第6章 延伸阅读 延伸阅读6-1转基因抗虫棉 中国于20世纪90年代初期开始进行抗虫基因的研制，通过遗传转化的方法使得棉花获得 抗虫基因，从而获得抗虫特性。这些抗虫基因主要包括三类：来源于苏云金芽孢杆菌的杀虫 蛋白(Bacillus thuringiensis,Bt)基因、从植物中分离的昆虫蛋白酶抑制剂(proteinase inhibkor, PI)基因和植物凝集素(lectin)基因。当前，大规模生产应用的国产转基因抗虫棉主要有 单价抗虫棉和双价抗虫棉，其遗传转化的抗虫基因主要是Bt杀虫基因、GFM Cry1A杀虫 基因和豇豆胰蛋白酶抑制剂基因Cpti。 苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)是一种来源于土壤的微生物，因为其芽孢形成过程 中可产生一种杀虫结晶蛋白(insecticidal crystal protein,ICP),具有高度的杀虫活性，因 其来源于苏云金杆菌（拉丁名：Bacillus thuringiensis),故简称Bt毒蛋白。Bt毒蛋白对鳞翅 目昆虫有特异的毒性作用，它在昆虫消化道的碱性条件下，裂解成为活性多肽并造成昆虫消 化道损伤，最终使昆虫死亡，而对其他生物无害。当昆虫吞食了这些植物后，蛋白酶抑制剂 就抑制昆虫的消化酶，使其不能分解植物蛋白，从而影响昆虫对食物的消化吸收，导致食欲 不振，直至死亡。目前，获得转基因抗虫棉的方法主要是农杆菌介导法，其技术流程见图 E-6-1。 XXXX 抗虫基因 重组质粒 侵染离体棉花叶 导入农杆菌并培养含重组 片组织 带Kan的载体 质粒的农杆菌 导组织 检测 分化 转基因抗虫植株 再生植株 愈伤组织 图S6-1转基因抗虫棉获得的技术流程 首先必须从相应的有机体内分离和克隆抗虫基因，将该基因与Ti质粒(tumor inducing plasmid)进行连接，构建重组质粒并导入土壤农杆菌。然后在培养的过程，通过抗生素筛 选含重组质粒的土壤农杆菌侵染棉花叶片，诱导愈伤组织，获得转基因植株。 研制多基因共转化抗虫棉为中国进行后续抗虫基因的研制和应用研究开辟了新思路。可
第 6 章 延伸阅读 延伸阅读 6-1 转基因抗虫棉 中国于20世纪90年代初期开始进行抗虫基因的研制，通过遗传转化的方法使得棉花获得 抗虫基因，从而获得抗虫特性。这些抗虫基因主要包括三类：来源于苏云金芽孢杆菌的杀虫 蛋白（Bacillus thuringiensis，Bt）基因、从植物中分离的昆虫蛋白酶抑制剂（proteinase inhibkor， PI）基因和植物凝集素（1ectin）基因。当前，大规模生产应用的国产转基因抗虫棉主要有 单价抗虫棉和双价抗虫棉，其遗传转化的抗虫基因主要是 Bt 杀虫基因、GFM Cry1A杀虫 基因和豇豆胰蛋白酶抑制剂基因Cpti。 苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis）是一种来源于土壤的微生物，因为其芽孢形成过程 中可产生一种杀虫结晶蛋白（insecticidal crystal protein，ICP），具有高度的杀虫活性，因 其来源于苏云金杆菌（拉丁名：Bacillus thuringiensis），故简称Bt毒蛋白。Bt毒蛋白对鳞翅 目昆虫有特异的毒性作用，它在昆虫消化道的碱性条件下，裂解成为活性多肽并造成昆虫消 化道损伤，最终使昆虫死亡，而对其他生物无害。当昆虫吞食了这些植物后，蛋白酶抑制剂 就抑制昆虫的消化酶，使其不能分解植物蛋白，从而影响昆虫对食物的消化吸收，导致食欲 不振，直至死亡。目前，获得转基因抗虫棉的方法主要是农杆菌介导法，其技术流程见图 E-6-1。 抗虫基因 带Kan的载体 重组质粒 导入农杆菌并培养含重组 质粒的农杆菌 侵染离体棉花叶 片组织 诱 导 组 织 转基因抗虫植株 再生植株 愈伤组织 检测 分化 图 S6-图1 6转-b 基抗虫因植抗株虫的棉技获术得流程的技术流程 首先必须从相应的有机体内分离和克隆抗虫基因，将该基因与 Ti 质粒（tumor inducing plasmid）进行连接，构建重组质粒并导入土壤农杆菌。然后在培养的过程，通过抗生素筛 选含重组质粒的土壤农杆菌侵染棉花叶片，诱导愈伤组织，获得转基因植株。 研制多基因共转化抗虫棉为中国进行后续抗虫基因的研制和应用研究开辟了新思路。可
以通过构建多基因植物表达载体来共转化不同杀虫机制的抗虫基因，或者通过基因聚合技术 将多个抗虫基因聚合于一个转基因棉花内，筛选培育含有多个基因的转基因抗虫棉。这样， 不仅可以使受体棉花获得多种机制的抗虫性，利用基因互补加强转基因棉花的抗虫能力、延 缓害虫产生抗性，而且可以拓宽棉花抗虫谱，使其获得能够高效杀死主要害虫的广谱抗虫性。 有些植物在其进化过程中己形成了一种对付害虫的防御机能。它们能够产生蛋白酶抑制剂。 当昆虫吞食了这些植物后，蛋白酶抑制剂就抑制昆虫的消化酶，使其不能分解植物蛋白，从 而影响昆虫对食物的消化吸收，导致食欲不振，直至死亡。因此，分离这些植物的蛋白酶抑 制剂基因，用基因重组技术使其处于强启动子的控制之下，再转移到受体作物中，就能高效 表达，使作物免受虫害。植物蛋白酶抑制剂基因种类很多。现在应用较多、抗虫能力较好的 主要有马铃薯蛋白酶抑制剂基因、豇豆胰蛋白酶抑制剂基因及水稻巯基蛋白酶抑制剂基因等
