生物技术概论 第4章发酵工程 习题与参考答案 一、名词解释 1.发酵工程：发酵工程(fermentation engineering)是指通过现代工程技术手段，利用 微生物（动、植物细胞）的某些特定的功能，通过大规模生产获得人类所需要的有益产品， 或者直接将微生物应用于工业化生产过程，获得某种特定产物的工程技术。发酵工程内容包 括菌种的选育、培养基的配制、灭菌、种子的扩大培养、发酵过程及控制和产物的提取纯化 等方面。 2.自然育种：自然育种即自然选育(natural selection)是指在生产过程中，不经过人工 处理，利用菌种的自发突变，从而选育出优良菌种的一种育种方法。 3.诱变育种：诱变育种(mutation breeding)是指以诱变剂诱发微生物基因突变，通过 筛选突变体，寻找正向突变菌株的一种育种方法。 4.杂交育种：杂交育种(hybridization breeding)是指不同基因型的品系或种属间，通 过交配或体细胞融合等手段形成杂合体，或者是通过转化和转导形成重组体，再从这些杂合 体或重组体或它们的后代中筛选优良菌种的一种育种方法。 5.代谢控制育种：代谢控制育种(metabolic control breeding)是指以生物化学和遗传学为 基础，研究代谢产物的生物合成途径和代谢调节的机制，选择巧妙的技术路线，通过遗传育 种技术而获得解除或绕过了微生物正常代谢途径的突变株，从而人为地实现有用产物选择性 地大量合成积累的一种育种方法。 6.基因工程育种：基因工程育种(genetic engineering breeding)是指利用基因工程方法 对生产菌株进行改造而获得高产工程菌，或者是通过微生物间的转基因而获得新菌种的一种 育种方法。 7.发酵工程的上游技术：发酵工程的上游技术(upstream processing of fermentation engineering)是指采用一种或多种技术手段选育优良菌种，确定优良菌种的营养条件和发酵 条件（温度、气体、pH)的技术。其中上游技术包括优良菌株的选育，最适发酵条件(pH、 温度、溶氧和营养组成)的确定，营养物的准备等。它由许多单元操作组成，一般而言可分 为优良菌种的选育、最适发酵条件的确定和营养物质的准备等三个方面。 &.发酵工程中游技术：发酵工程中游技术(middle stream processing of fermentation engineering)是指在最适发酵条件下，发酵罐中大量培养细胞和生产代谢产物的工艺技术
生物技术概论 第4章 发酵工程 习题与参考答案 一、名词解释 1. 发酵工程：发酵工程（fermentation engineering）是指通过现代工程技术手段，利用 微生物（动、植物细胞）的某些特定的功能，通过大规模生产获得人类所需要的有益产品， 或者直接将微生物应用于工业化生产过程，获得某种特定产物的工程技术。发酵工程内容包 括菌种的选育、培养基的配制、灭菌、种子的扩大培养、发酵过程及控制和产物的提取纯化 等方面。 2. 自然育种：自然育种即自然选育（natural selection）是指在生产过程中，不经过人工 处理，利用菌种的自发突变，从而选育出优良菌种的一种育种方法。 3. 诱变育种：诱变育种（mutation breeding）是指以诱变剂诱发微生物基因突变，通过 筛选突变体，寻找正向突变菌株的一种育种方法。 4. 杂交育种：杂交育种（hybridization breeding）是指不同基因型的品系或种属间，通 过交配或体细胞融合等手段形成杂合体，或者是通过转化和转导形成重组体，再从这些杂合 体或重组体或它们的后代中筛选优良菌种的一种育种方法。 5. 