实验四黄曲霉毒素B的测定 实验目的 1.了解测定黄曲 岁的音义 2握测定黄曲毒素的原理及方法。 黄曲霉毒素B,在波长365m紫外光下产生蓝紫色荧光，根据其在薄层板上呈现荧光的最低检出量 来测定其含 仪器 程30-60℃：2.己烷 3氯仿：4.乙腈： 5苯 6.甲醇：7.丙酮 8乙醚；9.无水硫酸 杀粉名用。作为黄曲霉露素消择有碳装 石膏：200目 (1)贮备液：配制成浓度为10μgmL的标准贮备液： (2)稀释液1(1ugmL)：取贮备液1mL,置于具塞刻度试管或量简中，加苯一乙腈(982)至 10mL,使用前如容积减少，应补足到原容积，每次使用后应记录剩余的容积，以备复查。此液应避 光并置于冰箱中保存； (3)稀释液Ⅱ(0.2μgmL)：使用和保存方法同上述稀释液I: (4)稀释液Ⅲ(0.04μgmL)：使用和保存方法同上述稀释液I: 15.电热恒温水浴锅：16.紫外灯(100-125W)：滤光板365m:17.振荡器： 18.索氏抽提器：250mL:19.微量注射器：20.分液漏斗：125mL:21蒸发皿：50mL:22.具塞刻 度试管或量筒：10mL:23.层析缸：24.脱脂棉：在索氏浸提器内用氯仿提取2h,挥发干后备用：25 虑纸简：26.薄层板：50×150mm或50×200mm均可。 四、操作步骤 金宽样高：应后提取，如形肉松、火、精肠金粉等可取祥3，春蛋液妙 容积1223的 油的内端塞以 将滤纸简取出，在烧怀中先 不浴 挥发干 角烧瓶中， 以防滴 作 按此塞兰角 有 中保存 发 lmL。 分混 含1500 提取 和 此提 为防挥 加入30nl己样 液5545)100m 下层甲 振荡0.5h, 置30m其月 过已处理的脱脂棉漏斗 mL分液漏斗 加入20mL氯 振摇提 液澄清后 20m 2min.特分层 硫酸钠 2薄层层析 (1)制板和活化：取硅胶一石膏(85：15)，以加倍量水调制，涂成厚度约0.25mm的薄层板，于 100C活化2 (2)点样：先将薄层板周围附着的吸附剂刮尽（否则影响展开整齐），在距薄层板下端3cm的基 线上，按下述点样（点与点之间应保持 点时分多次滴加 加点的大小应相同) 点子扩散后的直径为2-3m 二个点为1号样品溶液20u:第 1号样品溶 ，再滴加黄曲霉毒 素B1 第四个点为2 号样品溶液20μl,再滴加B1标准稀释液Ⅱ(0.2μgmL)10ul。若为一个样品溶液，则在 块薄层板 滴加三个点：第一个点为样品溶液20u:第二个点为样品溶液20ul,再滴加B1标准稀释液10μl,第 三个点为样品溶液20μl,再B1标准稀释液Ⅱ10ul
实验四 黄曲霉毒素B1的测定 一、实验目的 1.了解测定黄曲霉毒素的意义； 2.掌握测定黄曲霉毒素的原理及方法。 二、实验原理 黄曲霉毒素B1在波长365nm紫外光下产生蓝紫色荧光，根据其在薄层板上呈现荧光的最低检出量 来测定其含量。 三、试剂与仪器 1.石油醚：沸程30-60℃； 2.已烷； 3.氯仿； 4.乙腈； 5.苯； 6.甲醇；7.丙酮； 8.乙醚； 9.无水硫酸 钠； 10.硅胶：层析用，200目； 11.石膏：200目，于130℃中烘4h，置于干燥器中备用； 12.5%次氯 酸钠溶液：称取100g漂粉精，加入500mL水，搅匀。另将70g碳酸钠溶于500mL温水中，倒入上述溶 液中，搅匀，澄清，过滤后备用。作为黄曲霉毒素消毒剂用； 13.三氟醋酸； 14.黄曲霉毒素B1标准溶液： （1）贮备液：配制成浓度为10µg/mL的标准贮备液； （2）稀释液Ⅰ（1µg/mL）：取贮备液1mL，置于具塞刻度试管或量筒中，加苯－乙腈（98:2）至 10mL，使用前如容积减少，应补足到原容积，每次使用后应记录剩余的容积，以备复查。