以通过构建多基因植物表达载体来共转化不同杀虫机制的抗虫基因，或者通过基因聚合技术 将多个抗虫基因聚合于一个转基因棉花内，筛选培育含有多个基因的转基因抗虫棉。这样， 不仅可以使受体棉花获得多种机制的抗虫性，利用基因互补加强转基因棉花的抗虫能力、延 缓害虫产生抗性，而且可以拓宽棉花抗虫谱，使其获得能够高效杀死主要害虫的广谱抗虫性。 有些植物在其进化过程中已形成了一种对付害虫的防御机能。它们能够产生蛋白酶抑制剂。 当昆虫吞食了这些植物后，蛋白酶抑制剂就抑制昆虫的消化酶，使其不能分解植物蛋白，从 而影响昆虫对食物的消化吸收，导致食欲不振，直至死亡。因此，分离这些植物的蛋白酶抑 制剂基因，用基因重组技术使其处于强启动子的控制之下，再转移到受体作物中，就能高效 表达，使作物免受虫害。植物蛋白酶抑制剂基因种类很多。现在应用较多、抗虫能力较好的 主要有马铃薯蛋白酶抑制剂基因、豇豆胰蛋白酶抑制剂基因及水稻巯基蛋白酶抑制剂基因等
延伸阅读6-2抗除草剂基因工程 除草剂通过干扰植物重要的代谢过程如光合作用、氨基酸或蛋白质的合成、呼吸过程等 来损害或杀死植物。然而，除草剂在杀死杂草的同时也对作物产生不同程度的损害作用。因 此，培育抗除草剂的作物新品种对于扩大除草剂的应用以及农业操作具有重要的意义。 人们对制作抗除草剂的转基因作物的生物学操作有很多设想，如：抑制植物对除草剂的 吸收：降低对除草剂敏感的靶蛋白与除草剂的亲和力：赋予植物再新陈代谢过程种使除草剂 失活的能力。这些策略的指导下，已经培育出了各种抗除草剂的转基因作物。 草甘膦(glyphosate)是一种广谱除草剂，它具有无毒、易分解、无残留和不污染环境 等特点，因而得到广泛的使用。它的靶位是植物叶绿体中的一个重要酶一内丙酮莽草酸磷酸 合成酶(5-enolpyruvyl-shikimate-3-phosphate synthetase,.EPSP)。目前，已经从鼠伤寒沙门 菌中分离出一个突变体，它含有抗除草剂的EPSP合成酶突变基因。把抗草甘膦基因引入植 物，可使这种基因工程作物获得抗草甘膦的能力。此时若用草甘膦除草，则可选择性地除掉 杂草，作物因不受损害而继续生长。美国科学家己成功地将这种突变的抗草甘膦的EPSP基 因引入大豆、烟草中，转化植株获得了抗草甘膦的能力。 玉米片 豆浆 饼干 动物饲料 转基因 aby 婴儿食品 食用油 图S6-2转基因抗除草剂植株 膦丝菌素(phosphinothricin,PPT)是非选择性的除草剂，也是植物谷氨酰胺合成酶 (glutamine synthetase,GS)的抑制剂。GS在氨的同化作用和氨代谢过程中起关键的作用， 而且也是唯一的一种氨解毒酶(detoxifying enzyme).现已从链霉菌(Streptomyces hyrscopicu) 中分离到抗bialaphos(含有PPT的三肽)的bar基因，该基因编码膦丝菌素乙酰转移酶 (phosphinothricin acetyltransferase,PAT)。嵌合的bar基因在CaMV35s启动子的控制下，在
延伸阅读 6-2 抗除草剂基因工程 除草剂通过干扰植物重要的代谢过程如光合作用、氨基酸或蛋白质的合成、呼吸过程等 来损害或杀死植物。然而，除草剂在杀死杂草的同时也对作物产生不同程度的损害作用。因 此，培育抗除草剂的作物新品种对于扩大除草剂的应用以及农业操作具有重要的意义。 人们对制作抗除草剂的转基因作物的生物学操作有很多设想，如：抑制植物对除草剂的 吸收；降低对除草剂敏感的靶蛋白与除草剂的亲和力；赋予植物再新陈代谢过程种使除草剂 失活的能力。这些策略的指导下，已经培育出了各种抗除草剂的转基因作物。 草甘膦（glyphosate）是一种广谱除草剂，它具有无毒、易分解、无残留和不污染环境 等特点，因而得到广泛的使用。它的靶位是植物叶绿体中的一个重要酶—内丙酮莽草酸磷酸 合成酶（5-enolpyruvyl-shikimate-3-phosphate synthetase，EPSP）。目前，已经从鼠伤寒沙门 菌中分离出一个突变体，它含有抗除草剂的EPSP合成酶突变基因。把抗草甘膦基因引入植 物，可使这种基因工程作物获得抗草甘膦的能力。此时若用草甘膦除草，则可选择性地除掉 杂草，作物因不受损害而继续生长。美国科学家已成功地将这种突变的抗草甘膦的EPSP基 因引入大豆、烟草中，转化植株获得了抗草甘膦的能力。 图 S6-2 转基因抗除草剂植株 膦丝菌素（phosphinothricin，PPT）是非选择性的除草剂，也是植物谷氨酰胺合成酶 （glutamine synthetase，GS）的抑制剂。GS在氨的同化作用和氨代谢过程中起关键的作用， 而且也是唯一的一种氨解毒酶（detoxifying enzyme）。现已从链霉菌（Streptomyces hyrscopicu） 中分离到抗bialaphos（含有PPT的三肽）的bar基因，该基因编码膦丝菌素乙酰转移酶 ( phosphinothricin acetyltransferase，PAT )。嵌合的bar基因在CaMV35s启动子的控制下，在
