进行组织培养体系的初步确立。试 验结果显示用于扁蓿豆组织培养的茎外植体成苗率要好于叶外植体S。胚状体是植物组织培养形态发 生最重要的常见方式,1995年金洪等門首次报道了直立型扁蓿豆[ Melilotoides ruthenicus(L.) Sojak cv. Zhilixing成熟胚离体培养中器官发生的组织学研究,从愈伤组织和胚轴上都可诱导出胚状体的球形 原始体。陶茸等以扁蓿豆下胚轴愈伤组织为材料,确定能够酶解出髙数量且髙活力的原生质体的最 佳酶液组合为2%纤维素酶+0.5%果胶酶+0.3%半纤维素酶、酶解时间为12h、酶液渗透压即甘露醇浓度 为0.55mol-L1,愈伤培养天数为10~12d、预处理措施为黑暗24h。 扁蓿豆进行组织培养研究中,植物激素配比对诱导愈伤组织形成,分化成苗起着关键作用。目前 常用的主要有生长素类(AA、2,4D和NAA)和细胞分裂素类(6BA和KT)。其浓度、种类以及不同的 组合所起的作用不同,不同的扁蓿豆品种其生长发育各阶段所需的植物生长调节剂也不同。早年研究 发现IAA、NAA与BA的配合使用对直立型扁蓿豆成熟胚愈伤组织的诱导和不定芽的器官发生有显著 82@中国畜牧业协会草业分会
第七届（2017）中国苜蓿发展大会 82 东北、内蒙古、河北、山西、宁夏、甘肃、青海及新疆等省区均有分布，国外在朝鲜、蒙古、俄罗斯也 有分布。在内蒙古境内，扁蓿豆多分布于内蒙古高原的中东部、西辽河平原、南部的黄土高原、阴山山 脉及贺兰山。其中正种分布最广，遍及整个分布范围，但另三个变种的分布不同。辽西扁蓿豆主要分布 于我国东北，在大兴安岭西麓的宝格达山、阿尔山及南部的一些山地，生长于林缘草地；细叶扁蓿豆主 要分布在小腾格里沙地及科尔沁沙地，生长于固定沙丘上；阴山扁蓿豆则集中分布在阴山山脉中部的 大青山，生长于山坡下草地[7,8]。世界上共有扁蓿豆 70 余种，多数为多年生，少数为一年生，主要分布 于温带和寒温带的小亚细亚至远东的广阔地域内[7,8]。 1.2 种质资源 牧草种质资源（forage germplasm resources）又称牧草遗传资源，是牧草遗传育种的原始材料，是 选育新品种所需的所有可利用的遗传材料，包括牧草栽培种、野生驯化种、地方品种、育成品种、栽培 种的同种野生种和同属近缘野生种，以及可能有栽培价值和育种潜力的野生种等[9]。我国有丰富的扁蓿 豆种质资源，特别是内蒙古和西北地区。20 世纪 90 年代初兴起了对扁蓿豆的研究热潮，1990 年美国 农业部派学者到中国考察扁蓿豆资源，并相继设立了中美合作研究扁蓿豆课题；新西兰草地研究所也 立项进行了研究。Campbell、包贵平等[9]在 1991 年将内蒙古 15 个不同生态区域收集的 50 多份扁蓿豆 材料引种到美国东部，对其进行了农艺性状的评价，随后 Campbell[10,11]对扁蓿豆的生长发育、生长习 性、开花习性、种子活力以及苜蓿和扁蓿豆之间的遗传变异等进行了研究，认为扁蓿豆的抗逆基因是 用于紫花苜蓿基因改良的优质资源。我国学者在日本鸟取大学农学部也对我国的扁蓿豆种质资源开展 了评价研究[12,13,14]，进一步证明了扁蓿豆是抗逆性极强的优良牧草,在种子贮藏蛋白和形态方面均具有 丰富的遗传多样性。中国农业科学院国家牧草中期库现已搜集并保存扁蓿豆种质资源 258 份，并对扁 蓿豆种质资源进行了较为系统地研究，包括形态学、农艺性状、抗性鉴定、细胞学特性以及遗传多样性 等方面，为我国扁蓿豆种质资源的充分开发与利用、种质创新、新品种培育等提供了极为有利的科学 支撑。 2 扁蓿豆组织培养 扁蓿豆的组织培养始于 20 世纪 90 年代，以茎、叶为外植体，进行组织培养体系的初步确立。试 验结果显示用于扁蓿豆组织培养的茎外植体成苗率要好于叶外植体[15]。