第3章延伸阅读 延伸阅读3-1植物组织培养常用的消毒剂及除菌方法 常用的灭菌方法可分为物理的和化学的两类，即：物理方法如干热（烘烧和灼烧）、湿 热（常压或高压蒸煮）、射线处理（紫外线、超声波、微波）、过滤、清洗和大量无菌水冲洗 等措施：化学方法是使用升汞、甲醛、过氧化氢、高锰酸钾、来苏水、漂白粉、次氯酸钠、 抗菌素、酒精化学药品处理。这些方法和药剂要根据工作中的不同材料不同目的适当选用。 一、湿热灭菌 湿热灭菌常用于植物组织细胞培养的培养基的灭菌。培养基在制备后的24小时内完成 灭菌工序。高压灭菌的原理是：在密闭的蒸锅内，其中的蒸汽不能外溢，压力不断上升，使 水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之增加。在0.1MPa的压力下，锅内温度达121℃。 在此蒸汽温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。 注意完全排除锅内空气，使锅内全部是水蒸气，灭菌才能彻底。高压灭菌放气有几种不 同的做法，但目的都是要排净空气，使锅内均匀升温，保证灭菌彻底。常用方法是：关闭放 气阀，通电后，待压力上升到0.05MPa时，打开放气阀，放出空气，待压力表指针归零后， 再关闭放气阀。关阀再通电后，压力表上升达到0.1MPa时，开始计时，维持压力0.1~0.15 MPa,20min。 按容器大小不同，保压时间有所不同。见表$3-1。该表所列数字是彻底灭菌很保险的 数字，如果容器体积较大，但是放置的数量很少，也可以减少时间。 表S3-1培养基高压蒸汽灭菌所必需的最少时间 容器的体积/mL 在121℃灭菌所需最少时间/min 20-50 15 75~150 20 250500 25 1000 30 到达保压时间后，即可切断电源，在压力到0.5MPa,可缓慢放出蒸汽，应注意不要使 压力降低太快，以致引起激烈的减压沸腾，使容器中的液体四溢。当压力降到零后，才能开 盖，取出培养基，摆在平台上，以待冷凝。不可久不放气，引起培养基成分变化，以至培养 基无法摆斜面。一旦放置过久，由于锅炉内有负压，盖子打不开，只要将放气阀打开，大气
第 3 章 延伸阅读 延伸阅读 3-1 植物组织培养常用的消毒剂及除菌方法 常用的灭菌方法可分为物理的和化学的两类，即：物理方法如干热（烘烧和灼烧）、湿 热（常压或高压蒸煮）、射线处理（紫外线、超声波、微波）、过滤、清洗和大量无菌水冲洗 等措施；化学方法是使用升汞、甲醛、过氧化氢、高锰酸钾、来苏水、漂白粉、次氯酸钠、 抗菌素、酒精化学药品处理。这些方法和药剂要根据工作中的不同材料不同目的适当选用。 一、湿热灭菌 湿热灭菌常用于植物组织细胞培养的培养基的灭菌。培养基在制备后的 24 小时内完成 灭菌工序。高压灭菌的原理是：在密闭的蒸锅内，其中的蒸汽不能外溢，压力不断上升，使 水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之增加。在 0.1 MPa 的压力下，锅内温度达 121℃。 在此蒸汽温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。 注意完全排除锅内空气，使锅内全部是水蒸气，灭菌才能彻底。高压灭菌放气有几种不 同的做法，但目的都是要排净空气，使锅内均匀升温，保证灭菌彻底。常用方法是：关闭放 气阀，通电后，待压力上升到 0.05 MPa 时，打开放气阀，放出空气，待压力表指针归零后， 再关闭放气阀。关阀再通电后，压力表上升达到 0.1MPa 时，开始计时，维持压力 0.1～0.15 MPa，20 min。 按容器大小不同，保压时间有所不同。见表 S3-1。该表所列数字是彻底灭菌很保险的 数字，如果容器体积较大，但是放置的数量很少，也可以减少时间。 表 S3-1 培养基高压蒸汽灭菌所必需的最少时间 容器的体积/mL 在 121℃灭菌所需最少时间/min 20~50 15 75~150 20 250~500 25 1000 30 到达保压时间后，即可切断电源，在压力到 0.5 MPa，可缓慢放出蒸汽，应注意不要使 压力降低太快，以致引起激烈的减压沸腾，使容器中的液体四溢。当压力降到零后，才能开 盖，取出培养基，摆在平台上，以待冷凝。不可久不放气，引起培养基成分变化，以至培养 基无法摆斜面。一旦放置过久，由于锅炉内有负压，盖子打不开，只要将放气阀打开，大气