代谢控制育种：代谢控制育种(metabolic control breeding)是指以生物化学和遗传学为 基础，研究代谢产物的生物合成途径和代谢调节的机制，选择巧妙的技术路线，通过遗传育 种技术而获得解除或绕过了微生物正常代谢途径的突变株，从而人为地实现有用产物选择性 地大量合成积累的一种育种方法。 6. 基因工程育种：基因工程育种（genetic engineering breeding）是指利用基因工程方法 对生产菌株进行改造而获得高产工程菌，或者是通过微生物间的转基因而获得新菌种的一种 育种方法。 7. 发酵工程的上游技术：发酵工程的上游技术（upstream processing of fermentation engineering）是指采用一种或多种技术手段选育优良菌种，确定优良菌种的营养条件和发酵 条件（温度、气体、pH）的技术。其中上游技术包括优良菌株的选育，最适发酵条件（pH、 温度、溶氧和营养组成）的确定，营养物的准备等。它由许多单元操作组成，一般而言可分 为优良菌种的选育、最适发酵条件的确定和营养物质的准备等三个方面。 8. 发酵工程中游技术：发酵工程中游技术（middle stream processing of fermentation engineering）是指在最适发酵条件下，发酵罐中大量培养细胞和生产代谢产物的工艺技术
生物技术概论 主要包括下列内容：发酵开始前对发酵原料和发酵罐以及各种连接管道进行灭菌的技术：在 发酵过程中不断向发酵罐中通入干燥无菌空气的空气过滤技术：在发酵过程中根据细胞生长 要求控制加料速度的计算机控制技术：还有种子培养和生产培养的不同的工艺技术。 9.发酵工程下游技术：发酵工程下游技术(downstream processing of fermentation engineering)是指从发酵液或者培养液中分离、精制发酵代谢产物或次生代谢产物或者菌体 的技术，它是由许多单元操作组成，根据最终目的的不同，发酵产品的下游技术中各个单元 操作的组合也有所差异。一般而言，发酵工程下游加工过程分为发酵液（培养液）的预处理 和固液分离、初步纯化、精制和成品加工等四个阶段。 二、简要回答 1.简述微生物发酵的历史进程及对人们的启示。 微生物发酵历史进程分为以下三个阶段：完全依靠经验性操作进行的酿醋酒等萌芽阶段： 利用显微镜观测到微生物存在和通气搅拌发酵技术建立的近代生物学阶段：基于DNA结构 的发现和遗传学的发展的现代生物学阶段。 对于人类的启示：随着科技水平的不断发展，人类认识微生物的手段和能力会不断的提 高。由初始的肉眼无法看到微生物细胞，到借助显微镜的发现，让人类认识细小微生物成为 了可能，人类对于微生物发酵的认识从萌芽阶段到近代生物学阶段发生一次质的飞越。正是 由于科技的进步，通过对X射线衍射仪获得DNA结构图谱的分析，人类获得了DNA的双 螺旋结构，使得人类对于微生物发酵的认识进入了分子水平，通过对基因水平的变化来研究 和解释微生物生理学和形态学上的变化。 总之，随着科技进步，人类的对于微生物发酵的认识也会不断的深入，其应用范围及对 人类的生产生活的影响也会越来越广泛。 2.微生物育种技术及其发展趋势。 自然选育是指在生产过程中，不经过人工处理，利用菌种的自发突变，从而选育出优良 菌种的一种育种方法。通过自然选育提高菌种生产能力、筛选高产菌株的效率较低，效果不 明显。因此，在生产实践中，自然选育的主要目的是用来纯化、复壮和稳定菌种。 诱变育种是指以诱变剂诱发微生物基因突变，通过筛选突变体，寻找正向突变菌株的一 种育种方法。除了这种传统的诱变剂之外，近年来涌现出超高压、高能电子流、磁场、热诱 变及超声波等新型微生物诱变技术，在突变株中筛选目的菌株仍面临工作量大、耗资、耗时 等缺点，急需建立高通量的筛选方法，大部分物理诱变的作用机理尚不明确，选育工作具有 一定的盲目性。即便如此，因诱变育种技术具有简单、快速、有效等优点，至今仍被广泛使