胚状体是植物组织培养形态发 生最重要的常见方式，1995 年金洪等[9]首次报道了直立型扁蓿豆[Melilotoides ruthenicus(L.)Sojak cv.Zhilixing]成熟胚离体培养中器官发生的组织学研究，从愈伤组织和胚轴上都可诱导出胚状体的球形 原始体。陶茸等[16]以扁蓿豆下胚轴愈伤组织为材料，确定能够酶解出高数量且高活力的原生质体的最 佳酶液组合为 2%纤维素酶+0.5%果胶酶+0.3%半纤维素酶、酶解时间为 12h、酶液渗透压即甘露醇浓度 为 0.55mol·L- 1，愈伤培养天数为 10～12d、预处理措施为黑暗 24h。 扁蓿豆进行组织培养研究中，植物激素配比对诱导愈伤组织形成，分化成苗起着关键作用。目前 常用的主要有生长素类(IAA、2,4-D 和 NAA)和细胞分裂素类(6-BA 和 KT)。其浓度、种类以及不同的 组合所起的作用不同，不同的扁蓿豆品种其生长发育各阶段所需的植物生长调节剂也不同。早年研究 发现 IAA、NAA 与 BA 的配合使用对直立型扁蓿豆成熟胚愈伤组织的诱导和不定芽的器官发生有显著
饲草及畜牧基础研究 的促进作用。卞晓燕分别用直立型扁蓿豆的下胚轴和子叶作为外植体,探讨2,4D、6-BA、NAA 种激素对其愈伤组织诱导及分化的影响中发现6-BA对愈伤组织的形成有很大的影响;2,4-D,NAA对 诱导愈伤的形成没有明显的作用;而2,4-D对直立型扁蓿豆分化成苗的影响是最明显的,其次是6BA NAA亦无明显作用。直立型扁蓿豆愈伤组织诱导的较优培养基组合是MS+2,4D0.5mgA+6BA10 mg/+NAA1.0mgL;愈伤组织分化成苗的较佳培养基组合是MS+6BA10mg/L。陶茸1研究了 24-D、6-BA、NAA、KT四种激素对扁蓿豆子叶和下胚轴愈伤组织诱导,其结果与卞晓燕类似,对子 叶愈伤组织最佳效果是0.5mgL124D+0mgL16-BA+1.0mgL1NAA+025mgL1KT;对下胚轴愈 伤组织诱导效果最明显是0.5mgL12,4D+1.0mgL16-BA+05mgL1NAA+025 mg.LKT。通过对比 卞晓燕、陶茸试验结果可见KT对愈伤组织诱导率的影响不大,但在诱导培养基中添加KT可以改善愈 伤组织的质量,在一定程度上能延缓愈伤组织的衰老,延缓其器官分化能力的丧失,从而提高植株再 生频率s伊风艳明通过试验获得适合直立型扁蓿豆组培苗诱导生根培养基是12MS+0.5 mg/LNAA, 生根率达60 刘四军巴2对于扁蓿豆组培快繁研究中提到小植株根生长至lcm后可直接移植入土,根系太发达或 太小都不易成活,土加化肥用水浸泡2-3天后移苗便于成活。炼苗的难点主要是室内与外界环境条件 有较大差异,室内条件单一易于控制,而田间、温室会受到诸多因素影响,这直接造成组培苗移栽后死 亡的现象。组培苗能否尽快应用于大田生产,组培每一环节的技术都显得尤为重要。 3扁蓿豆的育种 3.1传统育种 3.1.1引种驯化 扁蓿豆在我国北方地区普遍表现出抗性强,草质优良,适应性强等特点,但野生扁蓿豆普遍表现 平卧型和半直立半斜生型,产草量低,且不利于人工收获,一般只能放牧利用。针对扁蓿豆这一不良性 状,乌云飞等四自1980年开始,以直立型、高产为选育目标,对采集各地的野生种质材料驯化栽培, 采用多次混合选择法,成功选育出直立型扁蓿豆,并于1992年12月经全国牧草品种审定委员会审定 登记。直立型扁蓿豆植株直立、叶片较大、分枝多、产量高、饲用价值好:具有抗寒、耐旱、耐瘠薄、 抗蓟马、适应性强,早熟等优良性状。徐成体195年从内蒙古引入直立型扁蓿豆在青海高寒牧区进 行试种,其研究结果表明该牧草耐旱、抗寒、茎直立、适应性强,越冬成活率达94.1%以上,粗蛋白含 量18.85%,年产青草11800kghm2,是目前高寒牧区人工草地建植和天然草地改良中较为理想的豆科 牧草品种之一。