第4章延伸阅读 延伸阅读4-1通气搅拌好气性发酵技术 一、通气搅拌好气性发酵技术起源 1893年植物学家M.Wehmer发现青霉菌可以将蔗糖转变为柠檬酸，之后J.A.Martin发 现发酵糖也能转变成柠檬酸，当时人们还不知道如何将这种超前的思想进行商业化生产柠檬 酸。直到1919年，辉瑞公司的食品化学家J.Currie在有16年实验室熟练经验的助手J.Kane 的帮助下，尝试在大型浅盘培养黑曲霉生产柠檬酸获得了一些成功。通过将大型浅盘切割成 小型浅盘培养霉菌，产量极速提高。这是因为在20世纪初，柠檬酸广泛用于食品和软饮料， 比如备受大家欢迎的可口可乐和百事可乐。当时美国是柠檬酸消费的最大市场，柠檬酸是通 过进口国外的柠檬直接发酵获得。但是第一次世界大战的爆发，切断了国外柠檬的进口，作 为当时食品化学品的小型供应商的辉瑞公司积极寻求降低或替代进口柠檬生产柠檬酸的方 法。 经过几年的不懈努力，辉瑞公司的J.Currie和J.Kane建立实验室黑曲霉发酵蔗糖生产 柠檬酸的工艺。由于黑曲霉的好氧菌的特性，公司采取浅盘发酵(surface fermentation)方 法限制了柠檬酸的产量。最终，】.Kane和公司生化专家A.Finlay采取向发酵醪鼓入气泡， 同时增加电动搅拌器进行机械搅拌的方式成功的解决了溶氧问题，标志着人类通气搅拌好气 性发酵技术的诞生。辉瑞将实验工厂的这种柠檬酸发酵工艺用于商业化大规模柠檬酸生产， 使得柠檬酸的成本由最初的每磅1.25美元将至不足0.2美元。这不仅成就了辉瑞柠檬酸生产 之王的地位，而且在1944年6月6日第二次世界大战中，供应给盟军士兵的青霉素有90% 都是辉瑞公司生产，使得辉瑞公司成为生化制药商业巨头。 二、通气搅拌好气性发酵设备分类 通气搅拌好气性发掘技术的核心就是将空气不断通入到发酵液中，供给微生物所需的氧 气，气泡越小，气液接触面积越大，氧气的溶解速率也越快，氧气的利用率也越搞，产品的 产率也就越大。随着机械加工技术和流体力学的不断发展，通气搅拌好气性发酵技术获得了 长足的发展，主要通过发酵罐设备构造的不同实现通气搅拌好气性发酵，当前主要的设备分 为以下几类： (一)机械搅拌发酵罐 机械搅拌发酵罐是发酵工厂常用类型之一，适用于多种生物制品的生产，它是利用机械 搅拌器的作用，将空气和发酵醪重发混合促使氧气在醪液中溶解，以供给微生物生长繁殖
第 4 章延伸阅读 延伸阅读 4-1 通气搅拌好气性发酵技术 一、通气搅拌好气性发酵技术起源 1893 年植物学家 M. Wehmer 发现青霉菌可以将蔗糖转变为柠檬酸，之后 J.A. Martin 发 现发酵糖也能转变成柠檬酸，当时人们还不知道如何将这种超前的思想进行商业化生产柠檬 酸。直到 1919 年，辉瑞公司的食品化学家 J. Currie 在有 16 年实验室熟练经验的助手 J. Kane 的帮助下，尝试在大型浅盘培养黑曲霉生产柠檬酸获得了一些成功。通过将大型浅盘切割成 小型浅盘培养霉菌，产量极速提高。这是因为在 20 世纪初，柠檬酸广泛用于食品和软饮料， 比如备受大家欢迎的可口可乐和百事可乐。当时美国是柠檬酸消费的最大市场，柠檬酸是通 过进口国外的柠檬直接发酵获得。但是第一次世界大战的爆发，切断了国外柠檬的进口，作 为当时食品化学品的小型供应商的辉瑞公司积极寻求降低或替代进口柠檬生产柠檬酸的方 法。 经过几年的不懈努力，辉瑞公司的 J. Currie 和 J. Kane 建立实验室黑曲霉发酵蔗糖生产 柠檬酸的工艺。由于黑曲霉的好氧菌的特性，公司采取浅盘发酵（surface fermentation）方 法限制了柠檬酸的产量。最终，J. Kane 和公司生化专家 A. Finlay 采取向发酵醪鼓入气泡， 同时增加电动搅拌器进行机械搅拌的方式成功的解决了溶氧问题，标志着人类通气搅拌好气 性发酵技术的诞生。辉瑞将实验工厂的这种柠檬酸发酵工艺用于商业化大规模柠檬酸生产， 使得柠檬酸的成本由最初的每磅 1.25 美元将至不足 0.2 美元。