卵母细胞冷冻保存 关烨琳17301056014 女性的生殖寿命是有限的,取决于她出生的卵母细胞数量。用化疗药物和盆腔放疗治 疗癌症或其他严重的医学疾病有可能显着加速卵泡闭锁,使需要这些治疗的女性面临 原发性卵巢功能不全的风险。同样,诸如脆性Ⅹ前突变和单体Ⅹ的镶嵌性等遗传条件 也使女性易患原发性卵巢功能不全。在卵巢衰竭发生之前,具有这些风险因素和其他 因素的妇女可能成为保留生育能力的候选人 成熟卵母细胞冷冻保存是目前可用于育龄妇女保留生育力的方法。虽然胚胎低温保存 的体外受精(IVF)是一种既定的保留生育能力的方法。在过去的10年中,已经改进 了用于卵母细胞的超快速冷冻(玻璃化)的方法,其在冷冻保存后优化卵母细胞存 技术原理 冷冻原理:低温冷冻保存的细胞能长期保存而不 丧失活性,其原因是因为细胞内一切新陈代谢过 程中的化学反应被低温所抑制,细胞内所有化学 变化处于一种“暂停”状态而使细胞得以长期保 存。低温保存的细胞以一定方式复苏后,又具有 存活能力。细胞的冷冻保存并不在于能否长期耐 受低温,而是在于冷冻和解冻时对细胞的致死性 作用(致死性温区-50~15℃) 胚胎和卵母细胞在低温冷冻保存过程中的受损机制: 在冷冻过程中,冰晶首先在细胞外液中形成,此时冰晶与溶质分离,使细胞外液浓度升 高、渗透压增加,细胞内水分渗出产生溶液效应。随着温度继续下降,细胞外冰晶不断 形成,未冻结部分的溶液浓度增加,细胞 内外的渗透压差增大。 这时可能发生两种情况:(1)当降温速度 很慢时,胞质内更多的水分有足够的时间 渗出,水分在细胞外冻结,随着细胞外冰 晶的形成,细胞内外形成了较高的渗透压 差,使细胞内水分逐渐减少,细胞内电解 质浓度増高,导致细胞膜蛋白复合体的破 坏和膜的分解。(②)当降温速度很快时, 胞质内水分形成的冰晶使细胞受到物理性的损伤。这个因素影响是胚胎及卵母细胞冷 冻保存的关键。 在-5-15℃细胞内液处于超冷冻状态时,如果细胞尚未充分脱水,一旦结冰,冰晶就会迅 速聚集,释放潜热引起温度瞬间剧增,造成过冷损伤冷冻的卵母细胞或胚胎解冻后可见 到透明带破裂,这主要是由于物质的膨胀率和收缩率不同,这种现象被称作破裂损伤。 卵母细胞或胚胎在冷冻液中平衡或脱出冷冻保护剂时,由于渗透压的急剧变化而引起细 胞过度膨胀或收缩使细胞受到损伤。冷冻还能损伤细胞整体,阻碍极体产生,增加DNA 的不稳定性而导致染色体异常
卵母细胞冷冻保存 关烨琳 17301056014 女性的生殖寿命是有限的，取决于她出生的卵母细胞数量。用化疗药物和盆腔放疗治 疗癌症或其他严重的医学疾病有可能显着加速卵泡闭锁，使需要这些治疗的女性面临 原发性卵巢功能不全的风险。同样，诸如脆性 X 前突变和单体 X 的镶嵌性等遗传条件 也使女性易患原发性卵巢功能不全。在卵巢衰竭发生之前，具有这些风险因素和其他 因素的妇女可能成为保留生育能力的候选人。 成熟卵母细胞冷冻保存是目前可用于育龄妇女保留生育力的方法。虽然胚胎低温保存 的体外受精（IVF）是一种既定的保留生育能力的方法。在过去的 10 年中，已经改进 了用于卵母细胞的超快速冷冻（玻璃化）的方法，其在冷冻保存后优化卵母细胞存 活。 