第10章延伸阅读 延伸阅读10-1标准的徽生物检测程序 一、微生物检测的基本理论与方法 微生物检测就是应用微生物学的理论与方法，研究外界环境和微生物的种类、数量、性 质、活动规律及其对人和动物健康的影响。它与食品微生物学、医学微生物学、兽医微生物 学、农业微生物学、卫生学等关系甚为密切，与传染病学、免疫学、病理学、组织学、解剖 学等也有一定的联系。 微生物检测检验的常用方法有：微生物形态检查、生化试验、噬菌体分型、血清学分型、 毒性试验以及血清试管凝聚试验等。形态检查是通过菌落形态或借助染色和显微镜结构特征 不同的细菌鉴定区分的方法。理化方法是指用化学反应来测定微生物的代谢产物（微生物分 类鉴定中的重要依据)，常用来鉴别一些在形态和其他方面不易区别的微生物。血清学反应， 即用相应的抗原与抗体在体外一定条件下作用，可出现肉眼可见的沉淀、凝集现象。应用此 试验对待测微生物做血清分型检验。在微生物检验中，常用血清分型来鉴定分离到的细菌， 以最终确认检测结果。常用的试验操作有：糖酵解试验、淀粉水解试验、VP试验、甲基红 试验、靛基质试验、硝酸盐还原试验、明胶试验、尿素酶试验、氧化酶试验、硫化氢试验、 三糖帖试验等。这些生化试验检测方法的准确性、灵敏性较高，但涉及的试验较多，操作繁 琐，需要时间较长，而且要有大量人员参与。 二、微生物检测的标准程序 标准的微生物检测程序一般包括采样、增菌与分离培养、形态观察、菌落总数检测、生 化试验、血清学鉴定以及报告等步骤（图S10-1)
第 10 章延伸阅读 延伸阅读 10-1 标准的微生物检测程序 一、微生物检测的基本理论与方法 微生物检测就是应用微生物学的理论与方法，研究外界环境和微生物的种类、数量、性 质、活动规律及其对人和动物健康的影响。它与食品微生物学、医学微生物学、兽医微生物 学、农业微生物学、卫生学等关系甚为密切，与传染病学、免疫学、病理学、组织学、解剖 学等也有一定的联系。 微生物检测检验的常用方法有：微生物形态检查、生化试验、噬菌体分型、血清学分型、 毒性试验以及血清试管凝聚试验等。形态检查是通过菌落形态或借助染色和显微镜结构特征 不同的细菌鉴定区分的方法。理化方法是指用化学反应来测定微生物的代谢产物（微生物分 类鉴定中的重要依据），常用来鉴别一些在形态和其他方面不易区别的微生物。血清学反应， 即用相应的抗原与抗体在体外一定条件下作用，可出现肉眼可见的沉淀、凝集现象。应用此 试验对待测微生物做血清分型检验。在微生物检验中，常用血清分型来鉴定分离到的细菌， 以最终确认检测结果。常用的试验操作有：糖酵解试验、淀粉水解试验、V-P 试验、甲基红 试验、靛基质试验、硝酸盐还原试验、明胶试验、尿素酶试验、氧化酶试验、硫化氢试验、 三糖帖试验等。这些生化试验检测方法的准确性、灵敏性较高，但涉及的试验较多，操作繁 琐，需要时间较长，而且要有大量人员参与。 二、微生物检测的标准程序 标准的微生物检测程序一般包括采样、增菌与分离培养、形态观察、菌落总数检测、生 化试验、血清学鉴定以及报告等步骤（图 S10-1）
采集处理后的样品 样品稀释 增殖培养 1:10稀释 1:100稀释 1:1000稀释 8 平板涂布 分离培养 未知菌落 生化试验鉴定 闲落总数计数 血清分型 报告 图S10-1标准微生物检测程序 采样原则是能采取完整包装的样品就不拆开取样，必须拆开包装取样的应按无菌操作进 行取样。其中，如果是液体样品，要在充分混匀后，无菌操作打开包装，用100mL无菌注 射器抽取，注入无菌盛样容器。增菌培养一般用非选择性增菌培养基（如营养肉汤）来保证 大多数微生物的生长。分离培养根据待测微生物的特性选择相应的培养基，如金黄色葡萄球 菌可选择BPA(肉汁胨培养基)培养基、溶血性链球菌可选用血液琼脂基础培养基 (blood-.agar-base-medium、大肠菌群可选用伊红美兰培养基、军团菌可选用GVPC培养基以
图 S10-1 标准微生物检测程序 采样原则是能采取完整包装的样品就不拆开取样，必须拆开包装取样的应按无菌操作进 行取样。其中，如果是液体样品，要在充分混匀后，无菌操作打开包装，用 100 mL 无菌注 射器抽取，注入无菌盛样容器。增菌培养一般用非选择性增菌培养基（如营养肉汤）来保证 大多数微生物的生长。分离培养根据待测微生物的特性选择相应的培养基，如金黄色葡萄球 菌可选择 BPA（肉汁胨培养基）培养基、溶血性链球菌可选用血液琼脂基础培养基 (blood-agar-base-medium)、大肠菌群可选用伊红美兰培养基、军团菌可选用 GVPC 培养基以