这不仅成就了辉瑞柠檬酸生产 之王的地位，而且在 1944 年 6 月 6 日第二次世界大战中，供应给盟军士兵的青霉素有 90% 都是辉瑞公司生产，使得辉瑞公司成为生化制药商业巨头。 二、通气搅拌好气性发酵设备分类 通气搅拌好气性发掘技术的核心就是将空气不断通入到发酵液中，供给微生物所需的氧 气，气泡越小，气液接触面积越大，氧气的溶解速率也越快，氧气的利用率也越搞，产品的 产率也就越大。随着机械加工技术和流体力学的不断发展，通气搅拌好气性发酵技术获得了 长足的发展，主要通过发酵罐设备构造的不同实现通气搅拌好气性发酵，当前主要的设备分 为以下几类： （一）机械搅拌发酵罐 机械搅拌发酵罐是发酵工厂常用类型之一，适用于多种生物制品的生产，它是利用机械 搅拌器的作用，将空气和发酵醪重发混合促使氧气在醪液中溶解，以供给微生物生长繁殖
生产生物产品所需的氧气。 (二)射流式好氧发酵罐 与常规的机械搅拌发酵罐不同之处在于，这种发酵罐利用射流混合搅拌装置替代机械搅 拌装置，充分利用压缩空气能量，进行气-液射流混合搅拌，提高溶氧系数，降低能耗，简 化设备，提高单位产量。比如伍氏发酵罐。 (三)气升式发酵罐 气升式发酵罐是通过压缩空气进入空气分布器进入液体后，形成的气泡通过液体的剧烈 翻动而分散均匀，使液体在内部形成定向循环流动，从而提供微生物生长繁殖和生产发酵产 品所需的氧气，具有较高的溶氧系数和溶氧效率以及剪切力小，对生物细胞损伤小的特点， 已经广泛用于生物废料处理。 (四)自吸式发酵罐 自吸式发酵罐不需要空气压缩机提供压缩空气，依靠特设的机械搅拌吸气装置或液体喷 射吸气装置吸入无菌空气并同时实现混合搅拌与溶氧传质的发酵罐，主要用于生产单细胞蛋 白，酵母，醋酸发酵和维生素生产。 三、好气性发酵技术的应用进展 传统的射流式好氧发酵罐和气升式发酵罐都需要一个供给压缩空气的设备，导致动力消 耗较大，在空气净化过程需要复杂的去除压缩空气中夹带的水雾和油雾的空气净化系统。机 械搅拌发酵罐传热传质性能较好，固体颗粒悬浮性好，但考虑到其气体利用能力不足，需要 增加气体压缩机对未反应的循环气体进行处理，增加了操作成本。然而，自吸式发酵罐因其 相比于上述的传统发酵罐的在溶氧、节能、传质方面的显著优势正受到越来越多发酵相关企 业的重视，国内发酵行业各个生产企业也在用自吸式发酵罐逐步代替传统发酵罐，随着装置 和材料的不断改进，自吸式发酵罐必将向高产、高效、低能耗的方向发展
生产生物产品所需的氧气。 （二）射流式好氧发酵罐 与常规的机械搅拌发酵罐不同之处在于，这种发酵罐利用射流混合搅拌装置替代机械搅 拌装置，充分利用压缩空气能量，进行气-液射流混合搅拌，提高溶氧系数，降低能耗，简 化设备，提高单位产量。比如伍氏发酵罐。 （三）气升式发酵罐 气升式发酵罐是通过压缩空气进入空气分布器进入液体后，形成的气泡通过液体的剧烈 翻动而分散均匀，使液体在内部形成定向循环流动，从而提供微生物生长繁殖和生产发酵产 品所需的氧气，具有较高的溶氧系数和溶氧效率以及剪切力小，对生物细胞损伤小的特点， 已经广泛用于生物废料处理。 （四）自吸式发酵罐 自吸式发酵罐不需要空气压缩机提供压缩空气，依靠特设的机械搅拌吸气装置或液体喷 射吸气装置吸入无菌空气并同时实现混合搅拌与溶氧传质的发酵罐，主要用于生产单细胞蛋 白，酵母，醋酸发酵和维生素生产。 三、好气性发酵技术的应用进展 传统的射流式好氧发酵罐和气升式发酵罐都需要一个供给压缩空气的设备，导致动力消 耗较大，在空气净化过程需要复杂的去除压缩空气中夹带的水雾和油雾的空气净化系统。机 械搅拌发酵罐传热传质性能较好，固体颗粒悬浮性好，但考虑到其气体利用能力不足，需要 增加气体压缩机对未反应的循环气体进行处理，增加了操作成本。然而，自吸式发酵罐因其 相比于上述的传统发酵罐的在溶氧、节能、传质方面的显著优势正受到越来越多发酵相关企 业的重视，国内发酵行业各个生产企业也在用自吸式发酵罐逐步代替传统发酵罐，随着装置 和材料的不断改进，自吸式发酵罐必将向高产、高效、低能耗的方向发展