技术原理 冷冻原理：低温冷冻保存的细胞能长期保存而不 丧失活性,其原因是因为细胞内一切新陈代谢过 程中的化学反应被低温所抑制,细胞内所有化学 变化处于一种“暂停”状态而使细胞得以长期保 存。低温保存的细胞以一定方式复苏后,又具有 存活能力。细胞的冷冻保存并不在于能否长期耐 受低温,而是在于冷冻和解冻时对细胞的致死性 作用(致死性温区-50~15℃)。 胚胎和卵母细胞在低温冷冻保存过程中的受损机制： 在冷冻过程中,冰晶首先在细胞外液中形成,此时冰晶与溶质分离,使细胞外液浓度升 高、渗透压增加,细胞内水分渗出产生溶液效应。随着温度继续下降,细胞外冰晶不断 形成,未冻结部分的溶液浓度増加,细胞 内外的渗透压差增大。 这时可能发生两种情况：(1)当降温速度 很慢时,胞质内更多的水分有足够的时间 渗出,水分在细胞外冻结,随着细胞外冰 晶的形成,细胞内外形成了较高的渗透压 差,使细胞内水分逐渐减少,细胞内电解 质浓度増高,导致细胞膜蛋白复合体的破 坏和膜的分解。(2)当降温速度很快时, 胞质内水分形成的冰晶使细胞受到物理性的损伤。这个因素影响是胚胎及卵母细胞冷 冻保存的关键。 在-5-15℃细胞内液处于超冷冻状态时,如果细胞尚未充分脱水,一旦结冰,冰晶就会迅 速聚集,释放潜热引起温度瞬间剧增,造成过冷损伤冷冻的卵母细胞或胚胎解冻后可见 到透明带破裂,这主要是由于物质的膨胀率和收缩率不同,这种现象被称作破裂损伤。 卵母细胞或胚胎在冷冻液中平衡或脱出冷冻保护剂时,由于渗透压的急剧变化而引起细 胞过度膨胀或收缩使细胞受到损伤。冷冻还能损伤细胞整体,阻碍极体产生,增加 DNA 的不稳定性而导致染色体异常
技术应用 STEPS OF EGG FREEZING USING VITRIFICATION 选择成熟 然后将这些蛋 健康的卵 浸泡在蔗糖溶 输卵管 含量井避免形 子房 ○ ① 现在,将这 通过小的穿刺将卵从供体 些蛋转移到 的卵果中取出。 度的液氮 这些卵可在数周或数年后 卵在几秒钟内冻结,然后储存 用于受精 在氮气罐中。 1.排卵诱导 月经周期开始时,通过卵巢刺激的药物使用(卵泡刺激素或人绝经期促性腺激素)刺 激卵巢产生多个卵子。 当卵泡准备好取卵时(通常在8到14天后)注射人绒毛膜促性腺激素使卵子成熟。 2.取卵 进行经阴道超声抽吸以取出卵。在此过程 中,将超声探头插入阴道以识别毛囊。然 后将针引导通过阴道并进入毛囊。连接到 针头的抽吸装置用于从卵泡中取出卵子。 可在约15至20分钟内从卵泡中取出多个 卵 3.冻结 收获未受精卵后不久,它们会冷却到零度 probe 以下的温度,以阻止所有生物活动并保存 以备将来使用。未受精卵的构成使得比受 精卵(胚胎)的构成更加难以冷冻并导致 成功怀孕。称为冷冻保护剂的物质有助于 防止冰冻过程中形成冰晶。 冷冻保护剂主要与两种冷冻方法中的一种 起使用,包括:
技术应用 1.排卵诱导 月经周期开始时，通过卵巢刺激的药物使用（卵泡刺激素或人绝经期促性腺激素）刺 激卵巢产生多个卵子。 当卵泡准备好取卵时（通常在 8 到 14 天后）注射人绒毛膜促性腺激素使卵子成熟。 2.取卵 进行经阴道超声抽吸以取出卵。在此过程 中，将超声探头插入阴道以识别毛囊。然 后将针引导通过阴道并进入毛囊。连接到 针头的抽吸装置用于从卵泡中取出卵子。 可在约 15 至 20 分钟内从卵泡中取出多个 卵。 3.冻结 收获未受精卵后不久，它们会冷却到零度 以下的温度，以阻止所有生物活动并保存 以备将来使用。未受精卵的构成使得比受 精卵（胚胎）的构成更加难以冷冻并导致 成功怀孕。称为冷冻保护剂的物质有助于 防止冰冻过程中形成冰晶。 冷冻保护剂主要与两种冷冻方法中的一种 一起使用，包括：