压入，内外压力平衡，盖子便易打开了。 对高压灭菌后不变质的物品，如无菌水、栽培介质、接种工具，可以延长灭菌时间或提 高压力。而培养基要严格遵守保压时间，既要保压彻底，又要防止培养基中的成分变质或效 力降低，不能随意延长时间。 对于一些布制品，如实验衣、口罩等也可用高压灭菌。洗净晾干后用耐高压塑料袋装好， 高压灭局20~30min。 高压灭菌前后的培养基，其pH值下降0.2~0.3单位。高压后培养基pH值的变化方向 和幅度取决于多种因素。培养基中成分单一时和培养基中含有高或较高浓度物质时，高压灭 菌后的pH值变化幅度较大，甚至可大于2个pH值单位。环境pH值的变化大于0.5单位就 有可能产生明显的生理影响。 高压灭菌通常会使培养基中的蔗糖水解为单糖，从而改变培养基的渗透压。在8%~20% 蔗糖范围内，高压灭菌后的培养基约升高0.43倍。 培养基中的铁在高压灭菌时会催化蔗糖水解，可使15%~25%的蔗糖水解为葡萄糖和果 糖。培养基pH值小于5.5，其水解量更多，培养基中添加0.1%活性炭时，高压下蔗糖水解 大大增强，添加1%活性炭，蔗糖水解率可达5%。 为防止高压灭菌产生的上述一些变化可用下列方法： (1)经常注意搜集有关高压灭菌影响培养基成分的资料，以便及时采取有效措施。 (2)设计培养基配方时尽量采用效果类似的稳定试剂并准确掌握剂量。如避免使用果 糖和山梨醇而用甘露醇，以吲哚丁酸(indole butyric acid,BA)代替吲l哚乙酸(indole-3-acetic acid,IAA),控制活性炭的用量（在0.1%以下）注意pH值对高压灭菌下培养基中成分的影 响等。 (3)配制培养基时应注意成分的适当分组与加入的顺序。如将磷、钙和铁放在最后加 入。 (4)注意高压灭菌后培养基pH值的变化及恢复动态。如高压灭菌后的pH值常由5.8 升高至6.48。而96h后又会降至5.8左右。这样在实验中就可以根据这一规律加以掌握。 二、灼烧灭菌 灼烧灭菌主要用于无菌操作的器械的灭菌。在无菌操作时，把镊子、剪刀、解剖刀等浸 入95%的酒精中，使用之前取出在酒精灯火焰上灼烧灭菌。冷却后，立即使用。操作中可 采用250或500mL的广口瓶，放入95%的酒精，以便插入工具
压入，内外压力平衡，盖子便易打开了。 对高压灭菌后不变质的物品，如无菌水、栽培介质、接种工具，可以延长灭菌时间或提 高压力。而培养基要严格遵守保压时间，既要保压彻底，又要防止培养基中的成分变质或效 力降低，不能随意延长时间。 对于一些布制品，如实验衣、口罩等也可用高压灭菌。洗净晾干后用耐高压塑料袋装好， 高压灭局 20～30 min。 高压灭菌前后的培养基，其 pH 值下降 0.2～0.3 单位。高压后培养基 pH 值的变化方向 和幅度取决于多种因素。培养基中成分单一时和培养基中含有高或较高浓度物质时，高压灭 菌后的 pH 值变化幅度较大，甚至可大于 2 个 pH 值单位。环境 pH 值的变化大于 0.5 单位就 有可能产生明显的生理影响。 高压灭菌通常会使培养基中的蔗糖水解为单糖，从而改变培养基的渗透压。在 8%～20% 蔗糖范围内，高压灭菌后的培养基约升高 0.43 倍。 培养基中的铁在高压灭菌时会催化蔗糖水解，可使 15%～25%的蔗糖水解为葡萄糖和果 糖。培养基 pH 值小于 5.5，其水解量更多，培养基中添加 0.1%活性炭时，高压下蔗糖水解 大大增强，添加 1%活性炭，蔗糖水解率可达 5%。 为防止高压灭菌产生的上述一些变化可用下列方法： （1）经常注意搜集有关高压灭菌影响培养基成分的资料，以便及时采取有效措施。 （2）设计培养基配方时尽量采用效果类似的稳定试剂并准确掌握剂量。如避免使用果 糖和山梨醇而用甘露醇，以吲哚丁酸（indole butyric acid，IBA）代替吲哚乙酸（indole-3-acetic acid，IAA），控制活性炭的用量（在 0.1%以下）注意 pH 值对高压灭菌下培养基中成分的影 响等。 （3）配制培养基时应注意成分的适当分组与加入的顺序。如将磷、钙和铁放在最后加 入。 （4）注意高压灭菌后培养基 pH 值的变化及恢复动态。如高压灭菌后的 pH 值常由 5.8 升高至 6.48。而 96 h 后又会降至 5.8 左右。这样在实验中就可以根据这一规律加以掌握。 二、灼烧灭菌 灼烧灭菌主要用于无菌操作的器械的灭菌。在无菌操作时，把镊子、剪刀、解剖刀等浸 入 95%的酒精中，使用之前取出在酒精灯火焰上灼烧灭菌。冷却后，立即使用。操作中可 采用 250 或 500 mL 的广口瓶，放入 95%的酒精，以便插入工具