延伸阅读4-2徽生物工程菌株的构建 一、微生物工程菌株概念 微生物工程菌株是指在基因水平上，人为将所需的某一供体生物的遗传物质提取出来， 在离体条件下用适当的工具酶进行切割后，与载体连接，然后导入另一微生物（宿主）细胞， 使外源遗传物质在其中进行正常复制和表达，从而具有新的遗传特性的微生物菌株。 二、徽生物工程菌株构建的流程 微生物工程菌株主要用生产酶制剂、蛋白药物、疫苗以及其他生物制品。构建微生物工 程菌株的基本流程如下：①目的基因的获得目的基因是指微生物工程菌株需要表达的产物的 基因，可以通过化学合成、生物组织中基因组的提取和PCR等扩增。②目的基因和载体的 酶切通过限制性内切酶将目的基因和载体进行酶切，获得可以彼此连接的两个片段。③重组 载体的构建上述两个片段通过DNA连接酶进行连接并转化到大肠杆菌进行增殖获得重组载 体.④重组载体的转化将重组载体通过适宜的转化方式转化到感受态宿主细胞中，进行培养。 目前常用的宿主菌有大肠杆菌、毕赤酵母、藻类和枯草芽孢杆菌等。⑤微生物工程菌株的筛 选与鉴定通过载体遗传标记基因、报告基因或者目的基因进行菌落PC筛选，筛选出的阳 性菌株进而进行表达产物的鉴定（图S4-1)。 PCR扩增 双酶切 感受态大肠杆菌 目的基因来源 目的基因 双酶切 -2-=73 转化以及筛选 -989o8 DNA连接酶 00 载体 重组载体 大肠杆菌工程菌 图S4-1微生物工程菌株构建策略 三、徽生物工程菌株的应用 微生物工程菌株己经广泛的用于各种生物酶制剂、重组疫苗、基因药物的生产和改善食 品风味与品质，随着生物技术的不断深入发展，微生物工程菌的重要作用会不断地被发掘和 利用
延伸阅读 4-2 微生物工程菌株的构建 一、微生物工程菌株概念 微生物工程菌株是指在基因水平上，人为将所需的某一供体生物的遗传物质提取出来， 在离体条件下用适当的工具酶进行切割后，与载体连接，然后导入另一微生物（宿主）细胞， 使外源遗传物质在其中进行正常复制和表达，从而具有新的遗传特性的微生物菌株。 二、微生物工程菌株构建的流程 微生物工程菌株主要用生产酶制剂、蛋白药物、疫苗以及其他生物制品。构建微生物工 程菌株的基本流程如下：①目的基因的获得目的基因是指微生物工程菌株需要表达的产物的 基因，可以通过化学合成、生物组织中基因组的提取和 PCR 等扩增。②目的基因和载体的 酶切通过限制性内切酶将目的基因和载体进行酶切，获得可以彼此连接的两个片段。③重组 载体的构建上述两个片段通过 DNA 连接酶进行连接并转化到大肠杆菌进行增殖获得重组载 体。④重组载体的转化将重组载体通过适宜的转化方式转化到感受态宿主细胞中，进行培养。 目前常用的宿主菌有大肠杆菌、毕赤酵母、藻类和枯草芽孢杆菌等。⑤微生物工程菌株的筛 选与鉴定通过载体遗传标记基因、报告基因或者目的基因进行菌落 PCR 筛选，筛选出的阳 性菌株进而进行表达产物的鉴定（图 S4-1）。 图 S4-1 微生物工程菌株构建策略 三、微生物工程菌株的应用 微生物工程菌株已经广泛的用于各种生物酶制剂、重组疫苗、基因药物的生产和改善食 品风味与品质，随着生物技术的不断深入发展，微生物工程菌的重要作用会不断地被发掘和 利用
延伸阅读4-3植物乳杆菌优良菌株自然选育 泡菜是中国传统的一种发酵蔬菜制品泡菜，不仅味美、爽口、开胃，而且具有调节肠道 菌群平衡，降低胆固醇等功能。泡菜是指在低浓度食盐的高渗透压环境下，乳酸菌发酵可发 酵糖产生大量乳酸，抑制其他微生物生长的一种具有酸味的发酵食品，其品质的好坏和产品 质量的均一取决于其中的植物乳杆菌的菌种特性。 通过泡菜中植物乳杆菌的自然选育可以获得发酵性能优越的植物乳杆菌优良菌种，其选 育的基本流程为如图S4-2,其过程简单描述如下： ①乳酸菌分离：取泡菜汁进行10倍系列梯度进行稀释，吸取105、106和107稀释度的 泡菜汁各1mL涂布于MRS培养基（乳酸细菌培养基）平板中，放置在33℃培养箱中培养 24~36h,挑取使培养基变黄的单菌落，于MRS平板上划线分离纯化，经革兰氏染色和接 触酶反应，挑出革兰氏阳性、接触酶阴性菌株斜面保存。 ②液体培养：挑取上述MRS平板上单菌落接入到含有3 mL MRS液体培养基的试管中， 33℃静止培养36h,以3%的接种量转接到装50mL液体培养基的250mL摇瓶，33℃静 止培养36h。 ③菌种筛选：将分离到的菌株液体培养后，按5%的接种量接种到甘蓝盐水(6%以下) 中进行室温(20℃)发酵72小时，挑选出产酸速度快、发酵风味好的菌株保藏。 ④菌株鉴定：按照细菌鉴定的16SDNA的鉴定方法对产酸速度快的菌种进行鉴定，获得 产酸性能优良的植物乳杆菌。 101 109 泡莱汁梯度稀 选取单菌落划线 取稀液培养 纯化蹄选 侧定酸合量及评 将菌液按种到甘蓝 价发薛效果 叶片盐水中发醉 图S4-2植物乳杆菌优良菌株自然选育流程
延伸阅读 4-3 植物乳杆菌优良菌株自然选育 泡菜是中国传统的一种发酵蔬菜制品泡菜，不仅味美、爽口、开胃，而且具有调节肠道 菌群平衡，降低胆固醇等功能。泡菜是指在低浓度食盐的高渗透压环境下，乳酸菌发酵可发 酵糖产生大量乳酸，抑制其他微生物生长的一种具有酸味的发酵食品，其品质的好坏和产品 质量的均一取决于其中的植物乳杆菌的菌种特性。 通过泡菜中植物乳杆菌的自然选育可以获得发酵性能优越的植物乳杆菌优良菌种，其选 育的基本流程为如图 S4-2，其过程简单描述如下： ①乳酸菌分离：取泡菜汁进行 10 倍系列梯度进行稀释，吸取 10 -5、10 -6和 10 -7 稀释度的 泡菜汁各 1 mL 涂布于 MRS 培养基（乳酸细菌培养基）平板中，放置在 33 ℃培养箱中培养 24～36 h，挑取使培养基变黄的单菌落，于 MRS 平板上划线分离纯化，经革兰氏染色和接 触酶反应，挑出革兰氏阳性、接触酶阴性菌株斜面保存。 ②液体培养：挑取上述 MRS 平板上单菌落接入到含有 3 mL MRS 液体培养基的试管中， 33 ℃静止培养 36 h，以 3%的接种量转接到装 50 mL 液体培养基的 250 mL 摇瓶，33 ℃静 止培养 36 h。 ③菌种筛选：将分离到的菌株液体培养后，按 5% 的接种量接种到甘蓝盐水（6%以下） 中进行室温（20℃）发酵 72 小时，挑选出产酸速度快、发酵风味好的菌株保藏。 ④菌株鉴定：按照细菌鉴定的 16S DNA 的鉴定方法对产酸速度快的菌种进行鉴定，获得 产酸性能优良的植物乳杆菌。 图 S4-2 植物乳杆菌优良菌株自然选育流程
由于在该植物乳杆菌的筛选过程中，并未对该菌种进行任何人工的诱变处理，获得的植 物乳杆菌是在泡菜这种原有环境中的通过筛选自发诱变产乳酸能力更强的微生物菌株，因而 是属于自然选育。 自然选育这种微生物育种的方式效率比较低，目前己经很少使用，人工诱变和基因工程 菌的方式己经成为微生物育种的主要方式
由于在该植物乳杆菌的筛选过程中，并未对该菌种进行任何人工的诱变处理，获得的植 物乳杆菌是在泡菜这种原有环境中的通过筛选自发诱变产乳酸能力更强的微生物菌株，因而 是属于自然选育。 自然选育这种微生物育种的方式效率比较低，目前已经很少使用，人工诱变和基因工程 菌的方式已经成为微生物育种的主要方式
延伸阅读4-4诱变育种的主要技术流程 诱变育种(mutation breeding)是指以诱变剂诱发微生物基因突变，通过筛选突变体， 寻找正向突变菌株的一种育种方法。一般诱变育种过程如下：①出发菌株出发菌种是指用于 诱变的原始菌种。出发菌种可以是源于自然界土样或水样中分离出来的野生型菌种，也可以 是生产中正在使用的菌种，还可以从菌种保藏机构中所购买。②菌种纯化将野生菌株液体培 养后，吸取少量培养液涂布于固体培养基平板，进行培养，挑取单菌落进行固体培养基平板 划线培养，获得纯种菌株。③制备单孢子（单细胞）培养液通常将出发菌种进行液体培养， 进行系列稀释成单细胞（或孢子）悬浮液。④诱变剂处理按照预试验确定的诱变剂种类、剂量 大小、处理时间等方案进行诱变处理。⑤挑选疑似突变菌落纯培养挑取疑似菌株进行固体培 养基平板划线纯化。