慢速冻结方法。在该方法中,最初使用低浓度的冷冻保护剂。随着温度逐渐降低并且 蛋的代谢率下降,使用更高浓度的冷冻保护剂。慢速冷冻方法也可用于保护蛋免于暴 露于冷冻保护剂中的毒素。 玻璃化。在该方法中,高初始浓度的冷冻保护剂与冷却组合使用如此之快以至于细胞 内冰晶没有时间形成。 保护措施 1.诱发结晶 溶液在温度达到冰点时不结冰,待降到冰点以下一定温时才结晶,这种现象叫过 冷现象,易对卵母细胞造成损伤。为了防止过冷现象的发生,通常在7℃左右时 通过人工强制诱发结晶,以避免较大冰晶的形成和剧烈的温度变化。诱发结晶主 要在降温速率较慢的冷冻方法中使用。诱发方法有两种:①用液氮预冷过的镊子 夹麦管中部含卵母细胞的冷冻液上部;②在冷冻液中加入制冷剂晶母等 2.使用冷冻保护剂 冷冻保护剂作用原理:当冷冻保护剂渗入到细胞内后,能増加整个细胞的粘度和 细胞内的溶质浓度,使冰晶生长的驱动力减弱,减少冰晶的形成。在浓度增加到 定程度后,整个保存系统可以在相对较慢的冷却速率下形成玻璃化,避免“胞 内冰晶损伤”。此外,保护剂可改变细胞膜通透性,降低细胞内外渗透压差,避免 溶质性损伤”渗透性保护剂渗透性保护剂是一类小分子化合物,因其在冷冻过 程中能够渗透进入胞质内而得名,常用的有甘油(GL)、二甲基亚砜(DMS0、丙二 醇(PROH)、乙二醇等(EG)。该类物质在冷冻过程中进入细胞内部,可以起到以下 作用:①防止细胞因脱水过度收缩:②与水分子发生水合作用,减慢溶液结皛速 度:③稀释胞质中因脱水而产生的高盐,减少盐害作用的产生。 3.非渗透性保护剂 这是一类大分子化合物,能溶于水,但不能渗入细胞,较为常用的有蔗糖、聚蔗 糖、血清等在快速冷冻时,可协助渗透性保护剂促使细胞脱水,减少细胞内冰晶 形成;组成玻璃化液时,可有效降低渗透性保护剂的分子浓度、可使发生玻璃化 的相变温度升髙、可促进胞质及保护液玻璃化;解冻时,为卵母细胞和胚胎提供 个高渗环境,避免水分进入胞内过快而产生的渗透性破裂。 4.玻璃化的保护作用 玻璃化是高浓度的冷冻保护液在低温或超氐温下溶液由液相变为固相时,其内部 的分子、离子分布不改变其原有的分布,不形成有规则外表的物质形态,可有效 避免冰晶形成时对卵母细胞内部骨架结构和亚细胞器膜的牵拉断裂和尖锐刺 伤 技术优缺点 优点 保护因癌症或其治疗而患有不育症的年轻女性的生育能力 为预期在髙龄时怀孕的女性提供了使用冷冻融化的卵子生殖遗传的机会 可以降低患有染色体异常与卵巢非整倍性相关的儿童的风险