三、干热灭菌 干热灭菌主要用于玻璃器皿及耐热用具的灭菌。干热灭菌是利用烘箱加热到160~ 180℃的温度来杀死微生物。由于在干热条件下，细菌的营养细胞的抗热性大为提高，接近 芽孢的抗热水平，通常采用170℃持续90mi来灭菌。干热灭菌的物品要预先洗净并干燥， 工具等要妥为包扎，以免灭菌后取用时重新污染。包扎可用耐高温的塑料。灭菌时应渐进升 温，达到预定温度后记录时间。烘箱内放置的物品的数量不宜过多，以免防碍热对流和穿透， 到指定时间断电后，待充分冷凉，才能打开烘箱，以免因骤冷而使器皿破裂。干热灭菌能源 消耗太大，浪费时间。 四、过滤灭菌 一些生长调节剂，如赤霉素、玉米素、脱落酸和某些微生物是不耐热的，不能用高压灭 菌处理，通常采用过滤灭菌方法。 些化学成分在高温高压下会发生降解而失去效能或降低效能。经高温灭菌后赤霉素 GA3的活性仅及不经高温灭菌的新鲜溶液的10%。蔗糖经高温后部分被降解成D-葡萄糖和 D-果糖，果糖又可被部分水解，产生抑制培养的植物组织生长的物质。高温还可使碳水化 合物和氨基酸发生反应。维生素具有不同程度的热稳定性，但如果培养基的pH值高于5.5， 则维生素B1会被迅速降解。泛酸钙、植物组织提取物等要过滤灭菌，不能高温灭菌，否则 会失去作用。 防细菌滤膜的网孔的直径为0.45以下，当溶液通过滤液后，细菌的细胞和真菌的孢 子等因大于滤膜直径而被阻，在需要过滤灭菌的液体量大时，常使用抽滤装置：液量小时， 可用注射器。使用前对其高压灭菌，将滤膜装在注射器的靠针管处，将待过滤的液体装入注 射器，推压注射器活塞杆，溶液压出滤膜，从针管压出的溶液就是无菌溶液。 过滤除菌操作步骤：首先将过滤器、接液瓶用纸包好，滤膜可放在培养皿内用纸包好。 使用前先经121℃高压蒸汽灭菌30mi:在超净工作台上，将滤器装置装好，用灭菌无齿镊 子将滤膜安放在隔板上，滤膜粗糙面向上：然后将待除菌的液体注入滤器内，开动真空泵即 可过滤除菌。滤液经培养证明无菌生长后可保存备用。 五、紫外线和熏蒸灭菌 紫外线和熏蒸灭菌主要用于培养或接种空间的灭菌。常见使用方法如下。 (1)紫外线灭菌在接种室、超净台上或接种箱用紫外灯灭菌。紫外线灭菌是利用辐射 因子灭菌，细菌吸收紫外线后，蛋白质和核酸发生结构变化，引起细菌的染色体变异，造成
三、干热灭菌 干热灭菌主要用于玻璃器皿及耐热用具的灭菌。干热灭菌是利用烘箱加热到 160～ 180℃的温度来杀死微生物。由于在干热条件下，细菌的营养细胞的抗热性大为提高，接近 芽孢的抗热水平，通常采用 170℃持续 90 min 来灭菌。干热灭菌的物品要预先洗净并干燥， 工具等要妥为包扎，以免灭菌后取用时重新污染。包扎可用耐高温的塑料。灭菌时应渐进升 温，达到预定温度后记录时间。烘箱内放置的物品的数量不宜过多，以免防碍热对流和穿透， 到指定时间断电后，待充分冷凉，才能打开烘箱，以免因骤冷而使器皿破裂。干热灭菌能源 消耗太大，浪费时间。 四、过滤灭菌 一些生长调节剂，如赤霉素、玉米素、脱落酸和某些微生物是不耐热的，不能用高压灭 菌处理，通常采用过滤灭菌方法。 一些化学成分在高温高压下会发生降解而失去效能或降低效能。经高温灭菌后赤霉素 GA3 的活性仅及不经高温灭菌的新鲜溶液的 10%。蔗糖经高温后部分被降解成 D-葡萄糖和 D-果糖，果糖又可被部分水解，产生抑制培养的植物组织生长的物质。高温还可使碳水化 合物和氨基酸发生反应。维生素具有不同程度的热稳定性，但如果培养基的 pH 值高于 5.5， 则维生素 B1会被迅速降解。泛酸钙、植物组织提取物等要过滤灭菌，不能高温灭菌，否则 会失去作用。 防细菌滤膜的网孔的直径为 0.45 μm 以下，当溶液通过滤液后，细菌的细胞和真菌的孢 子等因大于滤膜直径而被阻，在需要过滤灭菌的液体量大时，常使用抽滤装置；液量小时， 可用注射器。使用前对其高压灭菌，将滤膜装在注射器的靠针管处，将待过滤的液体装入注 射器，推压注射器活塞杆，溶液压出滤膜，从针管压出的溶液就是无菌溶液。 过滤除菌操作步骤：首先将过滤器、接液瓶用纸包好，滤膜可放在培养皿内用纸包好。 使用前先经 121℃高压蒸汽灭菌 30 min；在超净工作台上，将滤器装置装好，用灭菌无齿镊 子将滤膜安放在隔板上，滤膜粗糙面向上；然后将待除菌的液体注入滤器内，开动真空泵即 可过滤除菌。滤液经培养证明无菌生长后可保存备用。 五、紫外线和熏蒸灭菌 紫外线和熏蒸灭菌主要用于培养或接种空间的灭菌。常见使用方法如下。 （1）紫外线灭菌在接种室、超净台上或接种箱用紫外灯灭菌。紫外线灭菌是利用辐射 因子灭菌，细菌吸收紫外线后，蛋白质和核酸发生结构变化，引起细菌的染色体变异，造成
