上海交通大学 生物技术与人类论文 ANGHAI JIAO TONG UNIVERSIT wwN 院（系） 医学院 专业临床五年制 姓名 王汐蕊 学号5127179014
生物技术与人类论文 院（系） 医学院 专业 临床五年制 姓名 王汐蕊 学号 5127179014
论文 题目： 由全基因组测序揭示的复发性急性髓性白血病中的克隆演 变 背景： 大多数急性髓性白血病患者死于复发后的进行性疾病，这与细胞遗传学水平 的克隆突变有关。为了确定与复发相关的突变谱，我们测序了来自八位急性髓性 白血病患者的原发肿瘤以及复发的基因组，并且运用深度测序的方法证实了成百 上千种基因突变。这样我们得以精确定义了复发情况下的无性系形成能力以及克 隆演变的方式。除了发现急性髓性白血病相关的新型的，循环性的发生突变的基 因（比如，WAC,SMC3,DIS3,DDX41 and DAXX)之外，我们也发现了在急性髓性 白血病复发过程中的两种主要克隆演变的形式： (1)原发肿瘤中的初始克隆体积累了突变并逐步演化成为复发性克隆： (2)初始克隆中的一个亚克隆体在先期治疗中存活下来，积累了额外的附 加突变，并在复发时进一步扩大化。 在所有的病例中，我们发现，化疗无法根除初始克隆体。对于八个病例的 关于特定性复发以及原发肿瘤突变的比较，揭示了分子生物水平上颠换的增加， 可能是由于细胞毒素化疗造成的DNA损伤。这些数据证明了，急性髓性白血病的 复发与新突变的增加以及克隆演变有关，它很有计划性，并且依靠患者所接受的 化疗建立并且保持活性。 正文摘要： 为了研究基因改变与急性髓性白血病复发的关系，以及确定克隆演变是否会 导致该疾病的复发，我们进行了原发性肿瘤及复发对的全基因组测序，并与来自 八位患者皮肤细胞样本进行了比对，其中包括一位特殊的(UPN)933124患者， 他的原发性肿瘤变异在之前就被发现过。华盛顿大学医学院机构审查委员会的支 持下，我们与八位患者签订了清晰明确的知情同意协议。我们对于每一个样本， 我们都达到了>25X的单倍体覆盖率和>97g%的二倍体覆盖率。这些病人来 自于五个不同的法-英-美血液学子类型，在初次确证和复发的时间间隔为235 到961天。 候选的原发性肿瘤中的体细胞以及复发后的基因组都运用“补充信息”中 所提到的方法进行了鉴别和选择。对于来自于皮肤细胞，原发性肿瘤细胞及复发 性肿瘤细胞样本的靶向基因进行的深度测序在每个位，点得到了590番数的中值。 每一例的变异以及构象改变的平均值为539
论文 题目： 由全基因组测序揭示的复发性急性髓性白血病中的克隆演 变 背景： 大多数急性髓性白血病患者死于复发后的进行性疾病，这与细胞遗传学水平 的克隆突变有关。为了确定与复发相关的突变谱，我们测序了来自八位急性髓性 白血病患者的原发肿瘤以及复发的基因组，并且运用深度测序的方法证实了成百 上千种基因突变。这样我们得以精确定义了复发情况下的无性系形成能力以及克 隆演变的方式。除了发现急性髓性白血病相关的新型的，循环性的发生突变的基 因（比如，WAC,SMC3, DIS3,DDX41 and DAXX）之外，我们也发现了在急性髓性 白血病复发过程中的两种主要克隆演变的形式： （1）原发肿瘤中的初始克隆体积累了突变并逐步演化成为复发性克隆； （2）初始克隆中的一个亚克隆体在先期治疗中存活下来，积累了额外的附 加突变，并在复发时进一步扩大化。 在所有的病例中，我们发现，化疗无法根除初始克隆体。对于八个病例的 关于特定性复发以及原发肿瘤突变的比较，揭示了分子生物水平上颠换的增加， 可能是由于细胞毒素化疗造成的 DNA 损伤。这些数据证明了，急性髓性白血病的 复发与新突变的增加以及克隆演变有关，它很有计划性，并且依靠患者所接受的 化疗建立并且保持活性。 正文摘要： 为了研究基因改变与急性髓性白血病复发的关系，以及确定克隆演变是否会 导致该疾病的复发，我们进行了原发性肿瘤及复发对的全基因组测序，并与来自 八位患者皮肤细胞样本进行了比对，其中包括一位特殊的(UPN) 933124 患者， 他的原发性肿瘤变异在之前就被发现过。华盛顿大学医学院机构审查委员会的支 持下，我们与八位患者签订了清晰明确的知情同意协议。我们对于每一个样本， 我们都达到了﹥25×的单倍体覆盖率和﹥97 ㏒％的二倍体覆盖率。这些病人来 自于五个不同的法-英-美血液学子类型，在初次确证和复发的时间间隔为 235 到 961 天。 候选的原发性肿瘤中的体细胞以及复发后的基因组都运用“补充信息”中 所提到的方法进行了鉴别和选择。对于来自于皮肤细胞，原发性肿瘤细胞及复发 性肿瘤细胞样本的靶向基因进行的深度测序在每个位点得到了 590 番数的中值。 每一例的变异以及构象改变的平均值为 539