生物技术概论 主要包括下列内容：发酵开始前对发酵原料和发酵罐以及各种连接管道进行灭菌的技术；在 发酵过程中不断向发酵罐中通入干燥无菌空气的空气过滤技术；在发酵过程中根据细胞生长 要求控制加料速度的计算机控制技术；还有种子培养和生产培养的不同的工艺技术。 9. 发酵工程下游技术：发酵工程下游技术（downstream processing of fermentation engineering）是指从发酵液或者培养液中分离、精制发酵代谢产物或次生代谢产物或者菌体 的技术，它是由许多单元操作组成，根据最终目的的不同，发酵产品的下游技术中各个单元 操作的组合也有所差异。一般而言，发酵工程下游加工过程分为发酵液（培养液）的预处理 和固液分离、初步纯化、精制和成品加工等四个阶段。 二、简要回答 1. 简述微生物发酵的历史进程及对人们的启示。 微生物发酵历史进程分为以下三个阶段：完全依靠经验性操作进行的酿醋酒等萌芽阶段； 利用显微镜观测到微生物存在和通气搅拌发酵技术建立的近代生物学阶段；基于 DNA 结构 的发现和遗传学的发展的现代生物学阶段。 对于人类的启示：随着科技水平的不断发展，人类认识微生物的手段和能力会不断的提 高。由初始的肉眼无法看到微生物细胞，到借助显微镜的发现，让人类认识细小微生物成为 了可能，人类对于微生物发酵的认识从萌芽阶段到近代生物学阶段发生一次质的飞越。正是 由于科技的进步，通过对 X 射线衍射仪获得 DNA 结构图谱的分析，人类获得了 DNA 的双 螺旋结构，使得人类对于微生物发酵的认识进入了分子水平，通过对基因水平的变化来研究 和解释微生物生理学和形态学上的变化。 总之，随着科技进步，人类的对于微生物发酵的认识也会不断的深入，其应用范围及对 人类的生产生活的影响也会越来越广泛。 2. 微生物育种技术及其发展趋势。 自然选育是指在生产过程中，不经过人工处理，利用菌种的自发突变，从而选育出优良 菌种的一种育种方法。通过自然选育提高菌种生产能力、筛选高产菌株的效率较低，效果不 明显。因此, 在生产实践中, 自然选育的主要目的是用来纯化、复壮和稳定菌种。 诱变育种是指以诱变剂诱发微生物基因突变，通过筛选突变体，寻找正向突变菌株的一 种育种方法。除了这种传统的诱变剂之外，近年来涌现出超高压、高能电子流、磁场、热诱 变及超声波等新型微生物诱变技术，在突变株中筛选目的菌株仍面临工作量大、耗资、耗时 等缺点，急需建立高通量的筛选方法，大部分物理诱变的作用机理尚不明确，选育工作具有 一定的盲目性。即便如此，因诱变育种技术具有简单、快速、有效等优点，至今仍被广泛使
生物技术概论 用。对于遗传背景不很清楚的菌株，诱变育种更是可行的有效手段。 杂交育种是指不同基因型的品系或种属间，通过交配或体细胞融合等手段形成杂合体， 或者是通过转化和转导形成重组体，再从这些杂合体或重组体或它们的后代中筛选优良菌种 的一种育种方法。近年涌现出基于微流控芯片的融合技术和高通量细胞融合芯片技术等多种 新型的融合技术，将微电极阵列和微通道网络结合到生物芯片之上，得到的微流控系统可实 现大量异种细胞间的可控融合，极大的提高融合的效率。 代谢控制育种是指以生物化学和遗传学为基础，研究代谢产物的生物合成途径和代谢调 节的机制，选择巧妙的技术路线，通过遗传育种技术而获得解除或绕过了微生物正常代谢途 径的突变株，从而人为地实现有用产物选择性地大量合成积累的一种育种方法。