死亡。紫外线的波长为200-300nm,其中260nm的杀菌能力最强，但是由于紫外线的穿透 能力很弱，所以只适于空气和物体表面的灭菌，而且要求距照射物以不超过1.2m为宜。 (2)熏蒸灭菌用加热焚烧、氧化等方法，使化学药剂变为气体状态扩散到空气中，以 杀死空气和物体表面的微生物。这种方法简便，只需要把消毒的空间关闭紧密即可。 化学消毒剂的种类很多，它们使微生物的蛋白质变性，或竞争其酶系统，或降低其表面 张力，增加菌体细胞浆膜的通透性，使细胞破裂或溶解。一般说来，温度越高，作用时间越 长，杀菌效果越好。另外，由于消毒剂必须溶解于水才能发挥作用，所以要制成水溶状态， 如升汞与高锰酸钾。还有消毒剂的浓度一般是浓度越大，杀菌能力越强，但石炭酸和酒精例 外。 常用熏蒸剂是甲醛，熏蒸时，房间关闭紧密，按5~8mL/m3用量，将甲醛置于广口容 器中，加5gm3高锰酸钾氧化挥发。熏蒸时，房间可预先喷湿以加强效果。冰醋酸也可进行 加热熏蒸，但效果不如甲醛。 六、药剂喷雾灭菌 药剂喷雾灭菌常用于一些物体表面的灭菌。物体表面可用一些药剂涂搽，喷雾灭菌。如 桌面、墙面、双手、植物材料表面等，可用75%的酒精反复涂搽灭菌，1%~2%的来苏儿溶 液以及0.25%~1%的新洁尔灭也可以。 七、消毒剂灭菌 消毒剂常用于植物材料表面灭菌。从外界或室内选取的植物材料，都不同程度地带有各 种微生物。这些污染源一旦带入培养基，便会造成培养基污染。因此，植物材料必须经严格 的表面灭菌处理，再经无菌操作手续接种到培养基上，这一过程叫做接种。接种的植物材料 叫做外植体(explant)。 植物组培抗菌剂(plant preservative mixture,PPM)它是一种广谱抗微生物剂，可以杀 死细菌和真菌细胞，防止真菌孢子的萌发，并在较高浓度下能消除内源性污染的外植体。 首先，将采来的植物材料除去不用的部分，将需要的部分仔细洗干净，如用适当的刷子 等刷洗。把材料切割成适当大小，即灭菌容器能放入为宜。置自来水龙头下流水冲洗几分钟 至数小时，冲洗时间视材料清洁程度而宜。易漂浮或细小的材料，可装入纱布袋内冲洗。流 水冲洗在污染严重时特别有用。 洗时可加入洗衣粉清洗，然后再用自来水冲洗洗衣粉水。洗衣粉可除去轻度附着在植物 表面的污物，除去脂质性的物质，便于灭菌液的直接接触。当然，最理想的清洗物质是表面
死亡。紫外线的波长为 200~300 nm，其中 260 nm 的杀菌能力最强，但是由于紫外线的穿透 能力很弱，所以只适于空气和物体表面的灭菌，而且要求距照射物以不超过 1.2 m 为宜。 （2）熏蒸灭菌用加热焚烧、氧化等方法，使化学药剂变为气体状态扩散到空气中，以 杀死空气和物体表面的微生物。这种方法简便，只需要把消毒的空间关闭紧密即可。 化学消毒剂的种类很多，它们使微生物的蛋白质变性，或竞争其酶系统，或降低其表面 张力，增加菌体细胞浆膜的通透性，使细胞破裂或溶解。一般说来，温度越高，作用时间越 长，杀菌效果越好。另外，由于消毒剂必须溶解于水才能发挥作用，所以要制成水溶状态， 如升汞与高锰酸钾。还有消毒剂的浓度一般是浓度越大，杀菌能力越强，但石炭酸和酒精例 外。 常用熏蒸剂是甲醛，熏蒸时，房间关闭紧密，按 5～8 mL/m3用量，将甲醛置于广口容 器中，加 5 g/m3高锰酸钾氧化挥发。熏蒸时，房间可预先喷湿以加强效果。冰醋酸也可进行 加热熏蒸，但效果不如甲醛。 六、药剂喷雾灭菌 药剂喷雾灭菌常用于一些物体表面的灭菌。物体表面可用一些药剂涂搽，喷雾灭菌。如 桌面、墙面、双手、植物材料表面等，可用 75%的酒精反复涂搽灭菌，1%～2%的来苏儿溶 液以及 0.25%～1%的新洁尔灭也可以。 七、消毒剂灭菌 消毒剂常用于植物材料表面灭菌。从外界或室内选取的植物材料，都不同程度地带有各 种微生物。这些污染源一旦带入培养基，便会造成培养基污染。因此，植物材料必须经严格 的表面灭菌处理，再经无菌操作手续接种到培养基上，这一过程叫做接种。接种的植物材料 叫做外植体（explant)。 植物组培抗菌剂（plant preservative mixture，PPM）它是一种广谱抗微生物剂，可以杀 死细菌和真菌细胞，防止真菌孢子的萌发，并在较高浓度下能消除内源性污染的外植体。 首先，将采来的植物材料除去不用的部分，将需要的部分仔细洗干净，如用适当的刷子 等刷洗。把材料切割成适当大小，即灭菌容器能放入为宜。置自来水龙头下流水冲洗几分钟 至数小时，冲洗时间视材料清洁程度而宜。易漂浮或细小的材料，可装入纱布袋内冲洗。流 水冲洗在污染严重时特别有用。 洗时可加入洗衣粉清洗，然后再用自来水冲洗洗衣粉水。洗衣粉可除去轻度附着在植物 表面的污物，除去脂质性的物质，便于灭菌液的直接接触。当然，最理想的清洗物质是表面