烟草、马铃薯和番茄的细胞内得到表达，转基因植株对高剂量的PPT或bialaphos具有耐 受性。这是因为PAT通过对PPT或bialaphos进行乙酰化而使其失去制剂GS活性的作用， 并最终使转基因植株对除草剂PPT产生抗性。 从20世纪80年代初期开始研究转基因抗除草剂作物，第一个被农民接受并于1995年种 植的是抚溴苯腈棉花，1996~1998年转基因抗草甘膦大豆、棉花与玉米以及转基因抗草铵膦 油菜、玉米与棉花大面积种植，从而开创了抗除草剂作物发展的新局面。1996年至2003 年，全球耐除草剂的转基因植物种植面积一直名列首位，并保持着持续增长的态势。2003 年，耐除草剂的大豆、玉米、欧洲油菜和棉花达到4970万公顷，占全球转基因作物种植面 积的49.7%。其中，耐除草剂大豆的种植面积为4140万公顷，占全球大豆总种植面积的61%。 为了更好地解决杂草抗性问题，多抗性作物的创制是必要的，对除草剂具有多抗性作物 的创制可以通过传统育种或分子技术进行基因堆积来实现，多抗性育种是在含不同基因的两 种作物品系间进行杂交，然后选择同时含有两种抗性基因的品系。基因堆积可以结合转基因 或转基因与非转基因交互作用而实现，如抗草甘膦与抗磺酰脲大豆(sulfonylurea tolerant soybeans,.SsTS)。分子积累是结合在同一遗传成分中的不同除草剂抗性基因来选择多抗性。 随着对不同类型除草剂作用机制的深入了解、新除草剂抗性基因的发现及通过蛋白质工 程的改良和转化技术的发展，抗除草剂作物的开发己经成为作物基因工程研究最活跃的领域 之一
烟草、马铃薯和番茄的细胞内得到表达，转基因植株对高剂量的 PPT 或 bialaphos 具有耐 受性。这是因为 PAT 通过对 PPT 或 bialaphos 进行乙酰化而使其失去制剂GS活性的作用， 并最终使转基因植株对除草剂PPT产生抗性。 从20世纪80年代初期开始研究转基因抗除草剂作物，第一个被农民接受并于 1995 年种 植的是抚溴苯腈棉花，1996～1998年转基因抗草甘膦大豆、棉花与玉米以及转基因抗草铵膦 油菜、玉米与棉花大面积种植，从而开创了抗除草剂作物发展的新局面。1996 年至 2003 年，全球耐除草剂的转基因植物种植面积一直名列首位，并保持着持续增长的态势。2003 年，耐除草剂的大豆、玉米、欧洲油菜和棉花达到 4 970万公顷，占全球转基因作物种植面 积的49.7%。其中，耐除草剂大豆的种植面积为4 140万公顷，占全球大豆总种植面积的61%。 为了更好地解决杂草抗性问题，多抗性作物的创制是必要的，对除草剂具有多抗性作物 的创制可以通过传统育种或分子技术进行基因堆积来实现，多抗性育种是在含不同基因的两 种作物品系间进行杂交，然后选择同时含有两种抗性基因的品系。基因堆积可以结合转基因 或转基因与非转基因交互作用而实现，如抗草甘膦与抗磺酰脲大豆（sulfonylurea tolerant soybeans, STS）。分子积累是结合在同一遗传成分中的不同除草剂抗性基因来选择多抗性。 随着对不同类型除草剂作用机制的深入了解、新除草剂抗性基因的发现及通过蛋白质工 程的改良和转化技术的发展，抗除草剂作物的开发已经成为作物基因工程研究最活跃的领域 之一
延伸阅读6-3“黄金水稻” 一、黄金水稻的概念 水稻是最重要的粮食作物，是人类主要的食物来源之一，世界上三分之一人类以水稻为 主食。因为稻米的维生素A原(B-胡萝卜素)只存在于糊粉层中，但糊粉层在稻米加工过 程中被剥除。因此，在以稻米为主食的地区，维生素A缺乏已成为亟待解决的营养问题。 维生素A缺乏将影响儿童视力发育，导致视力下降、失明和免疫水平的低下。科学家们不 断地探索努力，企图以低成本、便捷的方式克服不同程度的维生素A缺乏症。黄金水稻就 此诞生。 黄金水稻(golden rice)其实就是黄金大米，又名“金色大米”，是一种转基因大米，由 美国先正达公司研发。其不同于普通大米的主要功能是含有胡萝卜素，胡萝卜素在人体内会 转化为维生素A,从而可以通过食用黄金大米来预防维生素A缺乏症。因为这种大米含有 胡萝卜素，外观为金黄色，就被形象地称为“黄金大米”。