近年来代谢 控制育种与杂交育种结合在一起，在氨基酸、抗生素高产菌的选育中得到了广泛的应用。 基因工程育种是指利用基因工程方法对生产菌株进行改造而获得高产工程菌，或者是 通过微生物间的转基因而获得新菌种的一种育种方法。与其他育种技术相比，基因工程育种 技术是按照人们事先设计和控制的方法进行育种，成为真正意义上的理性选育，生产的药物、 疫苗、单克隆抗体及诊断试剂等己有几十种产品批准上市，而且可以提高氨基酸、工业酶制 剂以及头孢菌素C等产量，也能改造传统的发酵工艺。 3.简要叙述发酵过程优化原理及控制技术 综合运用微生物反应计量学、生化反应和传递动力学、生物反应器工程及代谢工程理论， 采取微生物反应计量学的培养环境优化技术、微生物代谢特性的分阶段培养技术、反应动力 学模型的优化技术、代谢通量分析的优化技术和系统观点的生物反应系统优化技术以及其他 技术，获得高产量（便于下游处理）、高底物转化率（降低原料成本）和高生产强度（缩短 发酵周期)的相对统一的发酵过程优化理论。 其控制技术主要有： (1)基于微生物反应原理（包括底物的运输、胞内生化反应和产物的排出过程），研究 微生物从培养基中摄取营养物质的情况和营养物质通过代谢途径转化后的去向，确定不同环 境条件对微生物生长和代谢产物分布的影响，进而优化微生物生长的物理和化学环境，保证 微生物生长处于最适的环境条件下，为进一步的发酵过程优化奠定基础的培养环境优化技术： (2)通过分析不同温度、不同pH值、不同搅拌转速（剪切）和不同溶解氧浓度下目 标代谢产物的动力学参数（包括比生长速率、比底物的消耗速率和比产物形成速率）及流变 学参数的变化特性，提出分阶段溶解氧和搅拌转速控制策略、分阶段温度控制策略及分阶段 pH值控制策略，将环境条件控制在最适合细胞生长或最适合产物合成的水平的分阶段培养
生物技术概论 用。对于遗传背景不很清楚的菌株, 诱变育种更是可行的有效手段。 杂交育种是指不同基因型的品系或种属间，通过交配或体细胞融合等手段形成杂合体， 或者是通过转化和转导形成重组体，再从这些杂合体或重组体或它们的后代中筛选优良菌种 的一种育种方法。近年涌现出基于微流控芯片的融合技术和高通量细胞融合芯片技术等多种 新型的融合技术，将微电极阵列和微通道网络结合到生物芯片之上, 得到的微流控系统可实 现大量异种细胞间的可控融合，极大的提高融合的效率。 代谢控制育种是指以生物化学和遗传学为基础，研究代谢产物的生物合成途径和代谢调 节的机制，选择巧妙的技术路线，通过遗传育种技术而获得解除或绕过了微生物正常代谢途 径的突变株，从而人为地实现有用产物选择性地大量合成积累的一种育种方法。近年来代谢 控制育种与杂交育种结合在一起，在氨基酸、抗生素高产菌的选育中得到了广泛的应用。 基因工程育种是指利用基因工程方法对生产菌株进行改造而获得高产工程菌，或者是 通过微生物间的转基因而获得新菌种的一种育种方法。与其他育种技术相比，基因工程育种 技术是按照人们事先设计和控制的方法进行育种，成为真正意义上的理性选育，生产的药物、 疫苗、单克隆抗体及诊断试剂等已有几十种产品批准上市，而且可以提高氨基酸、工业酶制 剂以及头孢菌素C等产量，也能改造传统的发酵工艺。 3. 简要叙述发酵过程优化原理及控制技术 综合运用微生物反应计量学、生化反应和传递动力学、生物反应器工程及代谢工程理论， 采取微生物反应计量学的培养环境优化技术、微生物代谢特性的分阶段培养技术、反应动力 学模型的优化技术、代谢通量分析的优化技术和系统观点的生物反应系统优化技术以及其他 技术，获得高产量（便于下游处理）、高底物转化率（降低原料成本）和高生产强度（缩短 发酵周期）的相对统一的发酵过程优化理论。 