活性物质吐温。 第二步是对材料的表面浸润灭菌。要在超净台或接种箱内完成，准备好消毒的烧杯、玻 璃棒、70%酒精、消毒液、无菌水、手表等。用70%酒精浸泡10~30秒。由于酒精具有使 植物材料表面被浸湿的作用，加之70%酒精穿透力强，也很易杀伤植物细胞，所以浸润时 间不能过长。有一些特殊的材料，如果实、花蕾、包有苞片、苞叶等的孕穗，多层鳞片的休 眠芽等等，以及主要取用内部的材料，则可只用70%酒精处理稍长的时间。处理完的材料 在无菌条件下，待酒精蒸发后再剥除外层，取用内部材料。 第三步是用灭菌剂处理。表面灭菌剂的种类较多，可根据情况选取1~2种使用（表$3-2）。 表S3-2常用灭菌剂使用浓度及效果比较 灭菌剂名称 使用浓度 灭菌时间/min 灭菌效果 酒精 70-75% 0.1-3 好 氯化汞 0.1-0.2% 2~10 很好 漂白粉 饱和溶液% 5-30 很好 次氯酸钙 9-10% 5-30 很好 次氯酸钠 2% 5-30 很好 过氧化氢 10-12% 515 好 抗菌素 4-50mg/L 30-60 较好 上述灭菌剂应在使用前临时配制，氯化汞可短期内储用。次氯酸钠和次氯酸钙都是利用 分解产生氯气来杀菌的，故灭菌时用广口瓶加盖较好：升汞是由重金属汞离子来达到灭菌的： 过氧化氢是分解中释放原子态氧来杀菌的，这种药剂残留的影响较小，灭菌后用无菌水漂洗 3~4次即可：由于升汞液灭菌的材料，难以对升汞残毒去除，所以应当用无菌水漂洗8~10 次，每次不少于3min,以尽量去除残毒。 灭菌时，不沥干的植物材料转放到烧杯或其他器皿中，记好时间，倒入消毒溶液，不时 用玻璃棒轻轻搅动，以促进材料各部分与消毒溶液充分接触，驱除气泡，使消毒彻底。在快 到时间之前1~2mi,开始把消毒液倾入一备好的大烧杯内，要注意勿使材料倒出，倾倒 干净后立即倒入无菌水，轻搅漂洗。灭菌时间是从倒入消毒液开始，至倒入无菌水时为止。 记录时间还便于比较消毒效果，以便改正。灭菌液要充分浸没材料。宁可多用些灭菌液，切 勿勉强在一个体积偏小的容器中使用很多材料灭菌。 在灭菌溶液中加吐温-80或tritonX效果较好，这些表面活性剂主要作用是使药剂更易
活性物质吐温。 第二步是对材料的表面浸润灭菌。要在超净台或接种箱内完成，准备好消毒的烧杯、玻 璃棒、70%酒精、消毒液、无菌水、手表等。用 70%酒精浸泡 10～30 秒。由于酒精具有使 植物材料表面被浸湿的作用，加之 70%酒精穿透力强，也很易杀伤植物细胞，所以浸润时 间不能过长。有一些特殊的材料，如果实、花蕾、包有苞片、苞叶等的孕穗，多层鳞片的休 眠芽等等，以及主要取用内部的材料，则可只用 70%酒精处理稍长的时间。处理完的材料 在无菌条件下，待酒精蒸发后再剥除外层，取用内部材料。 第三步是用灭菌剂处理。表面灭菌剂的种类较多，可根据情况选取 1～2 种使用（表 S3-2）。 表 S3-2 常用灭菌剂使用浓度及效果比较 灭菌剂名称 使用浓度 灭菌时间/min 灭菌效果 酒精 70~75% 0.1~3 好 氯化汞 0.1~0.2% 2~10 很好 漂白粉 饱和溶液% 5~30 很好 次氯酸钙 9~10% 5~30 很好 次氯酸钠 2% 5~30 很好 过氧化氢 10~12% 5~15 好 抗菌素 4~50mg/L 30~60 较好 上述灭菌剂应在使用前临时配制，氯化汞可短期内储用。次氯酸钠和次氯酸钙都是利用 分解产生氯气来杀菌的，故灭菌时用广口瓶加盖较好；升汞是由重金属汞离子来达到灭菌的； 过氧化氢是分解中释放原子态氧来杀菌的，这种药剂残留的影响较小，灭菌后用无菌水漂洗 3～4 次即可；由于升汞液灭菌的材料，难以对升汞残毒去除，所以应当用无菌水漂洗 8～10 次，每次不少于 3 min，以尽量去除残毒。 灭菌时，不沥干的植物材料转放到烧杯或其他器皿中，记好时间，倒入消毒溶液，不时 用玻璃棒轻轻搅动，以促进材料各部分与消毒溶液充分接触，驱除气泡，使消毒彻底。在快 到时间之前 1～2 min，开始把消毒液倾入一备好的大烧杯内，要注意勿使材料倒出，倾倒 干净后立即倒入无菌水，轻搅漂洗。灭菌时间是从倒入消毒液开始，至倒入无菌水时为止。 记录时间还便于比较消毒效果，以便改正。灭菌液要充分浸没材料。宁可多用些灭菌液，切 勿勉强在一个体积偏小的容器中使用很多材料灭菌。 在灭菌溶液中加吐温-80 或 triton X 效果较好，这些表面活性剂主要作用是使药剂更易
于展布，更容易浸入到灭菌的材料表面。但吐温加入后对材料的伤害也在增加，应注意吐温 的用量和灭菌时间，一般加入灭菌液的0.5%，即在100mL加入15滴。 最后一步是用无菌水漂洗，漂洗要求3min左右，视采用的消毒液种类，漂洗3~10次 左右。无菌水漂洗作用是免除消毒剂杀伤植物细胞的副作用
于展布，更容易浸入到灭菌的材料表面。但吐温加入后对材料的伤害也在增加，应注意吐温 的用量和灭菌时间，一般加入灭菌液的 0.5%，即在 100 mL 加入 15 滴。 最后一步是用无菌水漂洗，漂洗要求 3 min 左右，视采用的消毒液种类，漂洗 3～10 次 左右。无菌水漂洗作用是免除消毒剂杀伤植物细胞的副作用