⑥突变体的初筛将上述纯化疑似菌株单菌落挑到斜面培养基上培养，然 后将斜面上的菌落逐一接种到三角摇瓶之中，振荡培养并测它们的性能，即初筛。⑦突变体 复筛初筛中所得到的超过对照性能10%以上的菌种，再进行复筛。复筛的过程与初筛基本 相同，可进行1~3次。⑧选出突变体复筛选出的高产的稳定菌种再经过小型甚至中型试验， 才可用于发酵生产。 液体培养基中培养 取培养液，均匀涂布 无茵平皿中，吹干 淀粉液化芽孢杆菌(Bacillus amvloliguefociens) 弟度稀释 初筛，加入生理益水 来液离心后上 逃过透后。经高效液相 复筛，液体携 甲碎，离心 图S4-3诱变育种基本流程 脂肽类生物表面活性剂具有抗菌活性，能够抗细菌、真菌、病毒以及支原体，在生物医 药领域石油、食品、化妆品和农业方面均有重要的应用价值广泛的应用前景。通过对淀粉液 化芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)ES-2的低能N+离子注入诱变育种方式可获得高产 脂肽类生物表面活性剂的淀粉液化芽孢杆菌，其基本流程描述如下（图S4-3):①出发菌株 淀粉液化芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)ES-2,实验室保藏。②样品处理从新鲜斜面 中挑取一环菌苔于种子液培养基中培养14~16h(1mL菌体数为10~108)，取0.1mL培养
延伸阅读 4-4 诱变育种的主要技术流程 诱变育种（mutation breeding）是指以诱变剂诱发微生物基因突变，通过筛选突变体， 寻找正向突变菌株的一种育种方法。一般诱变育种过程如下：①出发菌株出发菌种是指用于 诱变的原始菌种。出发菌种可以是源于自然界土样或水样中分离出来的野生型菌种，也可以 是生产中正在使用的菌种，还可以从菌种保藏机构中所购买。②菌种纯化将野生菌株液体培 养后，吸取少量培养液涂布于固体培养基平板，进行培养，挑取单菌落进行固体培养基平板 划线培养，获得纯种菌株。③制备单孢子（单细胞）培养液通常将出发菌种进行液体培养， 进行系列稀释成单细胞(或孢子)悬浮液。④诱变剂处理按照预试验确定的诱变剂种类、剂量 大小、处理时间等方案进行诱变处理。⑤挑选疑似突变菌落纯培养挑取疑似菌株进行固体培 养基平板划线纯化。⑥突变体的初筛将上述纯化疑似菌株单菌落挑到斜面培养基上培养，然 后将斜面上的菌落逐一接种到三角摇瓶之中，振荡培养并测它们的性能，即初筛。⑦突变体 复筛初筛中所得到的超过对照性能 10 %以上的菌种，再进行复筛。复筛的过程与初筛基本 相同，可进行 1～3 次。⑧选出突变体复筛选出的高产的稳定菌种再经过小型甚至中型试验， 才可用于发酵生产。 图 S4-3 诱变育种基本流程 脂肽类生物表面活性剂具有抗菌活性，能够抗细菌、真菌、病毒以及支原体，在生物医 药领域石油、食品、化妆品和农业方面均有重要的应用价值广泛的应用前景。通过对淀粉液 化芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）ES-2 的低能 N+离子注入诱变育种方式可获得高产 脂肽类生物表面活性剂的淀粉液化芽孢杆菌，其基本流程描述如下（图 S4-3）：①出发菌株 淀粉液化芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）ES-2，实验室保藏。②样品处理从新鲜斜面 中挑取一环菌苔于种子液培养基中培养 14～16 h（1mL 菌体数为 10 7～10 8），取 0.1mL 培养