其控制技术主要有： （1）基于微生物反应原理（包括底物的运输、胞内生化反应和产物的排出过程），研究 微生物从培养基中摄取营养物质的情况和营养物质通过代谢途径转化后的去向，确定不同环 境条件对微生物生长和代谢产物分布的影响，进而优化微生物生长的物理和化学环境，保证 微生物生长处于最适的环境条件下，为进一步的发酵过程优化奠定基础的培养环境优化技术； （2）通过分析不同温度、不同 pH 值、不同搅拌转速（剪切）和不同溶解氧浓度下目 标代谢产物的动力学参数（包括比生长速率、比底物的消耗速率和比产物形成速率）及流变 学参数的变化特性，提出分阶段溶解氧和搅拌转速控制策略、分阶段温度控制策略及分阶段 pH 值控制策略，将环境条件控制在最适合细胞生长或最适合产物合成的水平的分阶段培养
生物技术概论 技术： (3)研究不同目标代谢产物发酵过程的反应动力学，应用统计热力学理论和功能单元 扩展理论，建立目标代谢产物分批发酵过程的目标发酵产物发酵动力学模型评价技术： (4)参考己知的生化反应计量关系和特定微生物的代谢途径和生理代谢特征，构建生 物合成特定目标代谢产物的代谢网络的代谢通量分析的发酵过程优化技术： (5)将生物反应视为一个系统，从优化系统内部各要素的功能和相互间的关系、系统 与环境的联系入手，对所构建的系统采用定性或定量的模型优化技术，使系统的结构、性能 和状态达到最优的生物反应系统优化技术。 4.简述发酵过程优化的数理方法 发酵过程优化是通过对发酵过程中的微生物（动植物细胞）的营养组分、培养条件和其 他因素的数理水平上的寻优，以期获得最大量菌体（动植物细胞）或发酵代谢产物的过程。 实现发酵过程优化的数理方法具有包括： (1)正交设计。这是指利用正交表来安排与分析多因素试验的一种设计方法，它从试 验的全部水平组合中，挑选出部分具有代表性的水平组合进行试验，通过这部分试验的结果 的分析了解全面试验的情况，找出最优的水平组合。这种试验设计方法在20世纪80年代末 至本世纪初被广泛使用。其缺陷在于不能在一定的试验范围内，根据所得样本数据去确定变 量间的相互关系及其相应的回归方程。 (2)回归设计（亦称响应面设计）。这是指在因子空间中选择适当的试验点，以较少的 试验处理建立一个有效的多项式回归方程，从而解决生产中的最优化问题，寻找试验指标与 各因子的定量规律。按照类型可分为有回归的正交设计、旋转设计、最优设计、均匀设计和 混料设计等：按照次数可分为一次回归设计和二次回归设计等。这种方法于21世纪初被广 泛使用在发酵工程优化研究之中。 (3)遗传算法。这是模拟达尔文生物进化论的自然选择和遗传学机理的生物进化过程 的计算模型，基于自然选择，驱动生物进化的过程中约束和无约束优化问题的最优解的方法。 其实质是根据“生存竞争”和“优胜劣汰”的原则，借助复制、交叉、变异等操作，使要解 决的问题一步步逼近最优解或近优解。 (4)人工神经网络。这是指基于生物神经网络的结构与功能的计算模型。它是由各个 神经元或节点（称为处理单元）彼此相互连接构成的复杂网络系统，是一种并行分布式信息 处理结构。它可以通过隐含层神经元节点自主学习和适应输入变量和输出变量之间大规模复 杂的非线性关系，由于其具有模拟人脑神经网络的功能，避免了传统回归模型需要事先假设