中国农业科学院草原研究所以采自土默特左旗沙尔沁乡的野生扁蓿豆为原始材料,以 平卧型、枝条长,高产为选育目标,经多年栽培驯化,育成野生栽培品种—一土默特扁蓿豆[Mεdicαgo ruthenica (Linn) Trauty. Tumote],并于2009年5月由全国草品种审定委员会审定登记2,德科加徐 成体凹通过对野生青藏扁蓿豆种子进行引种驯化研究发现,在高寒地区建立人工草地和天然草场改良 时,青藏扁蓿豆具有良好的生产能力,可作为多年生豆科牧草草种。其驯化3年后干草产量达到 7716kg/hm2,种子产量达到2250kg/hm2,自然越冬率达963%,粗蛋白质含量达193%,粗脂肪含量达 5.1%,土壤肥力有明显提高。但引种驯化的新品种繁殖所需时间长,不能满足大量生产的需求。因此, 中国畜牧业协会草业分会83
饲草及畜牧基础研究 83 的促进作用。卞晓燕[10]分别用直立型扁蓿豆的下胚轴和子叶作为外植体，探讨 2,4-D、6-BA、NAA 三 种激素对其愈伤组织诱导及分化的影响中发现 6-BA 对愈伤组织的形成有很大的影响；2,4-D，NAA 对 诱导愈伤的形成没有明显的作用；而 2,4-D 对直立型扁蓿豆分化成苗的影响是最明显的，其次是 6-BA， NAA 亦无明显作用。直立型扁蓿豆愈伤组织诱导的较优培养基组合是 MS+ 2,4-D 0.5 mg /L+ 6-BA 1.0 mg /L+ NAA 1.0 mg /L；愈伤组织分化成苗的较佳培养基组合是 MS+ 6-BA 1.0 mg /L。陶茸[17]研究了 2,4-D、6-BA、NAA、KT 四种激素对扁蓿豆子叶和下胚轴愈伤组织诱导，其结果与卞晓燕类似，对子 叶愈伤组织最佳效果是 0.5mg·L- 1 2,4-D+1.0mg·L- 1 6-BA+1.0mg·L- 1 NAA+0.25mg·L- 1 KT；对下胚轴愈 伤组织诱导效果最明显是 0.5mg·L- 1 2,4-D+1.0mg·L- 1 6-BA+0.5mg·L- 1 NAA+0.25mg·L- 1 KT。通过对比 卞晓燕、陶茸试验结果可见 KT 对愈伤组织诱导率的影响不大，但在诱导培养基中添加 KT 可以改善愈 伤组织的质量，在一定程度上能延缓愈伤组织的衰老，延缓其器官分化能力的丧失，从而提高植株再 生频率[18]。伊风艳[19]通过试验获得适合直立型扁蓿豆组培苗诱导生根培养基是 1/2 MS+0.5mg/L NAA， 生根率达 60%。 刘四军[20]对于扁蓿豆组培快繁研究中提到小植株根生长至 1cm 后可直接移植入土，根系太发达或 太小都不易成活，土加化肥用水浸泡 2-3 天后移苗便于成活。炼苗的难点主要是室内与外界环境条件 有较大差异，室内条件单一易于控制，而田间、温室会受到诸多因素影响，这直接造成组培苗移栽后死 亡的现象。组培苗能否尽快应用于大田生产，组培每一环节的技术都显得尤为重要。 3 扁蓿豆的育种 3.1 传统育种 3.1.1 引种驯化 扁蓿豆在我国北方地区普遍表现出抗性强，草质优良，适应性强等特点，但野生扁蓿豆普遍表现 平卧型和半直立半斜生型，产草量低，且不利于人工收获，一般只能放牧利用。针对扁蓿豆这一不良性 状，乌云飞等[21]自 1980 年开始，以直立型、高产为选育目标，对采集各地的野生种质材料驯化栽培， 采用多次混合选择法，成功选育出直立型扁蓿豆，并于 1992 年 12 月经全国牧草品种审定委员会审定 登记。直立型扁蓿豆植株直立、叶片较大、分枝多、产量高、饲用价值好；具有抗寒、耐旱、耐瘠薄、 抗蓟马、适应性强，早熟等优良性状。徐成体[21]1995 年从内蒙古引入直立型扁蓿豆在青海高寒牧区进 行试种，其研究结果表明该牧草耐旱、抗寒、茎直立、适应性强，越冬成活率达 94.1%以上，粗蛋白含 量 18.85%，年产青草 11800kg/hm2，是目前高寒牧区人工草地建植和天然草地改良中较为理想的豆科 牧草品种之一。