延伸阅读3-2植物培养基成分 培养基犹如植物生长的土壤，是组织培养中离体材料赖以生存和发展的基地。培养基是 人工配制的，满足植物材料生长、繁殖或积累代谢产物的各类营养物质。在离体培养条件下， 不同种类植物对营养的要求不同，甚至同一种植物不同部位的组织以及不同培养阶段对营养 要求也不相同。筛选合适的培养基是植物组织培养极其重要的内容，是决定成败的关键因素 之一。大多数培养基的成分是由水、无机营养物、有机营养物质、生长调节物质和天然附加 物等五类物质组成。 ①水：一般用蒸馏水或去离子水配制培养基，煮沸过的自来水也可利用。 ②无机营养：无机营养包括大量和微量元素，对硝酸铵等用量较大的无机盐通常先按配 方表配成10倍的混合母液。植物必需的微量元素因用量小，常配成100倍或者1000倍的 母液。 ③有机营养：有机营养主要有糖、氨基酸和维生素。糖为培养物提供所需要的碳源，并 有调节渗透压的作用。常用的是2%~4%的蔗糖，有时也加入葡萄糖和果糖等。一般来说， 以蔗糖为碳源时，离体的双子叶植物的根长得较好，而以葡萄糖为碳源时，单子叶植物的根 长得较好。己知植物能够利用的其他形式的碳源有麦芽糖、半乳糖、甘露糖和乳糖，有的还 能利用淀粉。 维生素和氨基酸类的物质，主要有硫胺素（维生素B1)、吡哆素（维生素B6)、烟酸（维 生素B:)、泛酸（维生素B5)以及甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、肌醇和水解酪蛋白等。 ④天然附加物：培养时有时还加一些天然的有机物，如椰子乳、酵母提取物、玉米胚乳、 麦芽浸出物或番茄汁等。它们对愈伤组织的诱导和分化往往是有益的。 ⑤植物生长物质：常用的有生长素类和细胞分裂素两类。生长素类如2,4-D、萘乙酸、 BA、AA等被用于诱导细胞的分裂和根的分化。IAA易被光和酶氧化分解，所以加入的浓 度较高，常为130mg/L,NAA、2,4-D的浓度则以0.1~2mg/L为宜：细胞分裂素如激动 素、6苄基腺嘌呤、异戊烯基腺嘌呤、玉米素等可以促进细胞分裂和诱导愈伤组织或器官分 化不定芽。它们常用的浓度为0.01~1mgL。在初代培养中，一般都须加入激素类物质，但 随着继代培养次数的增加，加入量可逐代减少，最终常可做到“激素自养”。离体培养物的根 芽分化取决于生长素/细胞分裂素的比值（可参阅植物组织培养专业书刊）。吲哚乙酸以及酶 和维生素C等因在高温高压灭菌时易遭破坏，故使用时以过滤或抽滤灭菌为好。 培养基的配制方法有两种，一是直接称取法，即按照培养基的成分，逐一称取，溶解后
延伸阅读 3-2 植物培养基成分 培养基犹如植物生长的土壤，是组织培养中离体材料赖以生存和发展的基地。培养基是 人工配制的，满足植物材料生长、繁殖或积累代谢产物的各类营养物质。在离体培养条件下， 不同种类植物对营养的要求不同，甚至同一种植物不同部位的组织以及不同培养阶段对营养 要求也不相同。筛选合适的培养基是植物组织培养极其重要的内容，是决定成败的关键因素 之一。大多数培养基的成分是由水、无机营养物、有机营养物质、生长调节物质和天然附加 物等五类物质组成。 ①水：一般用蒸馏水或去离子水配制培养基，煮沸过的自来水也可利用。 ②无机营养：无机营养包括大量和微量元素，对硝酸铵等用量较大的无机盐通常先按配 方表配成 10 倍的混合母液。植物必需的微量元素因用量小，常配成 100 倍或者 1 000 倍的 母液。 ③有机营养：有机营养主要有糖、氨基酸和维生素。糖为培养物提供所需要的碳源，并 有调节渗透压的作用。常用的是 2％～4％的蔗糖，有时也加入葡萄糖和果糖等。一般来说， 以蔗糖为碳源时，离体的双子叶植物的根长得较好，而以葡萄糖为碳源时，单子叶植物的根 长得较好。已知植物能够利用的其他形式的碳源有麦芽糖、半乳糖、甘露糖和乳糖，有的还 能利用淀粉。 维生素和氨基酸类的物质，主要有硫胺素（维生素 B1）、吡哆素（维生素 B6）、烟酸（维 生素 B3）、泛酸（维生素 B5）以及甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、肌醇和水解酪蛋白等。 ④天然附加物：培养时有时还加一些天然的有机物，如椰子乳、酵母提取物、玉米胚乳、 麦芽浸出物或番茄汁等。它们对愈伤组织的诱导和分化往往是有益的。 ⑤植物生长物质：常用的有生长素类和细胞分裂素两类。生长素类如 2,4-D、萘乙酸、 IBA、IAA 等被用于诱导细胞的分裂和根的分化。IAA 易被光和酶氧化分解，所以加入的浓 度较高，常为 1～30 mg/L，NAA、2,4-D 的浓度则以 0.1～2 mg/L 为宜；细胞分裂素如激动 素、6-苄基腺嘌呤、异戊烯基腺嘌呤、玉米素等可以促进细胞分裂和诱导愈伤组织或器官分 化不定芽。它们常用的浓度为 0.01～1 mg/L。在初代培养中，一般都须加入激素类物质，但 随着继代培养次数的增加，加入量可逐代减少，最终常可做到“激素自养”。离体培养物的根 芽分化取决于生长素/细胞分裂素的比值（可参阅植物组织培养专业书刊）。吲哚乙酸以及酶 和维生素 C 等因在高温高压灭菌时易遭破坏，故使用时以过滤或抽滤灭菌为好。 培养基的配制方法有两种，一是直接称取法，即按照培养基的成分，逐一称取，溶解后