液，均匀涂布无菌平皿中，吹干待用。③离子注入将上述样品培养皿叠放在对照培养皿上方， 一起放入离子注入机靶室，打开上方培养皿盖，靶室抽真空。用能量为20kVN+离子束处 理，注入剂量分别为1.30、2.08、2.0、3.90、5.20E1015cm2。④初筛取1mL无菌生理盐水 将离子注入后的菌膜洗下，梯度稀释，分别吸取不同梯度下稀释液0.1mL均匀涂布在初筛 平板上，37℃培养36，菌落计数，统计存活率。存活率=注入样品单菌落数/真空对照单菌 落数。从中挑选有较大透明圈的菌落作为复筛菌株。⑤复筛将初筛菌株进行液体发酵培养， 发酵液于4℃下10000g离心15min,获得上清液。加入适量的甲醇提取20min,离心，获 得甲醇提取液经0.22m滤膜过滤后，经高效液相色谱测定抗菌脂肽含量。规定脂肽含量高 与原始菌株5%的为正突变。⑥选出突变体获得一株稳定的高脂肽高产菌E$-2-4,发酵过程 中延滞期缩短了4h,稳定期长达20h,发酵至36h时脂肽产量达到最高，比原始菌株提高 了15.2%。 随着重组DNA技术的不断发展，微生物基因工程菌株的构建己经逐渐成为微生物育种 的一种常规和便利的方式，诱变育种这种微生物菌种选育的方式因其自己的不足已经逐渐被 基因工程育种技术所替代
液，均匀涂布无菌平皿中，吹干待用。③离子注入将上述样品培养皿叠放在对照培养皿上方， 一起放入离子注入机靶室，打开上方培养皿盖，靶室抽真空。用能量为 20keV N+离子束处 理，注入剂量分别为 1.30、2.08、2.60、3.90、5.20E10 15 cm-2。④初筛取 1mL 无菌生理盐水 将离子注入后的菌膜洗下，梯度稀释，分别吸取不同梯度下稀释液 0.1mL 均匀涂布在初筛 平板上，37℃培养 36h，菌落计数，统计存活率。存活率=注入样品单菌落数/真空对照单菌 落数。从中挑选有较大透明圈的菌落作为复筛菌株。⑤复筛将初筛菌株进行液体发酵培养， 发酵液于 4℃下 10000g 离心 15min，获得上清液。加入适量的甲醇提取 20 min，离心，获 得甲醇提取液经 0.22 μm 滤膜过滤后，经高效液相色谱测定抗菌脂肽含量。规定脂肽含量高 与原始菌株 5%的为正突变。⑥选出突变体获得一株稳定的高脂肽高产菌 ES-2-4，发酵过程 中延滞期缩短了 4 h，稳定期长达 20 h，发酵至 36 h 时脂肽产量达到最高，比原始菌株提高 了 15.2%。 随着重组 DNA 技术的不断发展，微生物基因工程菌株的构建已经逐渐成为微生物育种 的一种常规和便利的方式，诱变育种这种微生物菌种选育的方式因其自己的不足已经逐渐被 基因工程育种技术所替代
延伸阅读4-5代谢控制育种的策略与技术流程 代谢控制育种(metabolic control breeding)是指以生物化学和遗传学为基础，研究代谢 产物的生物合成途径和代谢调节的机制，选择巧妙的技术路线，通过遗传育种技术而获得解 除或绕过了微生物正常代谢途径的突变株，从而人为地实现有用产物选择性地大量合成积累 的一种育种方法。代谢控制育种的策略主要包括诱导、分解阻遏、分解抑制、反馈阻遏、反 馈抑制、细胞膜透性调节等。 代谢控制育种需要首先了解代谢产物的生物合成途径和代谢调节机制，通过遗传育种技 术而获得解除或绕过了微生物正常代谢途径的突变株，人为地实现目标产物选择性地大量合 成积累。这里以黄色短杆菌2-氨基-3-羟基戊酸(2-amino-3-hydroxy valerate,AHV)抗性 突变株生产苏氨酸的选育为例，阐明代谢调控育种的一般策略与技术。 微生物发酵生产苏氨酸的代谢流如图S4-4,代谢流由葡萄糖经微生物发酵依次转为天 冬氨酸、天冬氨酰磷酸而出现分叉，分别流向赖氨酸和高丝氨酸2个支路：高丝氨酸支路代 谢流又可流向蛋氨酸和苏氨酸2个分支路：终产物苏氨酸对于代谢流具有反馈抑制作用。为 了打破常规的代谢途径，首先通过常规诱变技术分别获赖氨酸营养缺陷菌株，在此基础上获 得蛋氨酸营养缺陷型菌株，一方面降低了赖氨酸和蛋氨酸的浓度，解除了它们对代谢途径中 关键酶的反馈调节作用，另一方面可以节约碳源，使得代谢流高效地转向所需的目的产物苏 氨酸，并使之得以大量的积累。在此基础上，利用AHV是苏氨酸的结构类似物，选育具有 AHV抗性突变株，从而解除了对高丝氨酸脱氢酶的反馈抑制。 解除反馈调节 简糖 天冬氯酸 天冬氯酰磷酸 天冬氨酰半醛 高丝氨酸 苏氯酸 ys遗传缺陷 Met进传缺陷 核氨酸 蛋氨酸 图S4-4微生物发酵生产苏氨酸代谢控制育种策略 代谢控制育种开始于20世纪50年代末，以1957年谷氨酸代谢控制发酵成功为标志， 使发酵工业进入代谢控制发酵的崭新时期。经典的诱变育种是最主要的和最为基础的育种手 段，但具有一定盲目性，而代谢控制育种的快速发展展示着微生物育种迈入了理性育种阶段