生物技术概论 技术； （3）研究不同目标代谢产物发酵过程的反应动力学，应用统计热力学理论和功能单元 扩展理论，建立目标代谢产物分批发酵过程的目标发酵产物发酵动力学模型评价技术； （4）参考已知的生化反应计量关系和特定微生物的代谢途径和生理代谢特征，构建生 物合成特定目标代谢产物的代谢网络的代谢通量分析的发酵过程优化技术； （5）将生物反应视为一个系统，从优化系统内部各要素的功能和相互间的关系、系统 与环境的联系入手，对所构建的系统采用定性或定量的模型优化技术，使系统的结构、性能 和状态达到最优的生物反应系统优化技术。 4. 简述发酵过程优化的数理方法 发酵过程优化是通过对发酵过程中的微生物（动植物细胞）的营养组分、培养条件和其 他因素的数理水平上的寻优，以期获得最大量菌体（动植物细胞）或发酵代谢产物的过程。 实现发酵过程优化的数理方法具有包括： （1）正交设计。这是指利用正交表来安排与分析多因素试验的一种设计方法，它从试 验的全部水平组合中，挑选出部分具有代表性的水平组合进行试验，通过这部分试验的结果 的分析了解全面试验的情况，找出最优的水平组合。这种试验设计方法在 20 世纪 80 年代末 至本世纪初被广泛使用。其缺陷在于不能在一定的试验范围内，根据所得样本数据去确定变 量间的相互关系及其相应的回归方程。 （2）回归设计（亦称响应面设计）。这是指在因子空间中选择适当的试验点，以较少的 试验处理建立一个有效的多项式回归方程，从而解决生产中的最优化问题，寻找试验指标与 各因子的定量规律。按照类型可分为有回归的正交设计、旋转设计、最优设计、均匀设计和 混料设计等；按照次数可分为一次回归设计和二次回归设计等。这种方法于 21 世纪初被广 泛使用在发酵工程优化研究之中。 （3）遗传算法。这是模拟达尔文生物进化论的自然选择和遗传学机理的生物进化过程 的计算模型，基于自然选择，驱动生物进化的过程中约束和无约束优化问题的最优解的方法。 其实质是根据“生存竞争”和“优胜劣汰”的原则，借助复制、交叉、变异等操作，使要解 决的问题一步步逼近最优解或近优解。 （4）人工神经网络。这是指基于生物神经网络的结构与功能的计算模型。它是由各个 神经元或节点（称为处理单元）彼此相互连接构成的复杂网络系统，是一种并行分布式信息 处理结构。它可以通过隐含层神经元节点自主学习和适应输入变量和输出变量之间大规模复 杂的非线性关系，由于其具有模拟人脑神经网络的功能，避免了传统回归模型需要事先假设
生物技术概论 的缺点，因此比较适合于多因素和复杂非线性关系的处理等。其目的在于模拟大脑的某些机 理与机制，实现某个方面的功能。这种方法在二十一世纪初被逐步应用于发酵工程优化研究 之中。 三、拓展讨论 1.冰冻干燥在生物制药中的应用。 [思路提示]通过查阅文献资料，可从下面三个方面（可自由扩展）进行讨论： (1)冰冻干燥技术特点： (2)生物药品的热敏性特点对干燥技术的要求： (3)冰冻干燥的生物药品种类，比如各种蛋白质类、多肤类、酶类、多糖类药品以及 血清、疫苗、抗毒素等。 2.人工神经网络在发酵过程优化中的应用 [思路提示]通过查阅文献资料，可从下面四个方面（可自由扩展）进行讨论： (1)发酵过程营养条件的优化： (2)发酵过程培养条件的优化： (3)发酵过程菌体浓度的优化： (4)发酵过程产率的优化。 (上海大学刘战民)
生物技术概论 的缺点，因此比较适合于多因素和复杂非线性关系的处理等。其目的在于模拟大脑的某些机 理与机制，实现某个方面的功能。这种方法在二十一世纪初被逐步应用于发酵工程优化研究 之中。 三、拓展讨论 1. 冰冻干燥在生物制药中的应用。 [思路提示] 通过查阅文献资料，可从下面三个方面（可自由扩展）进行讨论： （1）冰冻干燥技术特点； （2）生物药品的热敏性特点对干燥技术的要求； （3）冰冻干燥的生物药品种类，比如各种蛋白质类、多肤类、 酶类、多糖类药品以及 血清、疫苗、抗毒素等。 2. 人工神经网络在发酵过程优化中的应用 [思路提示] 通过查阅文献资料，可从下面四个方面（可自由扩展）进行讨论： （1）发酵过程营养条件的优化； （2）发酵过程培养条件的优化； （3）发酵过程菌体浓度的优化； （4）发酵过程产率的优化。 （上海大学 刘战民）