生物技术概论 第2章基因工程 习题与参考答案 一、名词解释 1.基因：基因（遗传因子）是产生一条多肽链或功能RNA所需的全部核苷酸序列（基 因是具有一定遗传效应的DNA片段)。 2.跳跃基因：跳跃基因是指能够改变自身位置的一段DNA序列，也叫“转座元”，可 在染色体内或不同染色体间移动，其本身可编码转座酶(transposase),也含有非蛋白编码 序列。 3.假基因：假基因是一类看似正常却不能表达任何RNA或蛋白质的基因。 4.基因工程：基因工程是指将一种或多种生物体（供体）的基因或基因组提取出来， 或者人工合成的基因，按照人们的愿望，进行严密的设计，经过体外加工重组，通过一定的 方法，转移到另一种生物体（受体）的细胞内，使之能在受体细胞遗传并获得新的遗传性状 的技术。 5.粘性末端：粘性末端是识别位点为回文对称结构的序列经限制性内切酶切割后产生 的末端，这样形成的两个末端是相同的，也是互补的。 6.星号活性：星号活性是指在极端非标准条件下，限制性内切酶能切割和识别相似序 列的现象。 7.质粒载体：质粒载体是在基因工程中，人工构建的质粒并用于运载基因的载体。 8.柯斯质粒载体：柯斯质粒载体是人工建造的含有λDNA的cOs序列和质粒复制子的特 殊类型的质粒载体。 9.mRNA差异显示：mRNA差异显示是先用PCR技术扩增所有的mRNA、生成cDNA 群体，再用测序凝胶电泳获取所需要的目的基因，然后再用PC℉扩增获得目的基因的方法。 简单讲，就是从基因的转录产物mRNA来反转录成cDNA作为目的基因。 10.受体细胞：受体细胞是基因工程操作中用于接受体外改造后的目的基因，并可进行 扩增和生物表达的细胞。原核生物细胞是一类很好的受体细胞，容易摄取外界的DNA,增 殖快，基因组简单，便于培养和基因操作，普遍被用作cDNA文库和基因组文库的受体菌， 或者用来建立生产目的基因产物的工程菌，或者作为克隆载体的宿主。 11.报告基因：报告基因是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，其表达产物应便于 检测和定量分析，并且灵敏度高
生物技术概论 第2章 基因工程 习题与参考答案 一、名词解释 1. 基因：基因（遗传因子）是产生一条多肽链或功能 RNA 所需的全部核苷酸序列（基 因是具有一定遗传效应的 DNA 片段）。 2. 跳跃基因：跳跃基因是指能够改变自身位置的一段 DNA 序列，也叫“转座元”，可 在染色体内或不同染色体间移动，其本身可编码转座酶（transposase），也含有非蛋白编码 序列。 3. 假基因：假基因是一类看似正常却不能表达任何 RNA 或蛋白质的基因。 4. 基因工程：基因工程是指将一种或多种生物体（供体）的基因或基因组提取出来， 或者人工合成的基因，按照人们的愿望，进行严密的设计，经过体外加工重组，通过一定的 方法，转移到另一种生物体（受体）的细胞内，使之能在受体细胞遗传并获得新的遗传性状 的技术。 5. 粘性末端：粘性末端是识别位点为回文对称结构的序列经限制性内切酶切割后产生 的末端，这样形成的两个末端是相同的，也是互补的。 6. 星号活性：星号活性是指在极端非标准条件下，限制性内切酶能切割和识别相似序 列的现象。 7. 质粒载体：质粒载体是在基因工程中，人工构建的质粒并用于运载基因的载体。 8. 柯斯质粒载体：柯斯质粒载体是人工建造的含有λDNA 的 cos 序列和质粒复制子的特 殊类型的质粒载体。 9. mRNA 差异显示：mRNA 差异显示是先用 PCR 技术扩增所有的 mRNA、生成 cDNA 群体，再用测序凝胶电泳获取所需要的目的基因，然后再用 PCR 扩增获得目的基因的方法。 简单讲，就是从基因的转录产物 mRNA 来反转录成 cDNA 作为目的基因。 10. 受体细胞：受体细胞是基因工程操作中用于接受体外改造后的目的基因，并可进行 扩增和生物表达的细胞。原核生物细胞是一类很好的受体细胞，容易摄取外界的 DNA，增 殖快，基因组简单，便于培养和基因操作，普遍被用作 cDNA 文库和基因组文库的受体菌， 或者用来建立生产目的基因产物的工程菌，或者作为克隆载体的宿主。 11. 报告基因：报告基因是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，其表达产物应便于 检测和定量分析，并且灵敏度高