（图S6-3)。 Wild type Golden Rice 1 Golden Rice 2 图S6-3野生型(wild type)、第1代黄金稻(Golden Rice 1)、第2代黄金稻(Golden Rice2) 二、黄金水稻的发展 由世界银行资助的国际水稻研究所(International Rice Research Institute,IRRI)是目 前国际上黄金大米的主要研发单位。Golden Rice1在2000年问世，瑞士育种专家Ingo Potrykus和德国分子生物学家Peter Beyer使用了来自黄水仙的基因，其中胡萝卜素含量约为 l.6ugg.Golden Rice2于2005年问世，研究人员使用玉米中的对应基因而培育出来，Golden Rice2中胡萝卜素的含量是Golden Rice1的23倍，达到37ugg 从1992年提出引进生产线的想法到2000年完全引入成功，足足花了八年的时间。水稻 中的胡萝卜素的含量从零提升到了一点多毫克每千克，“黄金水稻”一代由此诞生了。go Potrykus的头像在闪亮的绿色稻秆的衬托下，以英雄的姿态登上了美国《时代》杂志的封面 上，旁注写道“This rice could save a million kids a year(这种水稻每年能拯救上百万的儿
延伸阅读 6-3 “黄金水稻” 一、黄金水稻的概念 水稻是最重要的粮食作物，是人类主要的食物来源之一，世界上三分之一人类以水稻为 主食。因为稻米的维生素 A 原（β-胡萝卜素）只存在于糊粉层中，但糊粉层在稻米加工过 程中被剥除。因此，在以稻米为主食的地区，维生素 A 缺乏已成为亟待解决的营养问题。 维生素 A 缺乏将影响儿童视力发育，导致视力下降、失明和免疫水平的低下。科学家们不 断地探索努力，企图以低成本、便捷的方式克服不同程度的维生素 A 缺乏症。黄金水稻就 此诞生。 黄金水稻（golden rice）其实就是黄金大米，又名“金色大米”，是一种转基因大米，由 美国先正达公司研发。其不同于普通大米的主要功能是含有胡萝卜素，胡萝卜素在人体内会 转化为维生素 A，从而可以通过食用黄金大米来预防维生素 A 缺乏症。因为这种大米含有 胡萝卜素，外观为金黄色，就被形象地称为“黄金大米”。（图 S6-3）。 图 S6-3 野生型（wild type）、第 1 代黄金稻（Golden Rice 1）、第 2 代黄金稻（Golden Rice 2） 二、黄金水稻的发展 由世界银行资助的国际水稻研究所（International Rice Research Institute，IRRI ）是目 前国际上黄金大米的主要研发单位。Golden Rice 1 在 2000 年问世，瑞士育种专家 Ingo Potrykus 和德国分子生物学家 Peter Beyer 使用了来自黄水仙的基因，其中胡萝卜素含量约为 1.6 µg/g。Golden Rice 2 于 2005 年问世，研究人员使用玉米中的对应基因而培育出来，Golden Rice 2 中胡萝卜素的含量是 Golden Rice 1 的 23 倍，达到 37µg/g。 从 1992 年提出引进生产线的想法到 2000 年完全引入成功，足足花了八年的时间。水稻 中的胡萝卜素的含量从零提升到了一点多毫克每千克，“黄金水稻”一代由此诞生了。Ingo Potrykus 的头像在闪亮的绿色稻秆的衬托下，以英雄的姿态登上了美国《时代》杂志的封面 上，旁注写道 “This rice could save a million kids a year ( 这种水稻每年能拯救上百万的儿
童)”。 三、黄金水稻产生的原理 胡萝卜素是合成维生素A的材料，人体只能通过吸收胡萝卜素来合成维生素A,在普 通大米里面维生素A或者胡萝卜素的含量为零，通过自然杂交的途径无法让大米富含含维 生素。因为杂交需要一个母本里面拥有我们需要的性状，然而到现在农业学家们都没有找到 任何一种含有维生素A或者胡萝卜素的水稻可以作为育种母本。 1984年，菲律宾的国际农业会议，在洛克菲勒基因会的农业主管盖利托尼森的主导下 开始了“黄金水稻”的开拓型研究。科学家们开展了把整个胡萝卜素生产线从别的物种中引入 到水稻的研究工作。水稻胚乳细胞含有合成邱胡萝卜素的最初前体，但缺少将该前体转化为 维生素A原的酶系，因此采用了转基因的方法，主要是通过转基因技术将胡萝卜素转化酶 系统转入到大米胚乳中并表达，在水稻中重建B胡萝卜素生物合成途径。 首先，研究人员从黄水仙daffodils的花朵中获取了八氢番茄红素合成酶和番茄红素-a-B- 环化酶，这些元素具有调控花朵颜色的作用，（其中的两个酶：八氢番茄红素脱氢酶和截塔 胡萝卜素脱氢酶，可以被一个“全能技术工人”细菌胡萝卜素脱氢酶所代替)：其次，又从 土壤细菌欧文氏菌(Erwinia salicis8)中获得了细菌胡萝卜素脱氢酶，主要用于将八氢番茄红 素转化为番茄红素，通过农杆菌介导遗传转化方法，这样就产生了第一代黄金大米（图$6-4）。 