延伸阅读 4-5 代谢控制育种的策略与技术流程 代谢控制育种（metabolic control breeding）是指以生物化学和遗传学为基础，研究代谢 产物的生物合成途径和代谢调节的机制，选择巧妙的技术路线，通过遗传育种技术而获得解 除或绕过了微生物正常代谢途径的突变株，从而人为地实现有用产物选择性地大量合成积累 的一种育种方法。代谢控制育种的策略主要包括诱导、分解阻遏、分解抑制、反馈阻遏、反 馈抑制、细胞膜透性调节等。 代谢控制育种需要首先了解代谢产物的生物合成途径和代谢调节机制，通过遗传育种技 术而获得解除或绕过了微生物正常代谢途径的突变株，人为地实现目标产物选择性地大量合 成积累。这里以黄色短杆菌 2-氨基-3-羟基戊酸（2- amino -3- hydroxy valerate，AHV）抗性 突变株生产苏氨酸的选育为例，阐明代谢调控育种的一般策略与技术。 微生物发酵生产苏氨酸的代谢流如图 S4-4，代谢流由葡萄糖经微生物发酵依次转为天 冬氨酸、天冬氨酰磷酸而出现分叉，分别流向赖氨酸和高丝氨酸 2 个支路；高丝氨酸支路代 谢流又可流向蛋氨酸和苏氨酸 2 个分支路；终产物苏氨酸对于代谢流具有反馈抑制作用。为 了打破常规的代谢途径，首先通过常规诱变技术分别获赖氨酸营养缺陷菌株，在此基础上获 得蛋氨酸营养缺陷型菌株，一方面降低了赖氨酸和蛋氨酸的浓度，解除了它们对代谢途径中 关键酶的反馈调节作用，另一方面可以节约碳源，使得代谢流高效地转向所需的目的产物苏 氨酸，并使之得以大量的积累。在此基础上，利用 AHV 是苏氨酸的结构类似物，选育具有 AHV 抗性突变株，从而解除了对高丝氨酸脱氢酶的反馈抑制。 图 S4-4 微生物发酵生产苏氨酸代谢控制育种策略 代谢控制育种开始于 20 世纪 50 年代末，以 1957 年谷氨酸代谢控制发酵成功为标志， 使发酵工业进入代谢控制发酵的崭新时期。经典的诱变育种是最主要的和最为基础的育种手 段，但具有一定盲目性，而代谢控制育种的快速发展展示着微生物育种迈入了理性育种阶段
这种方法与杂交育种结合已被广泛用于各种工业领域
这种方法与杂交育种结合已被广泛用于各种工业领域
延伸阅读46影响种子质量的因素及其控制 微生物发酵过程中的种子质量是影响发酵生产水平的重要因素之一，也是生物发酵的关 键控制节点之一，因此了解影响种子质量的因素以及采取的控制措施确保种子质量显得尤为 重要。 影响种子质量的因素主要有以下几个方面：①培养基。培养基的营养成分应适合种子培 养的需要，一般选择一些有利于孢子发芽和菌丝生长的培养基，在营养上易于被菌体直接吸 收和利用，营养成分要适当的丰富和完全，氮源和维生素含量应较高。培养基的营养成分要 尽可能和发酵培养基接近，以适合发酵的需要，则种子移入发酵罐后能比较容易适应发酵罐 的培养条件：此外，培养基的pH要比较稳定，适合菌的生长和发育。②培养条件。种子培 养应选择最适温度，同时，培养过程中进行通气搅拌控制溶氧含量也非常关键。③种龄。在 工业发酵生产中，一般都选在生命力极为旺盛的对数生长期，菌体量尚未达到最高峰时移种。 最适种龄因菌种不同而有很大差异：细菌的种龄一般为7~24h,霉菌种龄一般为16~50h, 放线菌种龄一般为21~64。④接种量。移入的种子液体积和接种后培养液体积的比例称为 接种量。发酵罐的接种量的大小与菌种特性、种子质量和发酵条件等有关。一般接种量为 10%左右。⑤种子质量的判断。细胞或菌体以单细胞菌体为种子的质量要求菌体健壮、菌 形一致、均匀整齐，有的还要求有一定的排列和形态：以霉菌、放线菌为种子的质量要求是 菌丝粗壮，对某些染料着色力强、生产旺盛、菌丝分枝情况和内含物情况良好。