及BCYE培养基进行培养。培养后对长出的菌落或菌群进行形态观察。菌落计数先用肉眼 观察，点数菌落数，然后再用放大5~10倍的放大镜检查，以防遗漏。记下各平皿的菌落数 后。求出同一稀释度各平皿生长的平均菌落数。若平皿中有连成片状的菌落或花点样菌落蔓 延生长时，该平皿不宜计数。若片状菌落不到平皿中的50%，而其余50%中菌落数分布又 很均匀，则可将此50%平皿菌落计数后乘2，以代表全皿菌落数。点计菌落数后，计算各稀 释级供试品溶液的平均菌落数，按菌数报告规定报告菌数。若同稀释级两个平板的菌落平均 数不小于15，则两个平板的菌落数不能相差一倍或以上。一般营养琼脂培养基用于细菌计 数，玫瑰红钠琼脂培养基用于霉菌、酵母菌计数。细菌培养3天，霉菌、酵母培养5天，逐 日观察菌落生长情况，点计菌落数，必要时，可适当延长培养时间至7天进行菌落计数并报 告。对待测微生物进行生化试验时，根据各生化鉴定系统要求对未知菌作常规处理，分别接 种不同生化鉴定系统培养基，观察结果。微量生物化学反应系统通常由10~24项生化指标 组合而成，通过对结果的判断，得出了3~7位数据，查阅编码手册得出相应的细菌名称， 与计算机联合使用，则会跟迅速、简便、快捷。根据鉴定细菌的不同功能，微量生化反应系 统常用者分为以下几种：(1)鉴定肠杆菌科用的微量生化反应系统：(2)鉴定非发酵菌用的 微量生化反应系统：(3)鉴定葡萄球菌用的微量生化反应系统。血清学试验对于鉴定一个微 生物的群、型来说至关重要，然而鉴定结果的准确、可靠与否又与生产厂家提供的诊断用品 质量、效价、特异性、敏感性、有效期等有密切的关系。通过以上试验鉴定步骤，可对待测 未知微生物做出可靠的鉴定
及 BCYE 培养基进行培养。培养后对长出的菌落或菌群进行形态观察。菌落计数先用肉眼 观察，点数菌落数，然后再用放大 5～10 倍的放大镜检查，以防遗漏。记下各平皿的菌落数 后。求出同一稀释度各平皿生长的平均菌落数。若平皿中有连成片状的菌落或花点样菌落蔓 延生长时，该平皿不宜计数。若片状菌落不到平皿中的 50%，而其余 50%中菌落数分布又 很均匀，则可将此 50%平皿菌落计数后乘 2，以代表全皿菌落数。点计菌落数后，计算各稀 释级供试品溶液的平均菌落数，按菌数报告规定报告菌数。若同稀释级两个平板的菌落平均 数不小于 15，则两个平板的菌落数不能相差一倍或以上。一般营养琼脂培养基用于细菌计 数，玫瑰红钠琼脂培养基用于霉菌、酵母菌计数。细菌培养 3 天，霉菌、酵母培养 5 天，逐 日观察菌落生长情况，点计菌落数，必要时，可适当延长培养时间至 7 天进行菌落计数并报 告。对待测微生物进行生化试验时，根据各生化鉴定系统要求对未知菌作常规处理，分别接 种不同生化鉴定系统培养基，观察结果。微量生物化学反应系统通常由 10～24 项生化指标 组合而成，通过对结果的判断，得出了 3～7 位数据，查阅编码手册得出相应的细菌名称， 与计算机联合使用，则会跟迅速、简便、快捷。根据鉴定细菌的不同功能，微量生化反应系 统常用者分为以下几种：（1）鉴定肠杆菌科用的微量生化反应系统；（2）鉴定非发酵菌用的 微量生化反应系统；（3）鉴定葡萄球菌用的微量生化反应系统。血清学试验对于鉴定一个微 生物的群、型来说至关重要，然而鉴定结果的准确、可靠与否又与生产厂家提供的诊断用品 质量、效价、特异性、敏感性、有效期等有密切的关系。通过以上试验鉴定步骤，可对待测 未知微生物做出可靠的鉴定
延伸阅读10-2酶免疫测定法ELISA的种类 一、ELISA的原理 ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的 抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活 性。在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。 用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记 的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量 呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检 物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间 接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。