•慢速冻结方法。在该方法中，最初使用低浓度的冷冻保护剂。随着温度逐渐降低并且 蛋的代谢率下降，使用更高浓度的冷冻保护剂。慢速冷冻方法也可用于保护蛋免于暴 露于冷冻保护剂中的毒素。 •玻璃化。在该方法中，高初始浓度的冷冻保护剂与冷却组合使用如此之快以至于细胞 内冰晶没有时间形成。 保护措施 1. 诱发结晶 溶液在温度达到冰点时不结冰,待降到冰点以下一定温时才结晶,这种现象叫过 冷现象,易对卵母细胞造成损伤。为了防止过冷现象的发生,通常在 7℃左右时 通过人工强制诱发结晶,以避免较大冰晶的形成和剧烈的温度变化。诱发结晶主 要在降温速率较慢的冷冻方法中使用。诱发方法有两种:①用液氮预冷过的镊子 夹麦管中部含卵母细胞的冷冻液上部;②在冷冻液中加入制冷剂晶母等。 2. 使用冷冻保护剂 冷冻保护剂作用原理:当冷冻保护剂渗入到细胞内后,能増加整个细胞的粘度和 细胞内的溶质浓度,使冰晶生长的驱动力减弱,减少冰晶的形成。在浓度增加到 一定程度后,整个保存系统可以在相对较慢的冷却速率下形成玻璃化,避免“胞 内冰晶损伤”。此外,保护剂可改变细胞膜通透性,降低细胞内外渗透压差,避免 “溶质性损伤”渗透性保护剂渗透性保护剂是一类小分子化合物,因其在冷冻过 程中能够渗透进入胞质内而得名,常用的有甘油(GL)、二甲基亚砜(DMSO)、丙二 醇(PROH)、乙二醇等(EG)。该类物质在冷冻过程中进入细胞内部,可以起到以下 作用:①防止细胞因脱水过度收缩:②与水分子发生水合作用,减慢溶液结皛速 度:③稀释胞质中因脱水而产生的高盐,减少盐害作用的产生。 3. 非渗透性保护剂 这是一类大分子化合物,能溶于水,但不能渗入细胞,较为常用的有蔗糖、聚蔗 糖、血清等在快速冷冻时,可协助渗透性保护剂促使细胞脱水,减少细胞内冰晶 形成;组成玻璃化液时,可有效降低渗透性保护剂的分子浓度、可使发生玻璃化 的相变温度升高、可促进胞质及保护液玻璃化;解冻时,为卵母细胞和胚胎提供 一个高渗环境,避免水分进入胞内过快而产生的渗透性破裂。 4. 玻璃化的保护作用 玻璃化是高浓度的冷冻保护液在低温或超氐温下溶液由液相变为固相时,其内部 的分子、离子分布不改变其原有的分布,不形成有规则外表的物质形态,可有效 避免冰晶形成时对卵母细胞内部骨架结构和亚细胞器膜的牵拉断裂和尖锐刺 伤。 技术优缺点 优点 • 保护因癌症或其治疗而患有不育症的年轻女性的生育能力 • 为预期在高龄时怀孕的女性提供了使用冷冻融化的卵子生殖遗传的机会 • 可以降低患有染色体异常与卵巢非整倍性相关的儿童的风险
对于没有伴侣的女性或对发育中胚胎状态有道德担忧的女性,卵子冷冻可能是 个更好的选择。 缺点 卵巢刺激可引起卵巢过度刺激综合征。轻度至中度卵巢过度刺激综合征包括疲 劳,恶心,头痛,腹痛,乳房胀痛和易怒,但这些不良反应通常可以很好地控 0.1%-2%的患者可能会出现严重的卵巢过度刺激综合征,导致血栓,呼吸短 促,腹痛,脱水和呕吐,需要住院。在极少数情况下,可能导致死亡 受孕的妇女将面临体外受精的风险。这些风险包括多胎妊娠,妊娠相关的高血 压,早产,手术分娩和低出生体重的婴儿
• 对于没有伴侣的女性或对发育中胚胎状态有道德担忧的女性，卵子冷冻可能是 一个更好的选择。 缺点 • 卵巢刺激可引起卵巢过度刺激综合征。轻度至中度卵巢过度刺激综合征包括疲 劳，恶心，头痛，腹痛，乳房胀痛和易怒，但这些不良反应通常可以很好地控 制。 • 0.1％-2％的患者可能会出现严重的卵巢过度刺激综合征，导致血栓，呼吸短 促，腹痛，脱水和呕吐，需要住院。在极少数情况下，可能导致死亡。 • 受孕的妇女将面临体外受精的风险。这些风险包括多胎妊娠，妊娠相关的高血 压，早产，手术分娩和低出生体重的婴儿