八氢番茄红 素合成酶 农杆菌 黄水仙 番茄红素 -阝-环化酶 质粒 十 欧文氏甜 胡罗卜素脱氢酶 图S6-4黄金水稻实验流程 按照一代“黄金水稻”中胡萝卜素的含量，满足一个婴儿每天对维生素A的需求则要吃3 kg大米：含量太低让人怀疑它将来在农业生产上的作为。之后，研究人员发现黄水仙的八 氢番茄红素合成酶不利于胡萝卜素的生成，Rachel Drake和同事利用系统筛选法，对可选择 的八氢番茄红素合酶品种进行了试验。采用了来自玉米的八氢番茄红素合成酶，培育出了二 代黄金水稻。拥有重新打造的“胡萝卜素生产线”的“黄金水稻”二代登场，胡萝卜素的含量较
童 )”。 三、黄金水稻产生的原理 胡萝卜素是合成维生素 A 的材料，人体只能通过吸收胡萝卜素来合成维生素 A，在普 通大米里面维生素 A 或者胡萝卜素的含量为零，通过自然杂交的途径无法让大米富含含维 生素。因为杂交需要一个母本里面拥有我们需要的性状，然而到现在农业学家们都没有找到 任何一种含有维生素 A 或者胡萝卜素的水稻可以作为育种母本。 1984 年，菲律宾的国际农业会议，在洛克菲勒基因会的农业主管盖利托尼森的主导下 开始了“黄金水稻”的开拓型研究。科学家们开展了把整个胡萝卜素生产线从别的物种中引入 到水稻的研究工作。水稻胚乳细胞含有合成β-胡萝卜素的最初前体，但缺少将该前体转化为 维生素 A 原的酶系，因此采用了转基因的方法，主要是通过转基因技术将胡萝卜素转化酶 系统转入到大米胚乳中并表达，在水稻中重建β-胡萝卜素生物合成途径。 首先，研究人员从黄水仙 daffodils 的花朵中获取了八氢番茄红素合成酶和番茄红素-α-β- 环化酶，这些元素具有调控花朵颜色的作用，（其中的两个酶：八氢番茄红素脱氢酶和截塔 胡萝卜素脱氢酶，可以被一个“全能技术工人”细菌胡萝卜素脱氢酶所代替）；其次，又从 土壤细菌欧文氏菌（Erwinia salicis）中获得了细菌胡萝卜素脱氢酶，主要用于将八氢番茄红 素转化为番茄红素，通过农杆菌介导遗传转化方法，这样就产生了第一代黄金大米（图 S6-4）。 图 S6-4 黄金水稻实验流程 按照一代“黄金水稻”中胡萝卜素的含量，满足一个婴儿每天对维生素 A 的需求则要吃 3 kg 大米；含量太低让人怀疑它将来在农业生产上的作为。之后，研究人员发现黄水仙的八 氢番茄红素合成酶不利于胡萝卜素的生成，Rachel Drake 和同事利用系统筛选法，对可选择 的八氢番茄红素合酶品种进行了试验。采用了来自玉米的八氢番茄红素合成酶，培育出了二 代黄金水稻。拥有重新打造的“胡萝卜素生产线”的“黄金水稻”二代登场，胡萝卜素的含量较
一代提升了23倍，最高达到每千克大米含37毫克胡萝卜素，这是一个有使用价值的重大突 破，小孩子每天吃70多克黄金大米就能满足每天一半的对维生素A的需要量了
一代提升了 23 倍，最高达到每千克大米含 37 毫克胡萝卜素，这是一个有使用价值的重大突 破，小孩子每天吃 70 多克黄金大米就能满足每天一半的对维生素 A 的需要量了
延伸阅读6-4抗干旱、盐碱胁迫 干旱和盐碱是农作物生产的主要危害，是影响植物生长发育及作物减产的非生物胁迫 因素。中国是世界上干旱和半干旱面积很大的国家，我国盐碱地面积约占全国耕地面积的 20%。所以，利用生物技术培育抗旱耐盐碱植物，提高植物对自然干旱和恶劣环境的适应能 力，对我国的农业生产和生态建设具有重要的意义。 一、植物抗旱、耐盐碱机理 植物在干旱胁迫或者盐胁迫的环境中不断进化，形成了渗透调节的生理机制。渗透调 节可以增加细胞溶质浓度，降低胞内水势，使细胞保持膨压，缓解由于脱水胁迫造成的伤害， 提高植物的抗性。植物会合成有机的亲和渗透调节物质来平衡细胞内外的渗透势，维持细胞 中酶分子的构象和细胞内大分子物质的稳定。细胞中合成的小分子物质主要有：低分子糖类 (如果聚糖、海藻糖等)、氨基酸及其衍生物（如脯氨酸、甜菜碱等）、多元醇（如甘露醇、山梨 醇等)。 1.脯氨酸(Proline,Pro) 脯氨酸作为植物中主要的渗透调节物质之一，体内脯氨酸的积累与植物耐旱、耐盐存 在很大的相关性。在植物受到干旱或盐分胁迫时，它不仅可以延缓植物缺水的加剧，还可以 调节氧化还原状态或者清除活性氧，并可以调节细胞质pH以防止细胞质酸化，对细胞膜的 完整性有保护作用。大量试验证明，脯氨酸的含量与胁迫程度呈正相关，即随着胁迫程度的 增加，脯氨酸的含量也增加。脯氨酸的合成途径主要有2条，鸟氨酸途径和谷氨酸途径；将 脯氨酸合成途径基因Y-吡咯啉-5-羧酸酯合成酶(y-Pyrroline-5-carboxylate synthetase,P5CS) 基因转入烟草中表达，其体内脯氨酸含量增加10~18倍以上。 2.