但是，ELISA技术只能检测 到g水平，精密度差（批内CV15%~20%),线性范围窄（一个数量级），存在HD-HOOK” 效应。 二、ELISA的类型 ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有三个必要的试剂： 固相的抗菌素原或抗体，即"免疫吸附剂"(immunosorbent):酶标记的抗原或抗体，称为" 结合物”(conjugate):酶反应的底物。根据试剂的来源和标本的情况以及检测的具体条件， 可设计出各种不类型的检测方法。用于临床检验的ELISA主要有以下几种类型： 1.双抗体夹心法 双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下（图S10-2): ①将特异性抗体与固相载体联结，形成固相抗体。洗涤除去未结合的抗体及杂质。 ②加受检标本，保温反应。标本中的抗原与固相抗体结合，形成固相抗原抗体复合物。 洗涤除去其他未结合物质。 ③加酶标抗体，保温反应。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合 的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。 ④加底物显色。固相上的酶催化底物成为有色产物。通过比色，测知标本中抗原的量。 在临床检验中，此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg、HBAg、AFP、 hCG等。只要获得针对受检抗原的异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建 立此法。如抗体的来源为抗血清，包被和酶标用的抗体最好分别取自不同种属的动物。如应 用单克隆抗体，一般选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗，分别用于包被固相载体和制备
延伸阅读 10-2 酶免疫测定法 ELISA 的种类 一、ELISA 的原理 ELISA 的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的 抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活 性。在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。 用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记 的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量 呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检 物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间 接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。但是，ELISA 技术只能检测 到 ng 水平，精密度差（批内 CV 15%～20%），线性范围窄（一个数量级），存在“HD-HOOK” 效应。 二、ELISA 的类型 ELISA 可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有三个必要的试剂： 固相的抗菌素原或抗体，即"免疫吸附剂"（immunosorbent）；酶标记的抗原或抗体，称为" 结合物"（conjugate）；酶反应的底物。根据试剂的来源和标本的情况以及检测的具体条件， 可设计出各种不类型的检测方法。用于临床检验的 ELISA 主要有以下几种类型： 1. 双抗体夹心法 双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下（图 S10-2）： ①将特异性抗体与固相载体联结，形成固相抗体。