中国农业科学院草原研究所以采自土默特左旗沙尔沁乡的野生扁蓿豆为原始材料，以 平卧型、枝条长，高产为选育目标，经多年栽培驯化，育成野生栽培品种——土默特扁蓿豆[Medicago ruthenica(Linn.) Trautv. ‘Tumote’]，并于 2009 年 5 月由全国草品种审定委员会审定登记[22]，德科加,徐 成体[22]通过对野生青藏扁蓿豆种子进行引种驯化研究发现，在高寒地区建立人工草地和天然草场改良 时，青藏扁蓿豆具有良好的生产能力，可作为多年生豆科牧草草种。其驯化 3 年后干草产量达到 7716kg/hm2，种子产量达到 225.0kg/hm2，自然越冬率达 96.3%，粗蛋白质含量达 19.3%，粗脂肪含量达 5.1%，土壤肥力有明显提高。但引种驯化的新品种繁殖所需时间长，不能满足大量生产的需求。因此
第七届(2017)中国苜蓿发展大会 寻找有效的良种繁育方法势在必行。 3.1.2杂交育种 为培育高产、优质、抗寒的优良苜蓿品种,王殿魁等ρ3综合扁蓿豆抗逆性强与苜蓿产量高的优良 特性,以二倍体扁蓿豆与四倍体肇东苜蓿的诱发突变体做杂交亲本,获得远缘杂交种。并通过细胞学 鉴定及3个世代的继代选育,又通过3个气候区,4个研究基点,4种土壤类型对6个品系(即龙牧801 802、803、804、805、806)的产草量稳定性进行连续4年产草量分析,指出其中反交半直立型(804)具有 平均稳定性,反交直立型(803)、正交回交种(805)、反交回交种(806)低于平均稳定性,在环境指数 较高的条件下有较大增产潜力,另外正交种(81、802)高于平均稳定性,其抗逆性较强,适应在环境指 数较低的条件下种植23242。在1976-1992年间经辐射处理后育成了丰产型品种龙牧803号苜蓿和抗性 品种龙牧801号苜蓿。其中优良的突变体是解决远缘杂交不育的关键。扁蓿豆种子常携带有白粉病和 苜蓿籽蜂,辐射可以使苜蓿籽蜂失去繁殖力,而突变体杂交则可消除白粉病。扁蓿豆与苜蓿杂交的杂 种性状向染色体倍数多的一方发展,故其在形态上近似四倍体苜蓿,而与扁蓿豆近似的性状较少,所 以保持了苜蓿产草量高,品质好的优点,克服了扁蓿豆产草量低和再生性差等缺点,但同时在后代中 也增强了扁蓿豆的抗逆性2324。 3.1.3诱变育种与倍性育种 自1928年以来,诱发突变技术应用于农作物新材料创制和优良新品种培育。扁蓿豆诱变育种工作 起步较晚。用不同射线对多种牧草的种子和幼苗进行了辐射,探索了不同牧草的最适辐射剂量25。曹 芙采用600Gy、800Gy、1000G0y、1200Gy、1400y剂量的60CoY射线对直立型扁蓿豆种子进行辐 照诱导,结果表明,随着辐照剂量的増加,显著抑制其幼根的生长,但会促进其出苗:辐射后种子发芽 势显著降低,但发芽率变化较小。李慧凹利用不同剂量吣σγ射线辐照直立型扁蓿豆干种子和吸胀种 子,对其M0代生长第3年的植株和M1代幼苗的生长发育特性进行诱变效应分析,结果显示,干种子 辐射后,在8000y辐射条件下,具有多叶、叶面积大等优良特性;吸胀种子辐射后,在1200G辐射 条件下,表现出荚果宽、种子大、多叶等优良特性。通过EMS诱变育种可导致点突变,生物学上广泛 运用EMS诱变来创建突变体库。乔雨28采用0.9%EMS对直立型扁蓿豆进行不同时间的浸种处理,结 果显示,以相对发芽率达半致死剂量为标准,用0.9%GEMS处理直立型扁蓿豆种子48为适宜的处理时 间 通常植物细胞染色体自然加倍的频率很低,很难满足多倍体育种的要求。采用人工诱导方法可获 得多倍体植株,并利用其变异选育新品种。由于诱变手段较简单,育出的品种经济价值高,还可有效克 服远缘杂交不亲和等特点,因此应用较为广泛。它是一种有效的育种途径,是改良品种,获得优质高产 新品种的重要手段之一∞。早期人工诱发多倍体多采用物理方法,比如断顶、摘心或温度的急骤改变 等,诱使断口处产生愈伤组织和再生不定芽,以期得到染色体加倍的组织。此外,温度的急骤改变,尤 其是高温,常能引起染色体加倍,但这些方法诱导多倍体成效甚微。利用植物碱、异生长素、抗微管除 草剂等化学药剂诱导多倍体的尝试越来越多30,31.2。采用此类人工诱变的方法,可以在较短时期创造出 多倍体的新种质。大量的育种实践已经证实,最适宜用染色体加倍方法进行改造的作物应该是那些细 胞内的染色体数目比较少,以收获营养体为主,进行异花授粉,具有多年生习性和营养繁殖特性的作 84@中国畜牧业协会草业分会