甜菜碱(Betaine) 当植物受到干旱胁迫或者盐分胁迫时，大部分植物会合成并积累甜菜碱。甜菜碱是以 甘氨酸或丝氨酸作为前体，合成胆碱后经过脱氢产生甜菜碱。作为细胞质渗透剂，甜菜碱可 以降低细胞内的渗透势避免细胞脱水，还可以调节离子(Na+、K+、C1-)的吸收和分布、 保护细胞内蛋白质的结构和酶的活性，从而起到降低质膜的透性和减少胁迫对细胞膜的伤害。 李秀英等将合成甜菜碱关键酶醛脱氢酶(betaine aldehyde dehydrogenase,.BADH)基因转入 到大豆中，获得了抗旱性和耐盐性明显提高的转基因大豆。 3.多元醇(Polyhydric alcohols) 多元醇是普遍存在植物体内小分子有机质，含有多个羟基，亲水能力强，能有效维持 细胞膨压，进而有效地抵抗高盐和干旱胁迫下的渗透脱水。多元醇包括甘露醇、山梨醇和肌
延伸阅读 6-4 抗干旱、盐碱胁迫 干旱和盐碱是农作物生产的主要危害，是影响植物生长发育及作物减产的非生物胁迫 因素。中国是世界上干旱和半干旱面积很大的国家，我国盐碱地面积约占全国耕地面积的 20%。所以，利用生物技术培育抗旱耐盐碱植物，提高植物对自然干旱和恶劣环境的适应能 力，对我国的农业生产和生态建设具有重要的意义。 一、植物抗旱、耐盐碱机理 植物在干旱胁迫或者盐胁迫的环境中不断进化，形成了渗透调节的生理机制。渗透调 节可以增加细胞溶质浓度，降低胞内水势，使细胞保持膨压，缓解由于脱水胁迫造成的伤害， 提高植物的抗性。植物会合成有机的亲和渗透调节物质来平衡细胞内外的渗透势，维持细胞 中酶分子的构象和细胞内大分子物质的稳定。细胞中合成的小分子物质主要有:低分子糖类 (如果聚糖、海藻糖等)、氨基酸及其衍生物(如脯氨酸、甜菜碱等)、多元醇(如甘露醇、山梨 醇等)。 1. 脯氨酸（Proline，Pro） 脯氨酸作为植物中主要的渗透调节物质之一，体内脯氨酸的积累与植物耐旱、耐盐存 在很大的相关性。在植物受到干旱或盐分胁迫时，它不仅可以延缓植物缺水的加剧，还可以 调节氧化还原状态或者清除活性氧，并可以调节细胞质pH以防止细胞质酸化，对细胞膜的 完整性有保护作用。大量试验证明，脯氨酸的含量与胁迫程度呈正相关，即随着胁迫程度的 增加，脯氨酸的含量也增加。脯氨酸的合成途径主要有 2 条，鸟氨酸途径和谷氨酸途径; 将 脯氨酸合成途径基因 γ-吡咯啉-5-羧酸酯合成酶（γ-Pyrroline-5-carboxylate synthetase，P5CS） 基因转入烟草中表达，其体内脯氨酸含量增加10～18倍以上。 2. 甜菜碱（(Betaine） 当植物受到干旱胁迫或者盐分胁迫时，大部分植物会合成并积累甜菜碱。甜菜碱是以 甘氨酸或丝氨酸作为前体，合成胆碱后经过脱氢产生甜菜碱。作为细胞质渗透剂，甜菜碱可 以降低细胞内的渗透势避免细胞脱水，还可以调节离子 ( Na+、K+、Cl- ) 的吸收和分布、 保护细胞内蛋白质的结构和酶的活性，从而起到降低质膜的透性和减少胁迫对细胞膜的伤害。 李秀英等将合成甜菜碱关键酶醛脱氢酶 ( betaine aldehyde dehydrogenase，BADH ) 基因转入 到大豆中，获得了抗旱性和耐盐性明显提高的转基因大豆。 3. 多元醇 （Polyhydric alcohols） 多元醇是普遍存在植物体内小分子有机质，含有多个羟基，亲水能力强，能有效维持 细胞膨压，进而有效地抵抗高盐和干旱胁迫下的渗透脱水。多元醇包括甘露醇、山梨醇和肌
醇等。其中研究较多的是甘露醇-l-磷酸脱氢酶(mannitol-l-phosphate dehydrogenase,mtlD) 基因和6-磷酸山梨醇脱氢酶基因(glucitol-6-phosphate dehydrogenase,gutD)。将从大肠杆菌 中克隆的mtlD基因转入毛白杨中，转基因毛白杨芽可以在50 mmoL NaCl条件下生根， 而对照组不能正常生根，同时转基因毛白杨可以在75 mmoL NaC!条件下存活，而对照组 只能在25 mmoL NaCl条件下存活，结果证实转基因毛白杨表现出高耐盐性。 二、抗旱、耐盐碱基因工程研究进展 己开展的抗旱、耐盐碱基因工程研究主要包括两大类：一类是克隆了一批使细胞积累相 容性物质的基因，这种相容性物质主要包括氨基酸类（如脯氨酸等）、季铵类化合物（如甜 菜碱和胆碱等)、和糖醇类化合物（如甘露醇、山梨醇和海藻糖）等。另一类是在环境胁迫 的条件下，基因之间通过信号传导作用，启动某些相关基因的表达，从而达到抵抗逆境、保 护细胞正常活动的目的。 1.抗盐、耐旱调渗物质合成基因的克隆 (I)Imtl基因。肌醇甲基转移酶基因(inositol O-methyltransferase,Imt基因是从生 长于南非沙漠中的冰叶午时花(Mesembryanthemum crystallium)中分离得到的，该基因在 盐碱或干旱胁迫下能生成芒柄醇(D-ononitol)。