洗涤除去未结合的抗体及杂质。 ②加受检标本，保温反应。标本中的抗原与固相抗体结合，形成固相抗原抗体复合物。 洗涤除去其他未结合物质。 ③加酶标抗体，保温反应。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合 的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。 ④加底物显色。固相上的酶催化底物成为有色产物。通过比色，测知标本中抗原的量。 在临床检验中，此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如 HBsAg、HBeAg、AFP、 hCG 等。只要获得针对受检抗原的异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建 立此法。如抗体的来源为抗血清，包被和酶标用的抗体最好分别取自不同种属的动物。如应 用单克隆抗体，一般选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗，分别用于包被固相载体和制备
酶结合物。这种双位点夹心法具有很高的特异性，而且可以将受检标本和酶标抗体一起保温 反应，作一步检测。 0 ,00 孵育 孵育 洗涤 洗涤 洗涤 包被特异性抗体 加含有抗原 加标记 加底物显色 的待测样品 特异性抗体 图S10-2双抗体夹心法原理 在一步法测定中，当标本中受检抗原的含量很高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗 体结合，而不再形成"夹心复合物“。类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象，此时反应后显 色的吸光值（位于抗原过剩带上）与标准曲线（位于抗体过剩带上）某一抗原浓度的吸光值 相同，如按常法测读，所得结果将低于实际的含量，这种现象被称为钩状效应(hook effect), 因为标准曲线到达高峰后呈钩状弯落。钩状效应严重时，反应甚至可不显色而出现假阴性结 果。因此在使用一步法试剂测定标本中含量可异常增高的物质（例如血清中HBsAg、AFP 和尿液hCG等)时，应注意可测范围的最高值。用高亲和力的单克隆抗体制备此类试剂可 削弱钩状效应。 假使在被测分子的不同位点上含有多个相同的决定簇，例如HBsAg的a决定簇，也可 用针对此决定的同一单抗分别包被固相和制备酶结合物。但在HBsAg的检测中应注意亚型 问题，HBsAg有adr、adw、ayr、ayw4个亚型，虽然每种亚型均有相同的a决定簇的反应 性，这也是用单抗作夹心法应注意的问题。 双抗体夹心法测抗原的另一注意点是类风湿因子(rheumatoid factor,RF)的千扰。RF 是一种自身抗体，多为lgM型，能和多种动物IgG的F℃段结合。用作双抗体夹心法检测的 血清标本中如含有RF,它可充当抗原成份，同时与固相抗体和酶标抗体结合，表现出假阳 性反应。采用F(ab')或Fab片段作酶结合物的试剂，由于去除了Fc段，从而消除RF的 干扰。双抗体夹心法ELISA试剂是否受RF的影响，已被列为这类试剂的一项考核指标。 双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原，但不适用于测定半抗原及小分 子单价抗原，因其不能形成两位点夹心。 双抗原夹心法测抗体反应模式与双抗体夹心法类似。用特异性抗原进行包被和制备酶结 合物，以检测相应的抗体。与间接法测抗体的不同之处为以酶标抗原代替酶标抗抗体。此法 中受检标本不需稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对高于间接法。乙肝标志物中抗