生物技术概论 12.感受态细胞：感受态细胞是指处于能摄取外界DNA分子的生理状态的细胞。 13.重组子：重组子是外源DNA分子正常插入载体分子后形成的重组DNA分子。 二、简要回答 1.基因概念的发展可分为几个阶段？ 从遗传学史的角度，基因概念的发展可分为四个阶段：①孟德尔的遗传因子阶段：用遗 传因子来指一种物质的单元或因子作为发育这一性状的基础。②摩尔根的基因阶段：通过果 蝇试验首次将代表某一性状的基因同某一特定的染色体联系起来，从此基因学说得以确立。 ③顺反子阶段：把基因的内部结构和DNA分子结构联系起来，认为基因就是DNA分子上 起着作用的一段核苷酸序列，不同的核苷酸序列就是不同的基因。④现代基因阶段：提出了 原核生物基因调控的操纵子模型(operon model),认为典型的操纵子模型包括若干结构基因、 操纵基因、启动基因和调节基因。这一模型赋予基因概念以新的内容，进一步说明了基因的 可分性，修正了基因是决定蛋白质的功能单位的概念，指出了基因的多样性。 2.哪些技术促进了基因工程技术的诞生？ 在技术层面上来看，伴随着限制性核酸内切酶的发现与DNA的切割、DNA连接酶的 发现与DNA片段的连接、基因运载工具一DNA载体等技术的成功使用，促进了基因工程 技术的诞生。 (I)限制性内切酶(restriction endonuclease)被称为基因工程中的“分子剪刀”，是DNA 剪切的工具。1965年提出了生物体内存在着一种具有切割基因功能的限制性内切酶，并于 1968年成功分离出I型限制性内切酶：1970年分离出了Ⅱ型限制性内切酶：同年使用Ⅱ型 限制性内切酶首次完成了对基因的切割。 (2)DNA连接酶(DNA ligase)也称DNA黏合酶，是DNA拼接的工具。DNA连接 酶主要是连接DNA片段之间的磷酸二酯键，是1967年发现的，最初从原核生物（大肠杆 菌)分离得到，现在生物基因工程主要是从T4噬菌体中分离得到的。 (3)DNA载体(vector)是把基因导入细胞的“运载工具”，它的作用是运载目的基因 进入宿主细胞，使之能得到复制和进行表达。质粒1946年被发现，历经30年的探索和研 究，1976年统一了质粒的命名原则。 3.为实现基因工程应包含哪些基本的基因操作技术？ 基因工程包含的基本基因操作技术有： (1)目的基因的获得：在基因工程设计和操作中，被用于基因重组、改变受体细胞性 状和获得预期结果或表达产物的DNA片段称为目的DNA。从生物基因组中直接分离、人
生物技术概论 12. 感受态细胞：感受态细胞是指处于能摄取外界 DNA 分子的生理状态的细胞。 13. 重组子：重组子是外源 DNA 分子正常插入载体分子后形成的重组 DNA 分子。 二、简要回答 1. 基因概念的发展可分为几个阶段？ 从遗传学史的角度，基因概念的发展可分为四个阶段：①孟德尔的遗传因子阶段：用遗 传因子来指一种物质的单元或因子作为发育这一性状的基础。②摩尔根的基因阶段：通过果 蝇试验首次将代表某一性状的基因同某一特定的染色体联系起来，从此基因学说得以确立。 ③顺反子阶段：把基因的内部结构和 DNA 分子结构联系起来，认为基因就是 DNA 分子上 起着作用的一段核苷酸序列，不同的核苷酸序列就是不同的基因。④现代基因阶段：提出了 原核生物基因调控的操纵子模型（operon model），认为典型的操纵子模型包括若干结构基因、 操纵基因、启动基因和调节基因。