定容。此法较复杂，由于每次配制时加入的微量元素和有机物量较少，故易出差错。二是母 液法，即先按类或单个成分配成10倍或100倍等定量的母液，再取母液配成需要的培养基。 此法简便，误差小，是目前常采用的方法
定容。此法较复杂，由于每次配制时加入的微量元素和有机物量较少，故易出差错。二是母 液法，即先按类或单个成分配成 10 倍或 100 倍等定量的母液，再取母液配成需要的培养基。 此法简便，误差小，是目前常采用的方法
延伸阅读3-3植物细胞液体培养方法 植物细胞液体培养(submerged culture)是指把单细胞(single cell)或细胞团(cell aggregate)置于液体培养基中使其发育，并不断振荡，使之均匀地在悬浊液中进行培养的一 种方法。常见植物细胞液体培养的方法有以下几种方式。 (I)液体静置培养。液体静置培养(static liquid culture)就是把培养物接入培养液中 静置于培养室或光照培养箱中的培养。此种方法又分为悬浮培养和微滴培养两种，前者适合 于大量细胞的培养，后者则适于单细胞的培养。 液体静止培养的优点是培养液中不会出现营养物质浓度差异的现象，故可以用来进行许 多营养方面的研究。该方法是由R.Heller和RJ.Gautheret在矿质营养工作的基础上发展起 来的。具体做法是：试管中先放入培养液，然后放入滤纸，滤纸制成桥状的支持物，使它正 巧贴在液面上，最后把组织放在滤纸上。滤纸像灯芯一样不断给组织提供水分和养料。这种 静止培养目前很少有人使用。 (2)液体振荡（往复或旋转）培养。液体振荡(liquid shake culture)培养就是把培养 物接入培养液中，连同三角瓶放在振荡器（摇床或转床）中振荡培养的方法。振荡培养又分 为连续浸没和定期浸没两种方法。 ①连续浸没振荡培养：通过搅动培养液或振动培养液的方法使组织悬浮于培养液中。在 这类培养中，容器中培养液的体积要少些，以确保最大的气相表面，形成较好的通气条件。 一般培养液的体积占容器体积的20%。搅动可以采用磁力搅拌器，将一块用惰性塑料包裹 的小磁铁放入培养液中，在容器外面用一个小的同步电动机带动一大块磁铁，于是小磁铁跟 着大磁铁运动。培养材料置于含1520mL培养液的三角瓶中，于200~250rpm的转速下 培养。约10d继代培养一次。培养体积较大时可采用摇床（往复式或旋转式）培养。 ②定期浸没振荡培养：即组织块时而在液体中，时而在气体中，这样既可保证培养液 的充分混合，又保证了组织块呼吸所需的气体交换
延伸阅读 3-3 植物细胞液体培养方法 植物细胞液体培养 （submerged culture）是指把单细胞（single cell）或细胞团（cell aggregate）置于液体培养基中使其发育，并不断振荡，使之均匀地在悬浊液中进行培养的一 种方法。常见植物细胞液体培养的方法有以下几种方式。 （1）液体静置培养。液体静置培养（static liquid culture）就是把培养物接入培养液中 静置于培养室或光照培养箱中的培养。此种方法又分为悬浮培养和微滴培养两种，前者适合 于大量细胞的培养，后者则适于单细胞的培养。 液体静止培养的优点是培养液中不会出现营养物质浓度差异的现象，故可以用来进行许 多营养方面的研究。该方法是由 R. Heller 和 R. J. Gautheret 在矿质营养工作的基础上发展起 来的。具体做法是：试管中先放入培养液，然后放入滤纸，滤纸制成桥状的支持物，使它正 巧贴在液面上，最后把组织放在滤纸上。滤纸像灯芯一样不断给组织提供水分和养料。这种 静止培养目前很少有人使用。 （2）液体振荡（往复或旋转）培养。液体振荡（liquid shake culture）培养就是把培养 物接入培养液中，连同三角瓶放在振荡器（摇床或转床）中振荡培养的方法。振荡培养又分 为连续浸没和定期浸没两种方法。 ①连续浸没振荡培养：通过搅动培养液或振动培养液的方法使组织悬浮于培养液中。在 这类培养中，容器中培养液的体积要少些，以确保最大的气相表面，形成较好的通气条件。 一般培养液的体积占容器体积的 20％。搅动可以采用磁力搅拌器，将一块用惰性塑料包裹 的小磁铁放入培养液中，在容器外面用一个小的同步电动机带动一大块磁铁，于是小磁铁跟 着大磁铁运动。培养材料置于含 15～20 mL 培养液的三角瓶中，于 200～250 rpm 的转速下 培养。约 10 d 继代培养一次。培养体积较大时可采用摇床（往复式或旋转式）培养。 ② 定期浸没振荡培养：即组织块时而在液体中，时而在气体中，这样既可保证培养液 的充分混合，又保证了组织块呼吸所需的气体交换