酶结合物。这种双位点夹心法具有很高的特异性，而且可以将受检标本和酶标抗体一起保温 反应，作一步检测。 图 S10-2 双抗体夹心法原理 在一步法测定中，当标本中受检抗原的含量很高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗 体结合，而不再形成"夹心复合物"。类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象，此时反应后显 色的吸光值（位于抗原过剩带上）与标准曲线（位于抗体过剩带上）某一抗原浓度的吸光值 相同，如按常法测读，所得结果将低于实际的含量，这种现象被称为钩状效应（hook effect）， 因为标准曲线到达高峰后呈钩状弯落。钩状效应严重时，反应甚至可不显色而出现假阴性结 果。因此在使用一步法试剂测定标本中含量可异常增高的物质（例如血清中 HBsAg、AFP 和尿液 hCG 等）时，应注意可测范围的最高值。用高亲和力的单克隆抗体制备此类试剂可 削弱钩状效应。 假使在被测分子的不同位点上含有多个相同的决定簇，例如 HBsAg 的 a 决定簇，也可 用针对此决定的同一单抗分别包被固相和制备酶结合物。但在 HBsAg 的检测中应注意亚型 问题，HBsAg 有 adr、adw、ayr、ayw4 个亚型，虽然每种亚型均有相同的 a 决定簇的反应 性，这也是用单抗作夹心法应注意的问题。 双抗体夹心法测抗原的另一注意点是类风湿因子（rheumatoid factor，RF）的干扰。RF 是一种自身抗体，多为 IgM 型，能和多种动物 IgG 的 Fc 段结合。用作双抗体夹心法检测的 血清标本中如含有 RF，它可充当抗原成份，同时与固相抗体和酶标抗体结合，表现出假阳 性反应。采用 F（ab'）或 Fab 片段作酶结合物的试剂，由于去除了 Fc 段，从而消除 RF 的 干扰。双抗体夹心法 ELISA 试剂是否受 RF 的影响，已被列为这类试剂的一项考核指标。 双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原，但不适用于测定半抗原及小分 子单价抗原，因其不能形成两位点夹心。 双抗原夹心法测抗体反应模式与双抗体夹心法类似。用特异性抗原进行包被和制备酶结 合物，以检测相应的抗体。与间接法测抗体的不同之处为以酶标抗原代替酶标抗抗体。此法 中受检标本不需稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对高于间接法。乙肝标志物中抗
HBs的检测常采用本法。本法关键在于酶标抗原的制备，应根据抗原结构的不同，寻找合适 的标记方法。 2.间接法 间接法是检测抗体常用的方法。其原理为利用酶标记的抗抗体（抗人免疫球蛋白抗体） 以检测与固相抗原结合的受检抗体，故称为间接法。操作步骤如下（图S10-3): ①将特异性抗原与固相载体联结，形成固相抗原。洗涤除去未结合的抗原及杂质。 ②加稀释的受检血清，保温反应。血清中的特异抗体与固相抗原结合，形成固相抗原抗 体复合物。经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体，血清中的其他成份在洗涤过程中被洗 去。 ③加酶标抗抗体。可用酶标抗人Ig以检测总抗体，但一般多用酶标抗人gG检测IgG 抗体。固相免疫复合物中的抗体与酶标抗体抗体结合，从而间接地标记上酶。洗涤后，固相 载体上的酶量与标本中受检抗体的量正相关。 ④加底物显色本法主要用于对病原体抗体的检测而进行传染病的诊断。间接法的优点是 只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。间接法成功的关键在 于抗原的纯度。虽然有时用粗提抗原包被也能取得实际有效的结果，但应尽可能予以纯化， 以提高试验的特异性。特别应注意除去能与一般健康人血清发生反应的杂质，例如以E.ci 为工程酶的重组抗原，如其中含有E.coli成份，很可能与受过E.coi感染者血甭中的抗E.col 抗体发生反应。抗原中也不能含有与酶标抗人g反应的物质，例如来自人血浆或人体组织 的抗原，如不将其中的g去除，试验中也发生假阳性反应。另外如抗原中含有无关蛋白， 也会因竞争吸附而影响包被效果。 00 孵育 孵育 洗涤 洗涤 洗涤 包被抗原 加含有抗体 加酶标记 加底物显色 的待测样品 抗抗体 图S10-3间接法原理 间接法中另一种干扰因素为正常血清中所含的高浓度的非特异性。病人血清中受检的特 异性gG只占总gG中的一小部分。IgG的吸附性很强，非特异gG可直接吸附到固相载 体上，有时也可吸附到包被抗原的表面。因此在间接法中，抗原包被后一般用无关蛋白质（例
