实验目的 品中亚硝胺类化合物的重要性 2握比色法测定食品中亚硝胺类化合物的原理及方法 本注挥爱性N一亚硝胺总量的测定方法 根据亚硝胺的物化性质，食品中挥发性亚硝胺采用夹层 保温水蒸气蒸馏： 化 换树脂浓缩，在酸性条件下与对位氨基苯磺酸形成重氮盐进而与N ,可以比色定量 钱7销酸的含量，同样买用亚 硝胺测定中使用的离子交换树脂浓缩，然后再洗脱，进行重氨化偶合反应，比色测定亚硝酸根的含 三、试剂与仪器 1磷酸缓冲液(0.1mo/1、pH7)：吸取0.1mol/几磷酸氢二钠61.0mL和0.1mol/1磷酸二氢钠39.0mL, 混合而成： 2.30%醋酸溶液：3.0.5N氢氧化钠溶液： 4显色试剂： 色剂A-1%对位氮基苯磺酸的30%醋酸溶液： 色剂B-0.2%N-1-萘乙烯 二胺二盐酸盐的30%醋酸溶液： -1%对位氨基苯磺酸的17N盐酸溶液： 显色剂D一1%N一1一萘乙烯二胺二盐酸盐溶液： 6.二乙基亚硝胺标准溶液(100μgml): 钠标准溶液(100μgml) 8强碱性 交换树脂：交链度8，粒度150目： 9.正丁醇饱和的1N氢氧化钠溶液： 10.1%硫酸锌溶液：11.分光光度计；12.紫外灯：BR-69盘形杀菌灯，10W。 四、操作步 挥发性 亚硝胺总量的测定 亚随胺标准线的培养中， 0.08、0.10mL, 可后在紫 长皿中取至的透酸缨冲溶液，使每份反应溶液的总体积达 别加入pH7的 磷酸缓冲溶液，使每份反应 入0.5mL A, 摇后 2)样品 品溶液的 备 样品中亚硝胺的含量称取样品10.0 最后浓度 收集滤液特 定00,移入100mL容量瓶中，加入氢氧化钠溶 入正 ,0g 丁醇饱和的1N氢氧化钠溶液，移入10OmL容 量瓶 挥发 饱过 清液 吸取样品的清 移入蒸馏瓶内进行夹层保温水蒸气蒸 馏 收集2 mL馏 调节至p 行夹层过强 收住 将馏出液在紫外 性离 字型)交换柱(1x 子每管1m入 少量 中力 管收集洗脱液 显色剂不显色为止 整的雀 加入0. 以下操作同标准曲线的绘制。根据测得的光密度，从 3)计算： 总含 挥发性N .亚胺( g)=C/W×1000 式中 一相当于挥发 2.亚硝酸盐的测定 D亚硝酸盐标准曲线的绘制：准确吸取每mL相当于10Qg的亚硝酸钠标准溶液0,0、0.02 004、006.008、010m1 分别移入鱼管中 分别加 容液总体积为9.0ml 加入 0.5mL显色剂C,摇匀后，再加入0.5mL显色剂D,摇匀。分别在分光光度计波长550nm处测定光 度，绘制标准曲线： 2)样品分析： 1样品处理：
一、实验目的 1.了解测定食品中亚硝胺类化合物的重要性； 2.掌握比色法测定食品中亚硝胺类化合物的原理及方法。 二、实验原理 本法是挥发性N－亚硝胺总量的测定方法。根据亚硝胺的物化性质，食品中挥发性亚硝胺采用夹层 保温水蒸气蒸馏纯化挥发性亚硝胺，然后经紫外光照射，分解释放为亚硝酸根。通过强碱性离子交 换树脂浓缩，在酸性条件下与对位氨基苯磺酸形成重氮盐进而与N－萘乙烯二胺二盐酸盐形成红色偶 氮染料。颜色深浅与亚硝胺的含量成正比，因此根据颜色的深浅，可以比色定量。 由于二甲胺与亚硝酸盐在酸性条件下能结合产生亚硝胺。为了了解亚硝酸盐的含量，同样采用亚 硝胺测定中使用的离子交换树脂浓缩，然后再洗脱，进行重氮化偶合反应，比色测定亚硝酸根的含 量。 三、试剂与仪器 1.磷酸缓冲液（0.1mol/L、pH7）：吸取0.1mol/L磷酸氢二钠61.0mL和0.1mol/L磷酸二氢钠39.0mL， 混合而成； 2.30%醋酸溶液； 3.0.5N氢氧化钠溶液； 4.显色试剂： 显色剂A－1％对位氮基苯磺酸的30％醋酸溶液； 显色剂B－0.2%N-1-萘乙烯二胺二盐酸盐的30％醋酸溶液； 显色剂C－1％对位氨基苯磺酸的1.7N盐酸溶液； 显色剂D－1％N－1－萘乙烯二胺二盐酸盐溶液； 5.盐酸溶液（1.7N）； 6.二乙基亚硝胺标准溶液（100 µg/ml）； 7.亚硝酸钠标准溶液（100 µg/ml）； 8.强碱性离子交换树脂：交链度8，粒度150目； 9.正丁醇饱和的1N氢氧化钠溶液； 10.l％硫酸锌溶液； 11.分光光度计； 12.紫外灯：BR-69盘形杀菌灯，10W。 四、操作步骤 1.