目前己构建了含有Imtl基因的植物表达载 体，并将它转化烟草，获得了可耐1.2%~1.5%氯化钠的转基因烟草植株。 (2)mtD基因和gutD基因。1-磷酸甘露醇脱氢酶基因(mtD)和6-磷酸山梨醇脱氢 酶基因(gutD)都是从大肠杆菌(Escherichia coli)中克隆的分别编码甘露醇(mannitol)和 山梨醇(sorbitol)合成的关键基因。目前己将mtlD基因和gutD基因在烟草、水稻、玉米 和八里庄杨等植物中进行了遗传转化。其中转tD基因的烟草可产生甘露醇，耐盐性可 达1.46%，转基因木本植物八里庄杨的耐盐性达0.6%氯化钠；转gutD基因的玉米耐盐性可 达1.17%。 (3)P5CS基因。目前己从细菌、酵母、水稻、黑麦、大豆、拟南芥、苜蓿等中克隆出 了多个脯氨酸合成酶或与之相关的基因，即脯氨酸合成酶基因族。P5CS基因是一个双功能 基因，编码Y-谷氨酰激酶(Y-glutamyl kinase,y-GK)和谷氨酸-5-半醛脱氢酶(glutamyl 5-phosphate reductase,G5PR)两种酶。将该基因转化到烟草中，可使转基因烟草中脯氨酸 的合成量比对照提高8~10倍。 (4)BADH基因。甜菜碱的生物合成有两步酶促反应，即胆碱单氧化酶 (CholineMonooxygenase,CMO)和NAD+的甜菜碱醛脱氢酶(betaine aldehyde dehydrogenase,BADH)。目前BADH基因己在草莓、烟草、水稻、小麦、豆瓣菜等植物和
醇等。其中研究较多的是甘露醇-1-磷酸脱氢酶（mannitol-1-phosphate dehydrogenase，mtlD ） 基因和 6-磷酸山梨醇脱氢酶基因 (glucitol-6-phosphate dehydrogenase，gutD)。将从大肠杆菌 中克隆的 mtlD 基因转入毛白杨中，转基因毛白杨芽可以在 50 mmoL NaCl 条件下生根， 而对照组不能正常生根，同时转基因毛白杨可以在 75 mmoL NaCl 条件下存活，而对照组 只能在 25 mmoL NaCl 条件下存活，结果证实转基因毛白杨表现出高耐盐性。 二、抗旱、耐盐碱基因工程研究进展 已开展的抗旱、耐盐碱基因工程研究主要包括两大类：一类是克隆了一批使细胞积累相 容性物质的基因，这种相容性物质主要包括氨基酸类（如脯氨酸等）、季铵类化合物（如甜 菜碱和胆碱等）、和糖醇类化合物（如甘露醇、山梨醇和海藻糖）等。另一类是在环境胁迫 的条件下，基因之间通过信号传导作用，启动某些相关基因的表达，从而达到抵抗逆境、保 护细胞正常活动的目的。 1. 抗盐、耐旱调渗物质合成基因的克隆 （1）Imtl 基因。肌醇甲基转移酶基因 ( inositol O-methyltransferase，Imtl) 基因是从生 长于南非沙漠中的冰叶午时花 ( Mesembryanthemum crystallium ) 中分离得到的，该基因在 盐碱或干旱胁迫下能生成芒柄醇 ( D-ononitol ) 。目前已构建了含有 Imtl 基因的植物表达载 体，并将它转化烟草，获得了可耐 1.2 %～1.5 %氯化钠的转基因烟草植株。 （2）mtlD 基因和 gutD 基因。1-磷酸甘露醇脱氢酶基因（mtlD）和 6-磷酸山梨醇脱氢 酶基因（gutD）都是从大肠杆菌 ( Escherichia coli ) 中克隆的分别编码甘露醇 ( mannitol ) 和 山梨醇 ( sorbitol ) 合成的关键基因。目前已将 mtlD 基因和 gutD 基因在烟草、水稻、玉米 和八里庄杨等植物中进行了遗传转化。其中转 mtlD 基因的烟草可产生甘露醇，耐盐性可 达 1.46%，转基因木本植物八里庄杨的耐盐性达 0.6%氯化钠; 转 gutD 基因的玉米耐盐性可 达 1.17%。 （3）P5CS 基因。目前已从细菌、酵母、水稻、黑麦、大豆、拟南芥、苜蓿等中克隆出 了多个脯氨酸合成酶或与之相关的基因，即脯氨酸合成酶基因族。P5CS 基因是一个双功能 基因，编码 γ-谷氨酰激酶 ( γ-glutamyl kinase，γ-GK ) 和谷氨酸-5-半醛脱氢酶 ( glutamyl 5-phosphate reductase，G5PR ) 两种酶。将该基因转化到烟草中，可使转基因烟草中脯氨酸 的合成量比对照提高 8~10 倍。 （ 4 ） BADH 基 因 。 甜 菜 碱 的 生 物 合 成 有 两 步 酶 促 反 应 ， 即 胆 碱 单 氧 化 酶 ( CholineMonooxygenase ， CMO) 和 NAD + 的 甜 菜 碱 醛 脱 氢 酶 (betaine aldehyde dehydrogenase，BADH )。目前 BADH 基因已在草莓、烟草、水稻、小麦、豆瓣菜等植物和