HBs 的检测常采用本法。本法关键在于酶标抗原的制备，应根据抗原结构的不同，寻找合适 的标记方法。 2. 间接法 间接法是检测抗体常用的方法。其原理为利用酶标记的抗抗体（抗人免疫球蛋白抗体） 以检测与固相抗原结合的受检抗体，故称为间接法。操作步骤如下（图 S10-3）： ①将特异性抗原与固相载体联结，形成固相抗原。洗涤除去未结合的抗原及杂质。 ②加稀释的受检血清，保温反应。血清中的特异抗体与固相抗原结合，形成固相抗原抗 体复合物。经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体，血清中的其他成份在洗涤过程中被洗 去。 ③加酶标抗抗体。可用酶标抗人 Ig 以检测总抗体，但一般多用酶标抗人 IgG 检测 IgG 抗体。固相免疫复合物中的抗体与酶标抗体抗体结合，从而间接地标记上酶。洗涤后，固相 载体上的酶量与标本中受检抗体的量正相关。 ④加底物显色本法主要用于对病原体抗体的检测而进行传染病的诊断。间接法的优点是 只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。间接法成功的关键在 于抗原的纯度。虽然有时用粗提抗原包被也能取得实际有效的结果，但应尽可能予以纯化， 以提高试验的特异性。特别应注意除去能与一般健康人血清发生反应的杂质，例如以 E. coli 为工程酶的重组抗原，如其中含有E. coli成份，很可能与受过E. coli感染者血甭中的抗E. coli 抗体发生反应。抗原中也不能含有与酶标抗人 Ig 反应的物质，例如来自人血浆或人体组织 的抗原，如不将其中的 Ig 去除，试验中也发生假阳性反应。另外如抗原中含有无关蛋白， 也会因竟争吸附而影响包被效果。 图 S10-3 间接法原理 间接法中另一种干扰因素为正常血清中所含的高浓度的非特异性。病人血清中受检的特 异性 IgG 只占总 IgG 中的一小部分。IgG 的吸附性很强，非特异 IgG 可直接吸附到固相载 体上，有时也可吸附到包被抗原的表面。因此在间接法中，抗原包被后一般用无关蛋白质（例
如牛血清蛋白)再包被一次，以封闭(blocking)固相上的空余间隙。另外，在检测过程中 标本须先行稀释(1：40~1：200)，以避免过高的阴性本底影响结果的判断。 3.竞争法 当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可用此法检测特异 性抗体。其原理为标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争与固相抗原结合。标本中抗体量越 多，结合在固相上的酶标抗体愈少，因此阳性反应呈色浅于阴性反应（图S10-4)。 ◇ 孵育 洗涤 加酶标记抗 加底物显色 原和被测抗 洗涤 原混合物 包被特异性抗体 孵有 洗涤 加酶标记抗原 加底物显色 图S10-4竞争法原理 如抗原为高纯度的，可直接包被固相。如抗原中会有干扰物质，直接包被不易成功，可采用 捕获包被法，即先包被与固相抗原相应的抗体，然后加入抗原，形成固相抗原。洗涤除去抗 原中的杂质，然后再加标本和酶标抗体进行竞争结合反应。竞争法测抗体有多种模式，可将 标本和酶标抗体与固相抗原竞争结合，抗HBc ELISA一般采用此法。另一种模式为将标本 与抗原一起加入到固相抗体中进行竞争结合，洗涤后再加入酶标抗体，与结合在固相上的抗 原反应。抗HBe的检测一般采用此法。 小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此不能用双抗体夹心法进 行测定，可以采用竞争法模式。其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体 结合。标本中抗原量含量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，最后的显色也愈浅。小分子 激素、药物等ELISA测定多用此法