挥发性N－亚硝胺总量的测定： （1）亚硝胺标准曲线的绘制：准确吸取每毫升为100µg的亚硝胺标准溶液0.0、0.02、0.04、0.06、 0.08、0.10mL，分别移入小培养皿中，并分别加入pH7的磷酸缓冲溶液，使每份反应溶液的总体积达 2.0mL。摇匀后在紫外光下照lmin。按顺序加入0.5mL显色剂A，摇匀后再加0.5mL显色剂B，待溶液 呈玫瑰红色后，分别在分光光度计550nm波长下测定光密度，绘制标准曲线。 （2）样品分析： ⅰ样品溶液的制备： 液体样品－视样品中亚硝胺的含量称取样品10.0－20.0g，移入100mL容量瓶中，加入氢氧化钠溶 液使其最后浓度为1N，摇匀后过滤，收集滤液待测定。 固体样品－取经捣碎或研磨均匀的样品20.0g，加入正丁醇饱和的1N氢氧化钠溶液，移入100mL容 量瓶中，并加至刻度，摇匀，浸饱过夜，离心取清液待测定。 ⅱ挥发性N－亚硝胺的总量的测定：吸取样品的清液50mL，移入蒸馏瓶内进行夹层保温水蒸气蒸 馏，收集25mL馏出液，用30％醋酸调节至pH3－4。再移入蒸馏瓶内进行夹层保温水蒸气蒸馏，收集 25mL馏出液，用0.5N氢氧化钠调至pH7－8。将馏出液在紫外光下照15min，通过强碱性离子（氯离 子型）交换柱(1x0.5cm)浓缩，经少量水洗后，用1mol/L氯化钠溶液洗脱亚硝酸根，分管收集洗脱液 （每管1m1)，至所收集的洗脱液加入显色剂不显色为止。各管中加人1.0ml pH7的磷酸缓冲液、 0.5mL显色剂A，摇匀后再加入0.5mL显色剂B，以下操作同标准曲线的绘制。根据测得的光密度，从 标准曲线中查得每管亚硝胺的含量，汇算总含量。 （3）计算： 挥发性N－亚硝胺（µg/kg）＝C/W×1000 式中 C－相当于挥发性N－亚硝胺标准的量，µg； W－测定时样品溶液相当于样品的量，g。 2.亚硝酸盐的测定： （1）亚硝酸盐标准曲线的绘制：准确吸取每mL相当于100µg的亚硝酸钠标准溶液0.0、0.02、 0.04、0.06、0.08、0.10mL，分别移入比色管中，分别加水使每管反应溶液总体积为9.0mL，加入 0.5mL显色剂C，摇匀后，再加入0.5mL显色剂D，摇匀。分别在分光光度计波长550nm处测定光密 度，绘制标准曲线； （2）样品分析： ⅰ样品处理：
液体样品一称取样品5.00g,用水移入100mL容量瓶中，加入30%氢氧化钠溶液，调节溶液至呈中 性。加入10%硫酸锌溶液0.5mL,加水至刻度，离心除去沉淀，溶液待测定。 固体样品一称取经捣碎或磨碎的样品5.00g,用水移入100mL容量瓶中，在60℃水浴上提取30min, 取出，滴加10%硫酸锌溶液5mL,加水至刻度，离心，除去沉淀，清液待测定： ⅱ亚硝酸盐的测定：吸取上述清液10mL,用氢氧化钠溶液调节溶液至pH7。通过强碱性（氯离子 型)离子交换柱(1x0.5cm)浓缩，经少量水洗后，用1mol/L氯化钠溶液洗脱，每管9mL,收集2-3管， 加入0.5mL显色剂C,摇匀后再加入0.5mL显色剂D,以下操作同标准曲线的绘制。根据测得的光密 度，从标准曲线中查出相应的亚硝酸盐的含量，对照样品用水经树脂交换、洗脱、显色。计算亚硝 亚硝酸盐(mgkg）=CW×1000 式中 C一相当于亚硝酸盐标准的量，mg: W一测定时样品溶液相当于样品的量，g
液体样品－称取样品5.00g，用水移入100mL容量瓶中，加入30%氢氧化钠溶液，调节溶液至呈中 性。加入10%硫酸锌溶液0.5mL，加水至刻度，离心除去沉淀，溶液待测定。 固体样品－称取经捣碎或磨碎的样品5.00g，用水移入100mL容量瓶中，在60℃水浴上提取30min， 取出，滴加10%硫酸锌溶液5mL，加水至刻度，离心，除去沉淀，清液待测定； ⅱ亚硝酸盐的测定：吸取上述清液10mL，用氢氧化钠溶液调节溶液至pH7。通过强碱性（氯离子 型）离子交换柱(1x0.5cm)浓缩，经少量水洗后，用1mol/L氯化钠溶液洗脱，每管9mL，收集2-3管， 加入0.5mL显色剂C，摇匀后再加入0.5mL显色剂D，以下操作同标准曲线的绘制。根据测得的光密 度，从标准曲线中查出相应的亚硝酸盐的含量，对照样品用水经树脂交换、洗脱、显色。计算亚硝 酸盐总含量。 ⅲ计算： 亚硝酸盐（mg/kg）＝C/W×1000 式中 C－相当于亚硝酸盐标准的量，mg； W－测定时样品溶液相当于样品的量，g