第七届（2017）中国苜蓿发展大会 84 寻找有效的良种繁育方法势在必行。 3.1.2 杂交育种 为培育高产、优质、抗寒的优良苜蓿品种，王殿魁等[23]综合扁蓿豆抗逆性强与苜蓿产量高的优良 特性，以二倍体扁蓿豆与四倍体肇东苜蓿的诱发突变体做杂交亲本，获得远缘杂交种。并通过细胞学 鉴定及 3 个世代的继代选育，又通过 3 个气候区，4 个研究基点，4 种土壤类型对 6 个品系(即龙牧 801、 802、803、804、805、806)的产草量稳定性进行连续 4 年产草量分析，指出其中反交半直立型(804)具有 平均稳定性，反交直立型(803)、正交回交种（805）、反交回交种（806）低于平均稳定性，在环境指数 较高的条件下有较大增产潜力，另外正交种(801、802)高于平均稳定性，其抗逆性较强，适应在环境指 数较低的条件下种植[23,24,25]。在 1976-1992 年间经辐射处理后育成了丰产型品种龙牧 803 号苜蓿和抗性 品种龙牧 801 号苜蓿。其中优良的突变体是解决远缘杂交不育的关键。扁蓿豆种子常携带有白粉病和 苜蓿籽蜂，辐射可以使苜蓿籽蜂失去繁殖力，而突变体杂交则可消除白粉病。扁蓿豆与苜蓿杂交的杂 种性状向染色体倍数多的一方发展，故其在形态上近似四倍体苜蓿，而与扁蓿豆近似的性状较少，所 以保持了苜蓿产草量高，品质好的优点，克服了扁蓿豆产草量低和再生性差等缺点，但同时在后代中 也增强了扁蓿豆的抗逆性[23,24]。 3.1.3 诱变育种与倍性育种 自 1928 年以来，诱发突变技术应用于农作物新材料创制和优良新品种培育。扁蓿豆诱变育种工作 起步较晚。用不同射线对多种牧草的种子和幼苗进行了辐射，探索了不同牧草的最适辐射剂量[25]。曹 芙[26]采用 600Gy、800Gy、1000Gy、1200Gy、1400Gy 剂量的 60Co-γ 射线对直立型扁蓿豆种子进行辐 照诱导，结果表明，随着辐照剂量的增加，显著抑制其幼根的生长，但会促进其出苗；辐射后种子发芽 势显著降低，但发芽率变化较小。李慧[27]利用不同剂量 60Co-γ 射线辐照直立型扁蓿豆干种子和吸胀种 子，对其 M0 代生长第 3 年的植株和 M1 代幼苗的生长发育特性进行诱变效应分析，结果显示，干种子 辐射后，在 800Gy 辐射条件下，具有多叶、叶面积大等优良特性；吸胀种子辐射后，在 1200Gy 辐射 条件下，表现出荚果宽、种子大、多叶等优良特性。通过 EMS 诱变育种可导致点突变，生物学上广泛 运用 EMS 诱变来创建突变体库。乔雨[28]采用 0.9%EMS 对直立型扁蓿豆进行不同时间的浸种处理，结 果显示，以相对发芽率达半致死剂量为标准，用 0.9%EMS 处理直立型扁蓿豆种子 48h 为适宜的处理时 间。 通常植物细胞染色体自然加倍的频率很低，很难满足多倍体育种的要求。采用人工诱导方法可获 得多倍体植株，并利用其变异选育新品种。由于诱变手段较简单，育出的品种经济价值高，还可有效克 服远缘杂交不亲和等特点，因此应用较为广泛。它是一种有效的育种途径，是改良品种，获得优质高产 新品种的重要手段之一[29]。早期人工诱发多倍体多采用物理方法，比如断顶、摘心或温度的急骤改变 等，诱使断口处产生愈伤组织和再生不定芽，以期得到染色体加倍的组织。此外，温度的急骤改变，尤 其是高温，常能引起染色体加倍，但这些方法诱导多倍体成效甚微。利用植物碱、异生长素、抗微管除 草剂等化学药剂诱导多倍体的尝试越来越多[30,31,32]。采用此类人工诱变的方法，可以在较短时期创造出 多倍体的新种质。大量的育种实践已经证实，最适宜用染色体加倍方法进行改造的作物应该是那些细 胞内的染色体数目比较少，以收获营养体为主，进行异花授粉，具有多年生习性和营养繁殖特性的作