此液应避 光并置于冰箱中保存； （3）稀释液Ⅱ（0.2µg/mL）：使用和保存方法同上述稀释液Ⅰ； （4）稀释液Ⅲ（0.04µg/mL）：使用和保存方法同上述稀释液Ⅰ； 15.电热恒温水浴锅； 16.紫外灯（100-125W）：滤光板365nm； 17.振荡器； 18.索氏抽提器：250mL； 19.微量注射器； 20.分液漏斗：125mL； 21.蒸发皿：50mL； 22.具塞刻 度试管或量筒：10mL； 23.层析缸； 24.脱脂棉：在索氏浸提器内用氯仿提取2h，挥发干后备用； 25. 滤纸筒； 26.薄层板：50×150mm或50×200mm均可。 四、操作步骤 1.样品提取 （1）含脂样品：应除油后提取，如花生、肉松、火腿、腊肠、蛋粉等可取样10.0g，霉蛋液则减少 取样量，并加适量无水硫酸钠干燥，放入滤纸筒中，筒的两端塞以少许脱脂棉，置于索氏抽提器 内。于250mL索氏抽提瓶中加入约占瓶容积1/2-2/3的石油醚（一般可加入150ml左右），于80℃不浴 加热除油，浸取时间为8h以上。除油完毕后，将滤纸筒取出，在烧杯中预先挥发干。石油醚即可利 用此装置回收。将除油后的样品小心地移入具塞三角烧瓶中，加数mL水使润湿。准确加入50mL氯仿 同，于瓶塞上加水1滴，盖紧，使瓶口与瓶塞之间有一层水，以防滴漏（以下操作均按此要求，故略 去）。于电动振荡器中振摇30min，加10g无水碳酸钠，静置1h，用脱脂棉过滤于100mL具塞三角瓶 中，取出20mL滤液，置于蒸发皿中，自然挥发干。将装有剩余的三角瓶置于4℃冰箱中保存。在蒸发 皿中的残留物，加入苯－乙腈（98:2）1mL。取带橡皮头的滴管，用其尖端将皿内的内容物充分混 合，吸取上清液置于2mL小瓶中，皿内的不溶残留物可弃去。如上清液不够清彻，可离心10min （1500r/min）。再取上清液置于另一小瓶中，此提取液相当于4g。为防挥发应立即进行薄层层析； （2）含色素样品：应除色素后提取，如豆类、酱类等可取样20g，置于250mL具塞三角烧瓶中， 加入30mL己烷和甲醇－水溶液（55:45）100mL，振荡0.5h，静置30min后，通过已处理的脱脂棉漏斗 过滤于125mL分液漏斗中，待下层甲醇－水溶液澄清后，放出20mL（相当于4g样品），置于另一个 250mL分液漏斗中，加入20mL氯仿，振摇提取2min。待分层后，将下层氯仿经过约10g无水硫酸钠小 漏斗置于蒸发皿中，再加5mL氯仿重复抽提一次，一并收集于蒸发皿中，在65℃水浴锅上挥发干。以 下操作可与上述中蒸发皿中残留物的处理相同； 2.薄层层析： （1）制板和活化：取硅胶－石膏（85:15），以加倍量水调制，涂成厚度约0.25mm的薄层板，于 100℃活化2h后，置于干燥器中备用； （2）点样：先将薄层板周围附着的吸附剂刮尽（否则影响展开整齐），在距薄层板下端3cm的基 线上，按下述点样（点与点之间应保持一定距离，点时分多次滴加，点子扩散后的直径为2-3mm，滴 加点的大小应相同）：第一个点为1号样品溶液20µl；第二个点为1号样品溶液20µl，再滴加黄曲霉毒 素B1（以下简称B1）标准稀释液Ⅲ（0.04µg/mL）10µl；第三个点为2号样品溶液20µl；第四个点为2 号样品溶液20µl，再滴加B1标准稀释液Ⅱ（0.2µg/mL）10µl。若为一个样品溶液，则在一块薄层板上 滴加三个点：第一个点为样品溶液20µl；第二个点为样品溶液20µl，再滴加B1标准稀释液Ⅲ10µl，第 三个点为样品溶液20µl，再B1标准稀释液Ⅱ10µl