这一模型赋予基因概念以新的内容，进一步说明了基因的 可分性，修正了基因是决定蛋白质的功能单位的概念，指出了基因的多样性。 2. 哪些技术促进了基因工程技术的诞生？ 在技术层面上来看，伴随着限制性核酸内切酶的发现与 DNA 的切割、DNA 连接酶的 发现与 DNA 片段的连接、基因运载工具—DNA 载体等技术的成功使用，促进了基因工程 技术的诞生。 （1）限制性内切酶（restriction endonuclease）被称为基因工程中的“分子剪刀”，是 DNA 剪切的工具。1965 年提出了生物体内存在着一种具有切割基因功能的限制性内切酶，并于 1968 年成功分离出Ⅰ型限制性内切酶；1970 年分离出了Ⅱ型限制性内切酶；同年使用Ⅱ型 限制性内切酶首次完成了对基因的切割。 （2）DNA 连接酶（DNA ligase）也称 DNA 黏合酶，是 DNA 拼接的工具。DNA 连接 酶主要是连接 DNA 片段之间的磷酸二酯键，是 1967 年发现的，最初从原核生物（大肠杆 菌）分离得到，现在生物基因工程主要是从 T4 噬菌体中分离得到的。 （3）DNA 载体（vector）是把基因导入细胞的“运载工具”，它的作用是运载目的基因 进入宿主细胞，使之能得到复制和进行表达。质粒 1946 年被发现，历经 30 年的探索和研 究，1976 年统一了质粒的命名原则。 3. 为实现基因工程应包含哪些基本的基因操作技术？ 基因工程包含的基本基因操作技术有： （1）目的基因的获得：在基因工程设计和操作中，被用于基因重组、改变受体细胞性 状和获得预期结果或表达产物的 DNA 片段称为目的 DNA。从生物基因组中直接分离、人
生物技术概论 工合成、聚合酶链式反应等方法均可获得目的基因。 (2)基因表达载体的构建：就是在把目的基因导入受体细胞之前，先把含目的基因的 DNA片段与合适的克隆载体连接构成重组DNA分子。 (3)目的基因导入受体细胞：将外源重组体分子通过转化（或转染）、转导、显微注射 和电穿孔等多种不同的方式导入受体细胞。转化和转导主要适用于细菌一类的原核细胞和酵 母这样的低等真核细胞，而显微注射和电穿孔则主要应用于高等动植物的真核细胞。 (4)目的基因的检测和表达产物的鉴定：根据重组子DNA分子特征，利用小规模制 备质粒DNA进行酶切分析、PCR扩增以及探针杂交等方法检测重组质粒是否成功。如果克 隆在受体细胞中的外源基因的表达产物是蛋白质（酶）、多肽，则可通过检测表达产物，根 据基因与表达产物之间的对应关系来鉴定重组子是否转入受体细胞。其前提条件是重组子必 须含有能在受体细胞中发挥功能的表达元件，也就是说外源基因必须表达其编码产物，并且 受体细胞本身不具有这种蛋白质的功能。 三、拓展讨论 1.简述基因工程中常用三种载体的特点。 [思路提示] (1)质粒载体的特点：①双链环状：②相对分子质量很小：③自主或半自主复制：④ 不同生物质粒中的基因种类不同。 (2)噬菌体载体的特点：①具有自我复制能力：②含有多种限制内切酶的单一位点： ③具有选择性标记以区别转化与非转化细胞：④分子量较小以便DNA体外操作。 (3)柯斯质粒载体的特点：①具有，噬菌体的特性：在克隆了外源片段后可在体外被包 装成噬菌体颗粒，高效地感染对噬菌体敏感的大肠杆菌细胞：②具有质粒载体的特性：在 寄主细胞内如质粒一样进行复制：③具有高容量的克隆能力：④具有与同源序列的质粒进行 重组的能力。 2.列举四种获得目的DNA的方法并阐述其原理。 [思路提示]目前采用的方法主要有从生物基因组中直接分离法、人工合成法、聚合酶 链式反应法或mRNA差异显示法。 (1)从生物基因组中直接分离法：最常用的方法是“鸟枪法”，即用限制性内切酶将 供体细胞中的DNA切成许多片段，将这些片段分别与载体相连，然后通过载体分别转入不 同的受体细胞，让供体细胞提供的所有DNA片段分别在各个细胞中大量复制，并通过一定 的方法把目的DNA片段从细胞中分离出来。 (2)人工合成法：主要有两条途径：①以目的基因转录成的mRNA为模板，逆转录成