饲草及畜牧基础研究 物。扁蓿豆是二倍体植株(2n=16),所以适合人工诱导多倍体的试验。卞晓燕3采用Co-y辐射和秋水 仙素对直立型扁蓿豆的不同器官和组织进行多倍体诱导,结果表明用oy射线的120Gy剂量下辐 照种子,染色体发生变异:0.2%秋水仙素+1%DMSO处理幼根3d为较优诱导条件,处理部位对其分 化苗的形成起主要作用。王璐等叫在前人基础上用不同浓度的秋水仙素和二甲基亚砜(DMSO)对直立 型扁蓿豆种子进行诱导,结果表明:0.05%的秋水仙素添加1.5%的DMSO,在温度为20℃C时处理吸 胀种子5h,细胞染色体加倍率较高(50%)。在此浓度下通过调整助渗剂DMSO浓度为1.0%,在4℃C 和25℃C下交替处理吸胀种子2h获得了成苗植株,其相对成苗率36%,株型变异率30%,气孔参数变 异率667%。孔淑颖等③5用秋水仙素处理扁蓿豆新品系90-36种子,结果显示以浓度0.10%、处理时 间1~2d效果较好,四倍体细胞诱变率分别为36.7%和358%相比于杂交育种,诱变育种具有创造新 变异多、育种时间短等优点,是创造牧草新变异和培育新品种的有效手段。诱导多倍体硏究中避免嵌 合体产生是一大难点,染色体加倍可与组织培养技术结合通过离体培养获得多倍体。通过离体培养获 得四倍体可以提高再生植株群体中四倍体的频率,并容易控制实验条件,减少或避免异倍性嵌合体, 3.2分子育种相关基础 我国生物技术应用于牧草的研究始于20世纪80年代末,随着分子生物学的不断发展,利用基因 工程技术在分子水平上对苜蓿进行遗传改良已成为可能。近年来,该领域的应用研究日益广泛和深入。 苜蓿基因工程的硏究主要集中于苜蓿的品质改良、提高抗逆性、抗病虫害、抗除草剂等诸多方面,为苜 蓿分子育种的进一步发展提供理论基础和技术支撑。扁蓿豆抗性要优于同属的紫花苜蓿和黄花苜蓿 通过筛选抗逆性基因并进行同源苜蓿表达相对容易。尽管在苜蓿抗性方面研究比较深入,但是将扁蓿 豆抗性基因成功转入苜蓿,从而实现抗性强、产量高的报道较少,仅涉及部分相关基础研究1343。利 用已知蒺藜苜蓿的遗传背景,采用 Eco ri和Msel为限制性内切酶建立扁蓿豆的cDNA-AFLP反应体系 对其进行低温诱导基因差异表达,结果显示其中70.79%的差异片段序列与蒺藜苜蓿的相关序列高度 致。利用RACE技术获得扁蓿豆抗寒相关的MRPP2C、 MRHSP70、 MRHLH的cDNA,其编码蛋白分 别具有PP2C、HSP70、HLH的保守域,与蒺藜苜蓿及其他植物的相应基因编码氨基酸序列高度相似。 以直立型扁蓿豆为材料,在低温胁迫条件下,通过 RT-PCR技术克隆得到苜蓿的 Actin、CAS15A和 CAS15B基因,与苜蓿的 Actin和CAS基因相似率高达93%以上。其中扁蓿豆 Actin基因在不同温度 处理下的叶、茎、根中表达均无差异,可作为后期定量分析的内参基因;扁蓿豆CAS15基因属于CAS 冷诱导基因家族,随着低温胁迫时间的延长表达量呈现上升趋势,推测CAS15的表达增强了扁蓿豆的 抗寒性。蔡丽艳以扁蓿豆MR5为材料,利用SSH技术,构建了扁蓿豆抗旱差异表达基因的正向和 反向文库。两个cDNA文库的平均插入片段分别为21!p和251bp,重组率分别为96%和95%;筛选 出14条抗旱候选基因,对同源蛋白的基因序列进行分类,这些已知功能基因涉及新陈代谢、细胞防御、 信号传导、能量代谢、细胞运输、蛋白加工及转录等方面。在干旱胁迫下,扁蓿豆叶片的物质代谢和能 量代谢受到抑制,细胞防御相关基因增加,信号转导和转录调控降低,蛋白质合成和转化增加。马超和 沈迎芳等338就扁蓿豆 MrlEA2基因的克隆和原核表达及SK2型脱水素基因MDHN3的异源表达进 行了研究,研究表明, MrlEA2蛋白对高盐和温度胁迫引起的细胞损伤具有保护作用。以上研究为今后 牧草抗逆性遗传改良的研究提供了有用信息 中国畜牧业协会草业分会85