(3)展开：第一次用乙醚展开至12cm,取出吹干。第二次用丙酮一氯仿(6：94或8：92)展开 10cm,取出吹干，在紫外灯下观察； (4)观察：在紫外灯下观察，如样品溶液与B1标准稀释液在相同f值的位置上显示蓝紫色荧光， 则需对检样进行确证试验。如在该位置下不显蓝紫色荧光，则表示检样中黄曲霉毒素B1含量在 5μg/kg以下，见下述说明1； (5)确证试验：在薄层板上对样品溶液20μl和B1标准稀释液IⅡ(0.2μgmL)10μl的两点，各加三 氟醋酸1小滴，作用5min后，用电热吹风2min(使到板上温度下不超过40℃)。用上述第二次展开溶 液展开至10c,在紫外灯下观察，在B,标准稀释液的衍生物(R值除至0.1左右)相同位置上，样品 溶液也显示蓝紫色荧光，则为阳性，否则为阴性结果： (6)定量：在薄层板上点B,标准稀释液Ⅲ(0.04μgmL)10μl。同时，根据初算，将样品溶液用 不同稀释度或不同点样量于薄层板上点样，按上法展开，观察，直至样品溶液与标准显示同等荧光 强度时，其含量相当于0.0004μg: 五、计算 黄曲霉毒素B1(ppb)=0.0004/(WV2×V1)×1000 式中W一样品的重量，g: V1一出现同等荧光时所取样品的点样量，L: V2一样品以稀释后的总量，mL。 六、说明 1.样品在B1含量在5(ppb)以下的计算依据：取样10.0g,用50mL氯仿提取，取其20mL浓缩到 1mL,以20ul于薄层板上点样至刚显荧光，则计算如下： 0.0004×1/0.02×50/20×1000/10=5ppb 若按以上样液量点样不显荧光，则样品中B1含量在5ppb以下。 2.受污染的所用玻璃器皿，经5%次氯酸钠溶液浸泡消毒后再清洗之
（3）展开：第一次用乙醚展开至12cm，取出吹干。第二次用丙酮－氯仿（6:94或8:92）展开至 10cm，取出吹干，在紫外灯下观察； （4）观察：在紫外灯下观察，如样品溶液与B1标准稀释液在相同Rf值的位置上显示蓝紫色荧光， 则需对检样进行确证试验。如在该位置下不显蓝紫色荧光，则表示检样中黄曲霉毒素B1含量在 5µg/kg以下，见下述说明1； （5）确证试验：在薄层板上对样品溶液20µl和B1标准稀释液Ⅱ（0.2µg/mL）10µl的两点，各加三 氟醋酸1小滴，作用5min后，用电热吹风2min（使到板上温度下不超过40℃）。用上述第二次展开溶 液展开至10cm，在紫外灯下观察，在B1标准稀释液的衍生物（Rf值除至0.1左右）相同位置上，样品 溶液也显示蓝紫色荧光，则为阳性，否则为阴性结果； （6）定量：在薄层板上点B1标准稀释液Ⅲ（0.04µg/mL）10µl。同时，根据初算，将样品溶液用 不同稀释度或不同点样量于薄层板上点样，按上法展开，观察，直至样品溶液与标准显示同等荧光 强度时，其含量相当于0.0004µg。 五、计算 黄曲霉毒素B1（ppb）＝0.0004/(W/V2×V1)×1000 式中 W－样品的重量，g； V1－出现同等荧光时所取样品的点样量，mL； V2－样品以稀释后的总量，mL。 六、说明 1.样品在B1含量在5（ppb）以下的计算依据：取样10.0g，用50mL氯仿提取，取其20mL浓缩到 1mL，以20µl于薄层板上点样至刚显荧光，则计算如下： 0.0004×1/0.02×50/20×1000/10＝5ppb 若按以上样液量点样不显荧光，则样品中B1含量在5ppb以下。 2.受污染的所用玻璃器皿，经5%次氯酸钠溶液浸泡消毒后再清洗之