如牛血清蛋白）再包被一次，以封闭（blocking）固相上的空余间隙。另外，在检测过程中 标本须先行稀释（1:40～1:200），以避免过高的阴性本底影响结果的判断。 3. 竞争法 当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可用此法检测特异 性抗体。其原理为标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争与固相抗原结合。标本中抗体量越 多，结合在固相上的酶标抗体愈少，因此阳性反应呈色浅于阴性反应（图 S10-4）。 图 S10-4 竞争法原理 如抗原为高纯度的，可直接包被固相。如抗原中会有干扰物质，直接包被不易成功，可采用 捕获包被法，即先包被与固相抗原相应的抗体，然后加入抗原，形成固相抗原。洗涤除去抗 原中的杂质，然后再加标本和酶标抗体进行竞争结合反应。竞争法测抗体有多种模式，可将 标本和酶标抗体与固相抗原竞争结合，抗 HBc ELISA 一般采用此法。另一种模式为将标本 与抗原一起加入到固相抗体中进行竞争结合，洗涤后再加入酶标抗体，与结合在固相上的抗 原反应。抗 HBe 的检测一般采用此法。 小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此不能用双抗体夹心法进 行测定，可以采用竞争法模式。其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体 结合。标本中抗原量含量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，最后的显色也愈浅。小分子 激素、药物等 ELISA 测定多用此法
延伸阅读10-3土壤重金属污染的植物修复 一、植物修复重金属污染土壤的机理 以植物根系为中心聚集了大量的生命物质及其分泌物，形成的极为独特的“生态修复单 元”一根际圈，是土壤重金属污染植物修复的主要场所。根际圈通过植物根及其分泌物质 和微生物、土壤动物的新陈代谢活动对污染物产生吸收、吸附、降解等一系列活动，它对土 壤重金属污染植物修复起到很重要的作用。 超富集（积累）植物能超量吸收和积累重金属，即使在外界重金属浓度很低时，其体内 重金属的含量仍比普通植物高10倍甚至上百倍，因而常用于植物修复。用植物修复被重金 属污染的土壤是指通过超富集植物(hyper accumulator)及其共存微生物体系吸收、挥发、 根滤、降解、稳定重金属，再经过植物的积累、吸收、转运去除土壤中有害重金属污染物， 是一种低成本、更有效的绿色技术。超富集植物对重金属的富集机理的研究近些年来取得了 极大的进展，多数研究认为超富集植物对重金属的解毒机理主要包括：植物根部对重金属离 子的吸收转运，重金属在植物体内的转化、螯合和区室化，以及植物本身的抗氧化系统。许 多与这些过程相关蛋白的基因己经被克隆和分离出来。 二、超富集植物的种质资源 不同种类的植物修复重金属污染土壤时所起的作用不同，有的是植物提取，有的是植物 稳定，有的是植物挥发（图S10-5)。目前植物挥发多只用于可挥发性重金属（汞和硒）： 经学者实验得知，不同种类植物对同一种重金属的累积量不同，同一种植物对不同重金属的 累积量不同，同一植物不同部位对重金属的累积量不同，植物在未被污染土壤和污染土壤中 对重金属的累积量不同.目前学者研究发现可用于重金属污染土壤修复的植物主要有以下几 种，并得出它们在一定条件下的累积量
延伸阅读 10-3 土壤重金属污染的植物修复 一、植物修复重金属污染土壤的机理 以植物根系为中心聚集了大量的生命物质及其分泌物，形成的极为独特的“生态修复单 元”——根际圈，是土壤重金属污染植物修复的主要场所。根际圈通过植物根及其分泌物质 和微生物、土壤动物的新陈代谢活动对污染物产生吸收、吸附、降解等一系列活动，它对土 壤重金属污染植物修复起到很重要的作用。 超富集（积累）植物能超量吸收和积累重金属，即使在外界重金属浓度很低时，其体内 重金属的含量仍比普通植物高 10 倍甚至上百倍，因而常用于植物修复。用植物修复被重金 属污染的土壤是指通过超富集植物（hyper accumulator）及其共存微生物体系吸收、挥发、 根滤、降解、稳定重金属，再经过植物的积累、吸收、转运去除土壤中有害重金属污染物， 是一种低成本、更有效的绿色技术。超富集植物对重金属的富集机理的研究近些年来取得了 极大的进展，多数研究认为超富集植物对重金属的解毒机理主要包括：植物根部对重金属离 子的吸收转运，重金属在植物体内的转化、螯合和区室化，以及植物本身的抗氧化系统。许 多与这些过程相关蛋白的基因已经被克隆和分离出来。 二、超富集植物的种质资源 不同种类的植物修复重金属污染土壤时所起的作用不同，有的是植物提取，有的是植物 稳定，有的是植物挥发（图 S10-5）。目前植物挥发多只用于可挥发性重金属（汞和硒）； 经学者实验得知，不同种类植物对同一种重金属的累积量不同，同一种植物对不同重金属的 累积量不同，同一植物不同部位对重金属的累积量不同，植物在未被污染土壤和污染土壤中 对重金属的累积量不同.目前学者研究发现可用于重金属污染土壤修复的植物主要有以下几 种，并得出它们在一定条件下的累积量