饲草及畜牧基础研究 85 物。扁蓿豆是二倍体植株(2n=16)，所以适合人工诱导多倍体的试验。卞晓燕[33]采用 60Co-γ 辐射和秋水 仙素对直立型扁蓿豆的不同器官和组织进行多倍体诱导，结果表明用 60Co-γ 射线的 1200Gy 剂量下辐 照种子，染色体发生变异；0.2%秋水仙素+ 1%DMSO 处理幼根 3d 为较优诱导条件，处理部位对其分 化苗的形成起主要作用。王璐等[34]在前人基础上用不同浓度的秋水仙素和二甲基亚砜( DMSO) 对直立 型扁蓿豆种子进行诱导，结果表明：0.05% 的秋水仙素添加 1.5%的 DMSO，在温度为 20 ℃时处理吸 胀种子 5 h，细胞染色体加倍率较高( 50% ) 。在此浓度下通过调整助渗剂 DMSO 浓度为 1.0%，在 4℃ 和 25℃下交替处理吸胀种子 2 h 获得了成苗植株，其相对成苗率 36%，株型变异率 30%，气孔参数变 异率 66.7% 。孔淑颖等[35]用秋水仙素处理扁蓿豆新品系 90- 36 种子，结果显示以浓度 0.10%、处理时 间 1～2d 效果较好，四倍体细胞诱变率分别为 36.7%和 35.8%。相比于杂交育种，诱变育种具有创造新 变异多、育种时间短等优点，是创造牧草新变异和培育新品种的有效手段。诱导多倍体研究中避免嵌 合体产生是一大难点，染色体加倍可与组织培养技术结合通过离体培养获得多倍体。通过离体培养获 得四倍体可以提高再生植株群体中四倍体的频率，并容易控制实验条件，减少或避免异倍性嵌合体。 3.2 分子育种相关基础 我国生物技术应用于牧草的研究始于 20 世纪 80 年代末，随着分子生物学的不断发展，利用基因 工程技术在分子水平上对苜蓿进行遗传改良已成为可能。近年来，该领域的应用研究日益广泛和深入。 苜蓿基因工程的研究主要集中于苜蓿的品质改良、提高抗逆性、抗病虫害、抗除草剂等诸多方面，为苜 蓿分子育种的进一步发展提供理论基础和技术支撑。扁蓿豆抗性要优于同属的紫花苜蓿和黄花苜蓿， 通过筛选抗逆性基因并进行同源苜蓿表达相对容易。尽管在苜蓿抗性方面研究比较深入，但是将扁蓿 豆抗性基因成功转入苜蓿，从而实现抗性强、产量高的报道较少，仅涉及部分相关基础研究[33,34,35]。利 用已知蒺藜苜蓿的遗传背景，采用 Eco RⅠ和 MseⅠ为限制性内切酶建立扁蓿豆的 cDNA-AFLP 反应体系 对其进行低温诱导基因差异表达，结果显示其中 70.79%的差异片段序列与蒺藜苜蓿的相关序列高度一 致。利用 RACE 技术获得扁蓿豆抗寒相关的 MRPP2C、MRHSP70、MRHLH 的 cDNA，其编码蛋白分 别具有 PP2C、HSP70、HLH 的保守域，与蒺藜苜蓿及其他植物的相应基因编码氨基酸序列高度相似。 以直立型扁蓿豆为材料，在低温胁迫条件下，通过 RT-PCR 技术克隆得到苜蓿的 Actin、CAS15A 和 CAS15B 基因，与苜蓿的 Actin 和 CAS 基因相似率高达 93%以上。其中扁蓿豆 Actin 基因在不同温度 处理下的叶、茎、根中表达均无差异，可作为后期定量分析的内参基因；扁蓿豆 CAS15 基因属于 CAS 冷诱导基因家族，随着低温胁迫时间的延长表达量呈现上升趋势，推测 CAS15 的表达增强了扁蓿豆的 抗寒性。蔡丽艳[36]以扁蓿豆 MR5 为材料，利用 SSH 技术，构建了扁蓿豆抗旱差异表达基因的正向和 反向文库。两个 cDNA 文库的平均插入片段分别为 211bp 和 251bp，重组率分别为 96%和 95%；筛选 出 14 条抗旱候选基因，对同源蛋白的基因序列进行分类，这些已知功能基因涉及新陈代谢、细胞防御、 信号传导、能量代谢、细胞运输、蛋白加工及转录等方面。在干旱胁迫下，扁蓿豆叶片的物质代谢和能 量代谢受到抑制，细胞防御相关基因增加，信号转导和转录调控降低，蛋白质合成和转化增加。马超和 沈迎芳等[37,38]就扁蓿豆 MrLEA2 基因的克隆和原核表达及 SK2 型脱水素基因 MrDHN3 的异源表达进 行了研究，研究表明，MrLEA2 蛋白对高盐和温度胁迫引起的细胞损伤具有保护作用。以上研究为今后 牧草抗逆性遗传改良的研究提供了有用信息