复发分析的总体方法都是参照第一组测序的病例(UPN933124)。总共有1到 3层的413个变异样本被测定，其中78个变异有复发特异性，5个变异点有原发 肿瘤特异性，其余330个位于原发肿瘤和复发样本之间。 所有患者都接受了阿糖胞苷和蒽环霉素的诱导治疗，并且辅助以细胞毒素 的化疗进行巩固，所有的治疗过程都可参见补充表格2以及补充信息。为了研究 治疗方法对于复发性变异类型的可能影响，我们将八位患者原发肿瘤细胞中六个 阶段的转移性或转换性变异同复发特异性变异进行了比对。 我们首先利用深度测序精确定义了病例933124急性髓性白血病基因组变 异种多变的等位基因频率，在这里我们细化并扩展了这项技术，应用于对于复发 时克隆演变的测定。对于八例原发性急性髓性白血病以及其复发对照组的分析， 清晰地展现出肿瘤亚群基本的生发状况：在所有的病例的原发性肿瘤样本中都发 现了代表原始克隆体的主导变异簇。关于白血病原发细胞与原始克隆体之间的关 系还不清晰，要建立两者之间的联系还要进行克隆体群的纯化以及功能测定。在 一半的病例中，我们观察到了原发性肿瘤亚克隆体的减少，这可能暗示着一些亚 克隆体的确因为治疗而消除。在复发时积累的一些变异可能改变急性髓性白血病 细胞的生长特性，或者导致对于附加化学疗法的抗性。不论如何，每个病例中的 肿瘤细胞在复发时都表现出了明确的克隆演变特性，以及可能由化疗引发的DNA 受损导致的较高的基因交换频率。尽管化疗被应用于急性髓性白血病病人的初始 治疗，但是我们的数据仍然说明了一个极大的可能：化疗可能在原始克隆体或者 它的亚克隆体上产生新的变异，而这样的变异经过选择以及克隆扩增后将导致疾 病的复发。这些数据说明，需要有一个标准来鉴别出导致急性髓性白血病的变异， 这样才可以研发出一些具有针对性的治疗手段，来避免细胞毒素类药物的应用， 因为这类药物本身就可能是诱导有机体突变的物质。 创新点： 1.照排胶片配对端读取运用BWA0.5.5被排列到NCB|build36 2.利用Somatic Sniper以及修订版本的SAMtools插入缺失标记调用方 识别基因突变 3.利用BreakDancer识别结构变化 4.所有预期的非重复的突变的标准正态变量，插入缺失标记以及所有的结 构变异都包含在来自Roche Nimblegen的自定义序列捕获阵列中 5.23100-bp照排胶片配对端读取在从捕获阵列中洗脱被生成 6.VarScan和一种利用Crossmatch(P.Green,unpublished data)和 BWA的读取重新映射策略被运用于确定预期的标准正态变量，插入缺失 标记以及所有的结构变异的验证状态 7.Supplementary Information中提供了有关于原料和方法的完整描述 8.所有来自八个病例的急性髓性白血病肿瘤样本的测序变体都呈递给了 dbGaP
复发分析的总体方法都是参照第一组测序的病例(UPN933124)。总共有 1 到 3 层的 413 个变异样本被测定，其中 78 个变异有复发特异性，5 个变异点有原发 肿瘤特异性，其余 330 个位于原发肿瘤和复发样本之间。 所有患者都接受了阿糖胞苷和蒽环霉素的诱导治疗，并且辅助以细胞毒素 的化疗进行巩固，所有的治疗过程都可参见补充表格 2 以及补充信息。为了研究 治疗方法对于复发性变异类型的可能影响，我们将八位患者原发肿瘤细胞中六个 阶段的转移性或转换性变异同复发特异性变异进行了比对。 我们首先利用深度测序精确定义了病例 933124 急性髓性白血病基因组变 异种多变的等位基因频率，在这里我们细化并扩展了这项技术，应用于对于复发 时克隆演变的测定。对于八例原发性急性髓性白血病以及其复发对照组的分析， 清晰地展现出肿瘤亚群基本的生发状况；在所有的病例的原发性肿瘤样本中都发 现了代表原始克隆体的主导变异簇。