农作物中进行了转化，并获得了耐盐性得到不同程度提高的转基因工程植株。 2.植物抗盐和耐旱信号传导和表达调控的研究 耐盐耐旱的植物在干旱、高盐会诱导各种反应来适应或抵抗这些不利的环境胁迫，从 而引发一系列分子反应和信号传递，使某些基因得以表达，达到维持植物细胞水分平衡的目 的。这类基因编码的产物包括信号传递和调控基因表达的转录因子、感应和传导胁迫信号的 蛋白激酶以及在信号传导中起重要作用的蛋白酶等。研究这类基因的表达特性及基因产物的 调控作用，已成为近年来植物分子生物学研究领域的一个前沿内容。 (1)信号传递和调控基因表达的转录因子。为了探讨干旱、高盐胁迫信号在植物细胞中 传递和应答基因表达调控的分子机理，研究人员从低温、干旱处理的拟南芥中证实了DREB (dehydration responsive element binding protein)转录因子与DRE顺式作用元件结合的特 异性。一个DREB转录因子可以调控多个与植物干旱、高盐及低温耐性有关的功能基因的 表达，在提高植物对环境胁迫抗性的分子育种中，改良或增强一个关键的转录因子，通过它 促使多个功能基因发挥作用，获得综合改良效果，也许是提高植物抗逆性更为有效的方法和 途径。利用转录因子培育的转基因拟南芥植株，干旱、耐高盐性都比野生型植株增强。近年 来，己相继分离出大量的不同类型的转录因子，如bZP转录因子，MYB转录因子及DREB 转录因子等。 (2)感应和传导胁迫信号的蛋白激酶。植物在感受干旱、高盐引起的渗透胁迫后，在 蛋白激酶的作用下，这些胁迫信号经过一系列传递过程，最后诱导特定功能基因的表达，在 生理生化上做出调节反应。至今己研究的与植物干旱、高盐分子应答有关的植物蛋白激酶基 因主要有：促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAP激酶或MAPK)基 因，与植物对干旱、高盐、低温、激素（乙烯、脱落酸、赤霉素、生长素）、创伤、病原反应 以及细胞周期调节等多种反应的信号传递有关：受体蛋白激酶(receptor protein kinase,RPK) 基因，主要与感受发育和环境胁迫信号有关：转录调控蛋白激酶基因，主要参与生物生长、 细胞周期、染色体正常结构维持、氨基酸合成等多种生命活动相关基因的表达，同时还影响 一系列转录因子的活性：核糖体蛋白激酶基因，主要通过增加某些特定蛋白的合成使植物对 外界胁迫做出反应
农作物中进行了转化，并获得了耐盐性得到不同程度提高的转基因工程植株。 2. 植物抗盐和耐旱信号传导和表达调控的研究 耐盐耐旱的植物在干旱、高盐会诱导各种反应来适应或抵抗这些不利的环境胁迫，从 而引发一系列分子反应和信号传递，使某些基因得以表达，达到维持植物细胞水分平衡的目 的。这类基因编码的产物包括信号传递和调控基因表达的转录因子、感应和传导胁迫信号的 蛋白激酶以及在信号传导中起重要作用的蛋白酶等。研究这类基因的表达特性及基因产物的 调控作用，已成为近年来植物分子生物学研究领域的一个前沿内容。 （1）信号传递和调控基因表达的转录因子。为了探讨干旱、高盐胁迫信号在植物细胞中 传递和应答基因表达调控的分子机理，研究人员从低温、干旱处理的拟南芥中证实了 DREB （dehydration responsive element binding protein ）转录因子与 DRE 顺式作用元件结合的特 异性。一个 DREB 转录因子可以调控多个与植物干旱、高盐及低温耐性有关的功能基 因的 表达，在提高植物对环境胁迫抗性的分子育种中，改良或增强一个关键的转录因子，通过它 促使多个功能基因发挥作用，获得综合改良效果，也许是提高植物抗逆性更为有效的方法和 途径。利用转录因子培育的转基因拟南芥植株，干旱、耐高盐性都比野生型植株增强。近年 来，已相继分离出大量的不同类型的转录因子，如 bZIP 转录因子，MYB 转录因子及 DREB 转录因子等。 （2）感应和传导胁迫信号的蛋白激酶。植物在感受干旱、高盐引起的渗透胁迫后，在 蛋白激酶的作用下，这些胁迫信号经过一系列传递过程，最后诱导特定功能基因的表达，在 生理生化上做出调节反应。至今已研究的与植物干旱、高盐分子应答有关的植物蛋白激酶基 因主要有：促分裂原活化蛋白激酶 (mitogen-activated protein kinases，MAP 激酶或 MAPK) 基 因，与植物对干旱、高盐、低温、激素(乙烯、脱落酸、赤霉素、生长素)、创伤、病原反应 以及细胞周期调节等多种反应的信号传递有关；受体蛋白激酶 (receptor protein kinase，RPK ) 基因，主要与感受发育和环境胁迫信号有关;转录调控蛋白激酶基因，主要参与生物生长、 细胞周期、染色体正常结构维持、氨基酸合成等多种生命活动相关基因的表达，同时还影响 一系列转录因子的活性;核糖体蛋白激酶基因，主要通过增加某些特定蛋白的合成使植物对 外界胁迫做出反应