图S10-5超富集植物 (1)能源植物。近年的相关研究表明，多年生高大禾草柳枝稷、荻、芦竹、杂交狼尾 草是4种应用前景广阔的草本能源植物.它们生长迅速，生物质产量高，适应性广，抗逆性 强，可以在边际土地上开展规模化种植与应用在一定条件下，柳枝稷、荻、芦竹、杂交狼 尾草的生物质产量较高，分别为23.23t/hm2、28.22thm2、47.08t/hm2、59.22t/hm2.杂交狼 尾草对砷、汞、铜、铅、镉的绝对富集量分别为23.12g/hm2、0.35ghm2、1132.62g/hm2、 95.18g/hm2、6.07ghm2,芦竹对铬的绝对富集量达到1333.37g小hm2。草本能源植物对重金 属污染土壤具有一定的修复潜力，且不受重金属轻度污染的明显负面影响，因此其重金属绝 对富集量可观并以杂交狼尾草最大，芦竹、荻、柳枝稷次之 (2)羽扇豆(White lupin plant)的植物稳定作用：用于镉(Cd)和砷(As)的植物稳 定。而遏蓝菜、龙葵、宝山堇菜、鱼腥草、西芹、黑麦草、大花月见草、早熟禾、羽衣甘蓝、 曼陀罗等对土壤Cd有较强的富集作用。 (3)耕作植物和非耕作植物。有学者对两种耕作植物甘蓝和玉米，两种非耕作植物酸 模和毛蕊花实验发现，在一定条件下，对于重金属铬，毛蕊花的累积量最大，甘蓝的累积量 最小：甘蓝根部(69肚9ugg)对铬的积累量比地上部分(1.30.6-4.9+2ugg)大的多：边叶 (4.9+2.7gg)比内叶(1.3壮0.6gg)的积累量要大。 (4)原生植物。目前研究发现，以下原生植物可以在重金属含量较高的土壤中种植， 比其它高敏感植物表现出更高的重金属耐力：有菊科(Asteraceae)的矢车菊属植物虎尾草
图 S10-5 超富集植物 （1）能源植物。近年的相关研究表明，多年生高大禾草柳枝稷、荻、芦竹、杂交狼尾 草是 4 种应用前景广阔的草本能源植物.它们生长迅速，生物质产量高，适应性广，抗逆性 强，可以在边际土地上开展规模化种植与应用.在一定条件下，柳枝稷、荻、芦竹、杂交狼 尾草的生物质产量较高，分别为 23.23 t/hm2、28.22 t/hm2、47.08 t/hm2、59.22 t/hm2 .杂交狼 尾草对砷、汞、铜、铅、镉的绝对富集量分别为 23.12 g/hm2、0.35 g/hm2、1132.62 g/hm2、 95.18 g/hm2、6.07 g/hm2，芦竹对铬的绝对富集量达到 1333.37 g/hm2。草本能源植物对重金 属污染土壤具有一定的修复潜力，且不受重金属轻度污染的明显负面影响，因此其重金属绝 对富集量可观.并以杂交狼尾草最大，芦竹、荻、柳枝稷次之. （2）羽扇豆（White lupin plant）的植物稳定作用：用于镉（Cd）和砷（As）的植物稳 定。而遏蓝菜、龙葵、宝山堇菜、鱼腥草、西芹、黑麦草、大花月见草、早熟禾、羽衣甘蓝、 曼陀罗等对土壤 Cd 有较强的富集作用。 （3）耕作植物和非耕作植物。有学者对两种耕作植物甘蓝和玉米，两种非耕作植物酸 模和毛蕊花实验发现，在一定条件下，对于重金属铬，毛蕊花的累积量最大，甘蓝的累积量 最小；甘蓝根部（69±9 μg/g）对铬的积累量比地上部分（1.3±0.6–4.9±2 μg/g）大的多；边叶 （4.9±2.7 μg/g）比内叶（1.3±0.6 μg/g）的积累量要大。 （4）原生植物。目前研究发现，以下原生植物可以在重金属含量较高的土壤中种植， 比其它高敏感植物表现出更高的重金属耐力：有菊科（Asteraceae）的矢车菊属植物虎尾草
豆科(Leguminosae)的紫云英属植物，藜科(Chenopodiaceae)的香藜属植物，禾本科 (Gramineae)的针茅属植物半枝莲，唇形科(Lemiaceae)新塔花属的唇形草，菊科(Cmpositae) 的刺头菊属植物和蓟属植物，禾本科臭草属的新疆齿缘草，毛蕊属植物等
豆科（Leguminosae）的紫云英属植物，藜科（Chenopodiaceae）的香藜属植物，禾本科 （Gramineae）的针茅属植物半枝莲，唇形科（Lemiaceae）新塔花属的唇形草，菊科（Cmpositae） 的刺头菊属植物和蓟属植物，禾本科臭草属的新疆齿缘草，毛蕊属植物等