延伸阅读3-4动物细胞培养方法 动物细胞培养(animal cell culture)就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单 个细胞（使用胰蛋白酶或胶原蛋白酶）然后，放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖 (图S3-1)。 动物组织 剪碎组织 酶处理 细胞悬浮液 原代培养 →二氧化碳培养箱中培养 胰蛋白酶处理后制成细胞悬液 继代培养 图S3-1动物细胞培养过程示意图 (1)贴壁培养。贴壁培养(monolayer culture)主要适用于贴壁依赖性细胞。大多数动 物细胞在离体培养条件下都需要附着在带有适量正电荷的固体或半固体的表面上才能正常 生长，并最终在附着表面扩展成单层。其基本操作过程是：先将采集到的活体动物组织在无 菌条件下采用物理（机械分散法）或化学（酶消化法）的方法分散成细胞悬液，经过滤、离 心、纯化、漂洗后接种到加有适宜培养液的培养皿（瓶、板）中，再放入二氧化碳培养箱进 行培养。用此法培养的细胞生长良好且易于观察，适于实验室研究。但贴壁生长的细胞有接 触抑制的特性，一旦细胞形成单层，生长就会受到抑制，细胞产量有限。如要继续培养，还 需将己形成单层的细胞再分散，稀释后重新接种，然后进行传代培养。 (2)悬浮培养。悬浮培养(suspension culture)适用于循环系统的细胞及肿瘤细胞等非 贴壁依赖性细胞，它们生长无需支撑面，细胞或细胞聚集体悬浮于液体培养基中即可良好生 长。悬浮生长的细胞其培养和传代都十分简便。培养时只需将采集到的活体动物组织经分散、 过滤、纯化、漂洗后，按一定密度接种于适宜培养液中，置于特定的培养条件下即可良好增 殖。传代时不需要再分散，只需按比例稀释后即可继续培养。此法细胞增殖快，产量高，培 养过程简单，是大规模培养动物细胞的理想模式。 (3)大规模培养法(large-.scale culture)。动物细胞大规模培养技术(large-scale culture
延伸阅读 3-4 动物细胞培养方法 动物细胞培养（animal cell culture）就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单 个细胞（使用胰蛋白酶或胶原蛋白酶）然后，放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖 （图 S3-1）。 图 S3-1 动物细胞培养过程示意图 （1）贴壁培养。贴壁培养（monolayer culture）主要适用于贴壁依赖性细胞。大多数动 物细胞在离体培养条件下都需要附着在带有适量正电荷的固体或半固体的表面上才能正常 生长，并最终在附着表面扩展成单层。其基本操作过程是：先将采集到的活体动物组织在无 菌条件下采用物理（机械分散法）或化学（酶消化法）的方法分散成细胞悬液，经过滤、离 心、纯化、漂洗后接种到加有适宜培养液的培养皿（瓶、板）中，再放入二氧化碳培养箱进 行培养。用此法培养的细胞生长良好且易于观察，适于实验室研究。但贴壁生长的细胞有接 触抑制的特性，一旦细胞形成单层，生长就会受到抑制，细胞产量有限。如要继续培养，还 需将已形成单层的细胞再分散，稀释后重新接种，然后进行传代培养。 （2）悬浮培养。悬浮培养（suspension culture）适用于循环系统的细胞及肿瘤细胞等非 贴壁依赖性细胞，它们生长无需支撑面，细胞或细胞聚集体悬浮于液体培养基中即可良好生 长。悬浮生长的细胞其培养和传代都十分简便。培养时只需将采集到的活体动物组织经分散、 过滤、纯化、漂洗后，按一定密度接种于适宜培养液中，置于特定的培养条件下即可良好增 殖。传代时不需要再分散，只需按比例稀释后即可继续培养。此法细胞增殖快，产量高，培 养过程简单，是大规模培养动物细胞的理想模式。 （3）大规模培养法（large-scale culture）。动物细胞大规模培养技术（large-scale culture