生物技术概论 工合成、聚合酶链式反应等方法均可获得目的基因。 （2）基因表达载体的构建：就是在把目的基因导入受体细胞之前，先把含目的基因的 DNA 片段与合适的克隆载体连接构成重组 DNA 分子。 （3）目的基因导入受体细胞：将外源重组体分子通过转化（或转染）、转导、显微注射 和电穿孔等多种不同的方式导入受体细胞。转化和转导主要适用于细菌一类的原核细胞和酵 母这样的低等真核细胞，而显微注射和电穿孔则主要应用于高等动植物的真核细胞。 （4）目的基因的检测和表达产物的鉴定：根据重组子 DNA 分子特征，利用小规模制 备质粒 DNA 进行酶切分析、PCR 扩增以及探针杂交等方法检测重组质粒是否成功。如果克 隆在受体细胞中的外源基因的表达产物是蛋白质（酶）、多肽，则可通过检测表达产物，根 据基因与表达产物之间的对应关系来鉴定重组子是否转入受体细胞。其前提条件是重组子必 须含有能在受体细胞中发挥功能的表达元件，也就是说外源基因必须表达其编码产物，并且 受体细胞本身不具有这种蛋白质的功能。 三、拓展讨论 1. 简述基因工程中常用三种载体的特点。 [思路提示] （1）质粒载体的特点：①双链环状；②相对分子质量很小；③自主或半自主复制；④ 不同生物质粒中的基因种类不同。 （2）λ噬菌体载体的特点：①具有自我复制能力；②含有多种限制内切酶的单一位点； ③具有选择性标记以区别转化与非转化细胞；④分子量较小以便 DNA 体外操作。 （3）柯斯质粒载体的特点：①具有λ噬菌体的特性：在克隆了外源片段后可在体外被包 装成噬菌体颗粒，高效地感染对λ噬菌体敏感的大肠杆菌细胞；②具有质粒载体的特性：在 寄主细胞内如质粒一样进行复制；③具有高容量的克隆能力；④具有与同源序列的质粒进行 重组的能力。 2. 列举四种获得目的 DNA 的方法并阐述其原理。 [思路提示] 目前采用的方法主要有从生物基因组中直接分离法、人工合成法、聚合酶 链式反应法或 mRNA 差异显示法。 （1）从生物基因组中直接分离法：最常用的方法是“鸟枪法”，即用限制性内切酶将 供体细胞中的 DNA 切成许多片段，将这些片段分别与载体相连，然后通过载体分别转入不 同的受体细胞，让供体细胞提供的所有 DNA 片段分别在各个细胞中大量复制，并通过一定 的方法把目的 DNA 片段从细胞中分离出来。 （2）人工合成法：主要有两条途径：①以目的基因转录成的 mRNA 为模板，逆转录成
生物技术概论 互补的单链DNA,然后在酶的作用下合成双链DNA,从而获得所需要的基因：②根据己知 的蛋白质的氨基酸序列推测出相应的RNA序列，然后按碱基互补配对原则，推测出它的 结构基因的核苷酸序列，再通过化学的方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。 (3)聚合酶链式反应法：该方法是以DNA变性、复制的某些特性为原理设计的，可 从痕量的DNA样品中特异快速扩增获得某一区域的DNA片段。 (4)mRNA差异显示法：先用PCR技术扩增所有的mRNA、生成cDNA群体，再用 测序凝胶电泳获取所需要的目的基因，然后再用PC℉扩增。简单讲，就是从基因的转录产 物mRNA来反转录成cDNA作为目的基因。 3.筛选重组子的方法有哪些，并简述其原理。 [思路提示] (1)根据载体的遗传标记基因筛选。在构建基因工程载体系统时，通常在载体DNA 分子中组装一种或两种选择标记基因在受体细胞内进行表达，使其呈现出特殊的表型或遗传 学性状，作为筛选转化子的依据。 (2)根据报告基因筛选。