生化指标： 种子液的糖、氮、磷含量的变化和pH值变化。产物生成量：测定产物含量。酶活力：如胞 内的淀粉酶等。⑥种子的异常状况。菌种生长缓慢或过快：与孢子质量和种子罐的培养条件 有关。菌丝结团：与搅拌效果差、接种量小有关。菌丝粘壁：在种子培养过程中，由于搅拌 效果不好，泡沫过多以及种子罐装料系数过小等原因，使菌丝逐步粘在罐壁上，结果使培养 液中菌丝浓度减少，最后就可能形成菌丝团。 种子质量的最终考察指标是其在发酵罐中所表现出来的生产能力。因此，保证种子质量 首先要确保菌种的稳定性，其次是提供种子培养的适宜环境，保证无杂菌侵入，以获得优良 种子。确保微生物种子质量稳定的控制措施主要有以下几个方面：①菌种稳定性检查要保持 菌种具有稳定的生产能力，需要定期考察和挑选菌种，对菌种进行自然分离，摇瓶发酵，测 定其生产能力，从中挑选具有较高生产能力的菌株，防止菌种生产能力下降。②适宜的生长 环境确保菌种在适宜的条件下生长繁殖，包括提供营养丰富的培养基、适宜的培养温度和湿 度、合理的通气量等。③种子无杂菌检查种子无杂菌是纯种发酵的基本要求和保证。在种子 制备过程中每步移种均需要进行无杂菌检查，并对种子液进行生化分析。无菌检查是判断杂
延伸阅读 4-6 影响种子质量的因素及其控制 微生物发酵过程中的种子质量是影响发酵生产水平的重要因素之一，也是生物发酵的关 键控制节点之一，因此了解影响种子质量的因素以及采取的控制措施确保种子质量显得尤为 重要。 影响种子质量的因素主要有以下几个方面：①培养基。培养基的营养成分应适合种子培 养的需要，一般选择一些有利于孢子发芽和菌丝生长的培养基，在营养上易于被菌体直接吸 收和利用，营养成分要适当的丰富和完全，氮源和维生素含量应较高。培养基的营养成分要 尽可能和发酵培养基接近，以适合发酵的需要，则种子移入发酵罐后能比较容易适应发酵罐 的培养条件；此外，培养基的 pH 要比较稳定，适合菌的生长和发育。②培养条件。种子培 养应选择最适温度，同时，培养过程中进行通气搅拌控制溶氧含量也非常关键。③种龄。在 工业发酵生产中，一般都选在生命力极为旺盛的对数生长期，菌体量尚未达到最高峰时移种。 最适种龄因菌种不同而有很大差异：细菌的种龄一般为 7～24 h，霉菌种龄一般为 16～50 h， 放线菌种龄一般为 21～64 h。④接种量。移入的种子液体积和接种后培养液体积的比例称为 接种量。发酵罐的接种量的大小与菌种特性、种子质量和发酵条件等有关。一般接种量为 10 %左右。⑤种子质量的判断。细胞或菌体以单细胞菌体为种子的质量要求菌体健壮、菌 形一致、均匀整齐，有的还要求有一定的排列和形态；以霉菌、放线菌为种子的质量要求是 菌丝粗壮，对某些染料着色力强、生产旺盛、菌丝分枝情况和内含物情况良好。生化指标： 种子液的糖、氮、磷含量的变化和 pH 值变化。产物生成量：测定产物含量。酶活力：如胞 内的淀粉酶等。⑥种子的异常状况。菌种生长缓慢或过快：与孢子质量和种子罐的培养条件 有关。菌丝结团：与搅拌效果差、接种量小有关。菌丝粘壁：在种子培养过程中，由于搅拌 效果不好，泡沫过多以及种子罐装料系数过小等原因，使菌丝逐步粘在罐壁上，结果使培养 液中菌丝浓度减少，最后就可能形成菌丝团。 种子质量的最终考察指标是其在发酵罐中所表现出来的生产能力。因此，保证种子质量 首先要确保菌种的稳定性，其次是提供种子培养的适宜环境，保证无杂菌侵入，以获得优良 种子。确保微生物种子质量稳定的控制措施主要有以下几个方面：①菌种稳定性检查要保持 菌种具有稳定的生产能力，需要定期考察和挑选菌种，对菌种进行自然分离，摇瓶发酵，测 定其生产能力，从中挑选具有较高生产能力的菌株，防止菌种生产能力下降。②适宜的生长 环境确保菌种在适宜的条件下生长繁殖，包括提供营养丰富的培养基、适宜的培养温度和湿 度、合理的通气量等。③种子无杂菌检查种子无杂菌是纯种发酵的基本要求和保证。在种子 制备过程中每步移种均需要进行无杂菌检查，并对种子液进行生化分析。无菌检查是判断杂