关于白血病原发细胞与原始克隆体之间的关 系还不清晰，要建立两者之间的联系还要进行克隆体群的纯化以及功能测定。在 一半的病例中，我们观察到了原发性肿瘤亚克隆体的减少，这可能暗示着一些亚 克隆体的确因为治疗而消除。在复发时积累的一些变异可能改变急性髓性白血病 细胞的生长特性，或者导致对于附加化学疗法的抗性。不论如何，每个病例中的 肿瘤细胞在复发时都表现出了明确的克隆演变特性，以及可能由化疗引发的 DNA 受损导致的较高的基因交换频率。尽管化疗被应用于急性髓性白血病病人的初始 治疗，但是我们的数据仍然说明了一个极大的可能：化疗可能在原始克隆体或者 它的亚克隆体上产生新的变异，而这样的变异经过选择以及克隆扩增后将导致疾 病的复发。这些数据说明，需要有一个标准来鉴别出导致急性髓性白血病的变异， 这样才可以研发出一些具有针对性的治疗手段，来避免细胞毒素类药物的应用， 因为这类药物本身就可能是诱导有机体突变的物质。 创新点： 1. 照排胶片配对端读取运用 BWA 0.5.5 被排列到 NCBI build36 2. 利用 Somatic Sniper 以及修订版本的 SAMtools 插入缺失标记调用方 识别基因突变 3. 利用 BreakDancer 识别结构变化 4. 所有预期的非重复的突变的标准正态变量，插入缺失标记以及所有的结 构变异都包含在来自 Roche Nimblegen 的自定义序列捕获阵列中 5. 23100-bp 照排胶片配对端读取在从捕获阵列中洗脱被生成 6. VarScan 和一种利用 Crossmatch (P. Green, unpublished data) 和 BWA 的读取重新映射策略被运用于确定预期的标准正态变量，插入缺失 标记以及所有的结构变异的验证状态 7. Supplementary Information 中提供了有关于原料和方法的完整描述 8. 所有来自八个病例的急性髓性白血病肿瘤样本的测序变体都呈递给了 dbGaP
感想： 这一篇论文的研究扩充了先前的研究成果，目前已经可以利用荧光标记的 分子杂交技术以及SP数组所检测到的复制数量变化来描述急性淋巴细胞白血 病病人的克隆演变形式，这项研究加强了我们对于病情发展过程中所需的基因水 平变化的了解，就像先前所描述的关于乳腺癌和胰腺癌的移位变化。研究者们运 用深度测序法得到的大量的突变提供了关于急性髓性白血病中克隆演化准确而 详尽的补充数据信息，进而，它提供了数量空前的可用于精确定义复发状态下无 性系大小以及突变演变的项目。急性淋巴细胞白血病以及急性髓性白血病在复发 时期活跃的克隆突变之后表现为相同的无性系异质性特征，包括可能与疾病复发 的致病机制相关的新突变的增加。克隆演变也可以发生在异种移植之后，说明治 疗手段本身也可以影响复发时期的克隆演变。总之，这些数据表明急性髓性白血 病细胞在复发期通常需要少量的附加突变，并且暗示其中一些突变可能会引发克 隆选择以及化疗抗性反应。在病人的个人机体中，急性髓性白血病基因组很明显 是一个“移动靶”，想要治愈这种疾病必须要对初始克隆体以及亚克隆体进行清 除
感想： 这一篇论文的研究扩充了先前的研究成果，目前已经可以利用荧光标记的 分子杂交技术以及 SNP 数组所检测到的复制数量变化来描述急性淋巴细胞白血 病病人的克隆演变形式，这项研究加强了我们对于病情发展过程中所需的基因水 平变化的了解，就像先前所描述的关于乳腺癌和胰腺癌的移位变化。研究者们运 用深度测序法得到的大量的突变提供了关于急性髓性白血病中克隆演化准确而 详尽的补充数据信息，进而，它提供了数量空前的可用于精确定义复发状态下无 性系大小以及突变演变的项目。急性淋巴细胞白血病以及急性髓性白血病在复发 时期活跃的克隆突变之后表现为相同的无性系异质性特征，包括可能与疾病复发 的致病机制相关的新突变的增加。克隆演变也可以发生在异种移植之后，说明治 疗手段本身也可以影响复发时期的克隆演变。总之，这些数据表明急性髓性白血 病细胞在复发期通常需要少量的附加突变，并且暗示其中一些突变可能会引发克 隆选择以及化疗抗性反应。在病人的个人机体中，急性髓性白血病基因组很明显 是一个“移动靶”，想要治愈这种疾病必须要对初始克隆体以及亚克隆体进行清 除