把报告基因的编码序列和基因表达调控序列相融合形成嵌合 基因，或与其他目的基因相融合，在调控序列的调节下进行表达，从而利用它的表达产物来 确定目的基因的表达调控，筛选转化子。 (3)根据形成的噬菌斑筛选。以DNA为载体的DNA重组分子经体外包装后转染受 体菌，转化子在固体培养基平板上被裂解形成噬菌斑，而非转化子正常生长，从而进行筛选。 4.简述基因编辑的方法有哪些。 [思路提示]基因编辑技术是一种定向改变细胞或者生物个体遗传信息的实验方法，该 技术的应用可以对生物基因组进行基因定点敲除、替换、突变及引入外源基因等人工修饰和 改造，并且修饰后的遗传信息可以通过生殖系统遗传给子代生物，使遗传的子代个体表达修 饰的性状，通过对基因修饰生物的研究帮助人类探索生命本质，揭示疾病发生之谜，寻求疾 病预防与治疗的有效方法。 常用的方法有：锌指核酸酶(zinc finger nuclease,ZFN)、类转录激活因子效应物核酸 酶(transcription activator--like effector nuclease,.TALEN)和成簇的规律间隔短回文重复序列 及相关序列9系统(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated sequences 9,CRISPR/Cas9). (复旦大学皮妍)
生物技术概论 互补的单链 DNA，然后在酶的作用下合成双链 DNA，从而获得所需要的基因；②根据已知 的蛋白质的氨基酸序列推测出相应的 mRNA 序列，然后按碱基互补配对原则，推测出它的 结构基因的核苷酸序列，再通过化学的方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。 （3）聚合酶链式反应法：该方法是以 DNA 变性、复制的某些特性为原理设计的，可 从痕量的 DNA 样品中特异快速扩增获得某一区域的 DNA 片段。 （4）mRNA 差异显示法：先用 PCR 技术扩增所有的 mRNA、生成 cDNA 群体，再用 测序凝胶电泳获取所需要的目的基因，然后再用 PCR 扩增。简单讲，就是从基因的转录产 物 mRNA 来反转录成 cDNA 作为目的基因。 3. 筛选重组子的方法有哪些，并简述其原理。 [思路提示] （1）根据载体的遗传标记基因筛选。在构建基因工程载体系统时，通常在载体 DNA 分子中组装一种或两种选择标记基因在受体细胞内进行表达，使其呈现出特殊的表型或遗传 学性状，作为筛选转化子的依据。 （2）根据报告基因筛选。把报告基因的编码序列和基因表达调控序列相融合形成嵌合 基因，或与其他目的基因相融合，在调控序列的调节下进行表达，从而利用它的表达产物来 确定目的基因的表达调控，筛选转化子。 （3）根据形成的噬菌斑筛选。以λDNA 为载体的 DNA 重组分子经体外包装后转染受 体菌，转化子在固体培养基平板上被裂解形成噬菌斑，而非转化子正常生长，从而进行筛选。 4. 简述基因编辑的方法有哪些。 [思路提示] 基因编辑技术是一种定向改变细胞或者生物个体遗传信息的实验方法，该 技术的应用可以对生物基因组进行基因定点敲除、替换、突变及引入外源基因等人工修饰和 改造，并且修饰后的遗传信息可以通过生殖系统遗传给子代生物，使遗传的子代个体表达修 饰的性状，通过对基因修饰生物的研究帮助人类探索生命本质，揭示疾病发生之谜，寻求疾 病预防与治疗的有效方法。 常用的方法有：锌指核酸酶（zinc finger nuclease，ZFN）、类转录激活因子效应物核酸 酶（transcription activator-like effector nuclease，TALEN）和成簇的规律间隔短回文重复序列 及相关序列 9 系统（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated sequences 9，CRISPR/Cas9）。 （复旦大学 皮妍）