第七届(2017)中国苜蓿发展大会 深入分析研究扁蓿豆抗性的相关基因,为其抗逆性分子标记辅助育种筛选出更多的候选基因:将 候选基因通过转基因技术转入烟草或蒺藜苜蓿等模式植物中,对其进行逆境胁迫,验证这些基因的功 能和表达情况,为高抗牧草育种奠定基础。 4展望 (1)高效育种技术的基础需要有充足的种质资源、优良的突变体和适宜的育种方法。诱发突变技 术应用于农作物新材料创制和优良新品种培育已取得很多成果,但在牧草育种上成功应用的较少。因 此,今后还需加强扁蓿豆诱变育种研究,选择适宜诱变育种方法,提高扁蓿豆变异率及其变异范围 效地改良其产量低、斜生及平卧株型等不良性状。 (2)扁蓿豆育种需建立完善的组培体系及遗传转化体系,可为其转基因育种和分子标记辅助选择 育种奠定基础。扁蓿豆组织培养体系已基本构建,但依然存在再生效率不稳定、再生周期长、可重复性 差等问题,需要借鉴苜蓿成熟的组织培养技术,针对炼苗的环境条件(如温度、湿度、光照、基质等)对 组培苗成苗的影响,筛选确定适宜的培养条件,为优良突变体及新品系的扩繁奠定基础 (3)扁蓿豆为苜蓿属内抗逆性很强的优异二倍体种质材料,在苜蓿抗逆育种中应加强同属内扁蓿 豆抗逆基因资源的利用。长期以来,扁蓿豆育种主要利用常规育种技术,但其选育时间长,育种效率 低。因此,分子设计育种与常规育种技术有效结合,利用扁蓿豆已知基因序列和功能,通过基因定位、 基因聚合、标记追踪等技术,进而筛选出抗性强与产量高聚合于一体的品种。同时可从扁蓿豆中克隆 相关抗逆基因导入苜蓿中,培育抗逆高产苜蓿新品种;但传统的转基因技术由于整合位点不可控、遗 传不稳定等因素也难以发挥作用,故可尝试利用基因编辑技术对苜蓿属牧草进行新型分子育种 参考文献(略 86@中国畜牧业协会草业分会
第七届（2017）中国苜蓿发展大会 86 深入分析研究扁蓿豆抗性的相关基因，为其抗逆性分子标记辅助育种筛选出更多的候选基因；将 候选基因通过转基因技术转入烟草或蒺藜苜蓿等模式植物中，对其进行逆境胁迫，验证这些基因的功 能和表达情况，为高抗牧草育种奠定基础。 4 展望 （1）高效育种技术的基础需要有充足的种质资源、优良的突变体和适宜的育种方法。诱发突变技 术应用于农作物新材料创制和优良新品种培育已取得很多成果，但在牧草育种上成功应用的较少。因 此，今后还需加强扁蓿豆诱变育种研究，选择适宜诱变育种方法，提高扁蓿豆变异率及其变异范围，有 效地改良其产量低、斜生及平卧株型等不良性状。 （2）扁蓿豆育种需建立完善的组培体系及遗传转化体系，可为其转基因育种和分子标记辅助选择 育种奠定基础。扁蓿豆组织培养体系已基本构建，但依然存在再生效率不稳定、再生周期长、可重复性 差等问题，需要借鉴苜蓿成熟的组织培养技术，针对炼苗的环境条件(如温度、湿度、光照、基质等)对 组培苗成苗的影响，筛选确定适宜的培养条件，为优良突变体及新品系的扩繁奠定基础。 （3）扁蓿豆为苜蓿属内抗逆性很强的优异二倍体种质材料，在苜蓿抗逆育种中应加强同属内扁蓿 豆抗逆基因资源的利用。长期以来，扁蓿豆育种主要利用常规育种技术，但其选育时间长，育种效率 低。因此，分子设计育种与常规育种技术有效结合，利用扁蓿豆已知基因序列和功能，通过基因定位、 基因聚合、标记追踪等技术，进而筛选出抗性强与产量高聚合于一体的品种。同时可从扁蓿豆中克隆 相关抗逆基因导入苜蓿中，培育抗逆高产苜蓿新品种；但传统的转基因技术由于整合位点不可控、遗 传不稳定等因素也难以发挥作用，故可尝试利用基因编辑技术对苜蓿属牧草进行新型分子育种。 参考文献（略）